Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Селективная и постоянная окклюзия средней церебральной артерии у крыс: экспериментальный подход к изучению моторных и пространственных дефицитов памяти

199 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70519

⸱

20 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Endocrine Physiology and Metabolism Laboratory, State University of Western Paraná, 2Laboratory of Experimental Morphology, State University of Western Paraná

В этой статье

Краткое содержание

Целью этого исследования было установить воспроизводимый метод проведения краниэктомии с последующей постоянной, селективной окклюзией средней церебральной артерии у крыс для применения в экспериментальных исследованиях нарушений моторной и пространственной памяти.

Аннотация

Имея большое клиническое значение, ишемический инсульт (ИС) требует экспериментальных подходов, позволяющих разрабатывать новые адъювантные терапии. Из-за сходства анатомии сосудистых мозгов с человеком, крысы широко используются как экспериментальные модели ИС. Тем не менее, остаётся необходимость в методах, способных создать ишемическую среду, более близкую к наблюдаемой у людей, с использованием подхода, который уделяет приоритет селективной окклюзии артерий. В этом контексте целью исследования было установить воспроизводимый метод проведения краниэктомии с последующей постоянной и селективной окклюзией средней церебральной артерии (МКА) у крыс, стандартизировать модель и снизить технические сложности для применения в изучении моторных и пространственных дефицитов памяти. Крысы Вистар (N = 28) были поровну разделены на две группы: одна проходила отдельную краниэктомию (SHAM), а другая — краниэктомию, за которой следовала селективная окклюзия MCA (MCAO). В седьмой и восьмой дни послеоперационного периода проводились соответственно тест на осанку и тест на распознавание местоположения объекта. После эвтаназии были собраны образцы мозга и подготовлены гистологические срезы с окрашённым Nissl. Для демонстрации целесообразности и эффективности метода был разработан подробный хирургический протокол, включающий предоперационную подготовку, анестезию, позиционирование, краниэктомию, MCAO и закрытие. Прикладной метод продемонстрировал дефициты в группе MCAO, что подтверждается постуральным тестом (p = 0,015) и тестом памяти на распознавание местоположения объектов (p < 0,001). Гистологический анализ подтвердил селективность подхода, при этом повреждения связанных с гиппокампом областей, таких как периринальная, энторинальная и пириформная кора, помимо наружной капсулы, при этом были сохранены более глубокие структуры мозга. Этот протокол оказался воспроизводимым и эффективным методом индуцирования селективной ишемии МКА у крыс и представляет собой достоверный и технически доступный инструмент для экспериментальных исследований, изучающих патофизиологические и терапевтические механизмы при ишемическом инсульте.

Введение

Ишемическая полума, окружающая инфарктированную область при ишемическом инсульте (ИС), способна к восстановлению, если своевременное проведение лечения с целью предотвращения или смягчения нарушений моторной и памяти1. Однако такие методы, как химический тромболиз и механическая тромбэктомия, остаются слабо доступными в клинической практике для значительной частипопуляции 2, что подтверждает необходимость экспериментальных моделей для изучения более широко доступных методов лечения. Исследования на животных незаменимы благодаря их воспроизводимости и способности анализировать коллатеральноекровообращение 3, при этом крысы широко используются в моделяхIS 4. Благодаря тесной связи с человеческойИС 5 и диаметру сосуда, средняя церебральная артерия (МКА) является основным целевой сосудом в экспериментальных исследованиях окклюзииартерий 6,7,8.

Одной из наиболее широко используемых животных моделей для индуцирования церебральной ишемии является внутрисветовая окклюзия на основе нитей, за которой следуетреперфузия 9,10. Тем не менее, вариативность, связанная с точным расположением филамента внутри MCA, случайная окклюзия соседних сосудов круга Уиллиса, сопутствующие эффекты из-за наружной перевязки сонной артерии (ECA), необходимая для процедуры, и продолжительность окклюзии способствуют противоречивым результатам вмета-анализах 11,12.

В клинической среде большинство пациентов с ИС не достигают реперфузии мозга и не проявляют повреждения гипоталамуса или последствий, связанных с окклюзией ЭКА, что подчёркивает необходимость экспериментальных подходов, вызывающих селективную ишемию без последующего реперфузии. Альтернативой является постоянная окклюзия MCA (MCAO), выполняемая с помощью краниэктомии. При прямой визуализации МКА селективная окклюзия предотвращает повреждения, связанные с ЭКА, и повреждения передней хориоидальной, гипоталамоической и задней церебральнойартерий 13, что приводит к ишемическому эффекту, более похожим на тот, что наблюдается при лакунарном инфаркте.

Недавние исследования показывают, что животные модели ИС должны демонстрировать более тесную корреляцию между ишемической областью и неблагоприятными клиническимирезультатами 14,15. Разработка технических альтернатив, позволяющих целенаправленно индукциировать ишемию с минимальными осложнениями, мешающими результату, кажется наиболее подходящей стратегией. В этом контексте целью этого протокола было создать воспроизводимый метод проведения краниэктомии с последующей постоянной и селективной MCAO у крыс, с целью стандартизации модели и снижения технических сложностей для изучения дефицитов моторной и пространственной памяти. Этот подход был адаптирован из классическихисследований 16, 17, 18, 19, которые показали высокие показатели выживаемости, что позволило проводить долгосрочные оценки.

Используя нижнюю церебральную вену (ICV) в качестве анатомического ориентира, этот протокол стремится развеять техническую сложность, исторически называемую главным ограничением этого подхода, позволяя исследовать селективную церебральную ишемию как в острой, так и в хронической фазах. Были оценены моторные функции и пространственная память для подтверждения дефицитов, вызванных предложенной моделью поражения, а также проведен гистологический анализ ишемических областей мозга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол следовал рекомендациям по уходу и использованию лабораторных животных, установленным Национальным советом по контролю экспериментов на животных (CONCEA), и был одобрен Этическим комитетом по экспериментам на животных (CEUA) Государственного университета Западной Параны (UNIOESTE), протокол номер 25-23.

1. Предоперационная подготовка

  1. Подготовьте хирургические инструменты, марлю, ватные диски и расстановите стереомикроскоп (рисунок 1).
  2. Очистите хирургический стол и оборудование 70% этанолом.

2. Анестезия

  1. Индуцировать анестезию смесью кетамина (3,75 мл), ксилазина (2,5 мл) и 0,9% хлорида натрия (3,75 мл). Вводите 0,2 мл смеси на 100 г массы тела внутрибрюшинно. Подтвердите глубину анестезии с помощью защипки задней лапы или хвоста.
  2. При необходимости вводите дополнительные дозы, соответствующие одной трети максимальной дозы, чтобы избежать передозировки.
  3. Вводите профилактический антибиотик энрофлоксацин (20 мг/кг) и обезболивающий трамадолгидрохлорид (12 мг/кг) внутрибрюшинно.
  4. Измеряйте температуру прямой кишки и поддерживайте температуру тела на уровне 37°C (± 2°C) с помощью грелки на протяжении всей процедуры.

3. Позиционирование

  1. Поместите крысу в латеральный декубитус на ватный диск на стадии микроскопа (рисунок 1A). Поддерживайте голову небольшим мягким рулоном и выровняйте под углом 180°, чтобы открыть левую боковую поверхность черепа. Закрепите головку скотчем (рисунок 2A).
  2. Нанесите смазочные капли для глаз и заклейте веки скотчем.
  3. Перепроверьте ректальную температуру и при необходимости отрегулировать источник отопления.

4. Краниэктомия

  1. Проведите трихотомию между латеральной кантусом и трагусом (примерно 1,6 см × 0,5 см) с помощью мини-трихотомизатора или лезвия бритвы (рисунок 1B).
  2. Дезинфицируйте побритое место 2% хлоргексидином и 0,2% водного хлоргексидина.
  3. Сделайте кожу и подкожный разрез длиной 1 см с помощью прямых ножниц (рисунок 1C), сохраняя край 0,3 см сзади латерального кантуса и спереди от трагуса (рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Втяните этот слой щипцами Адсона (рисунок 1D) или гемостатическими щипцами.
  4. Определить и свертить среднюю височную ветвь поверхностных височных сосудов с помощью электрокоагуляции (рисунок 1E).
  5. Пальпуйте скуловую дугу с помощью более свободного лифта (рисунок 1F) и продольно разрезайте фасцию височной мышцы.
  6. Рассеките височную мышцу краниально и каудально, чтобы обнажить височную и лобную кости, а также часть мышцы массатера. Изолируйте скуловую дугу по продолю и удалите сегмент примерно 0,5 см (рисунок 2C).
    1. Меры предосторожности:
      1. Остановить кровотечение из передней глубокой височной ветви верхнечелюстных сосудов с помощью компрессии или электрокоагуляции.
      2. Избегайте задних косых порезов, чтобы предотвратить повреждение височно-нижнячелюстного сустава.
      3. Избегайте повреждения внешнеглазной слёзной железы, расположенной под дугой.
      4. Избегайте открытия орбитальной полости.
  7. Просверлите латеральную височную кость непосредственно за местом удаления скуловой дуги (рисунок 2D), используя круглый заусенец диаметром 3,5 мм с алмазным покрытием, установленный на низкоскоростном роторном моторе (рисунок 1G). Периодически поливайте с помощью 0,9% физиологического раствора для предотвращения термических повреждений. Оставьте небольшие костные фрагменты, прикреплённые к твердой мозговой мозочке (рисунок 2E), и аккуратно удалите их щипцами Халстеда (рисунок 1H).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Краниэктомия с использованием меньшего сверла является альтернативой, но она увеличивает риск повреждений дурального и мозга.

5. Окклюзия MCA (рисунок 3)

  1. Откройте твердую матер с помощью ультратонкой иглы диаметром 6 мм × 0,25 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повреждения соседних корковых сосудов.
  2. Определите нижнюю церебральную вену (ICV) ниже окна краниэктомии и пересечение MCA перпендикулярно над ней (рисунок 3A,C). Определите базальную и самую толстую ветвь MCA, расположенную в центре краниэктомического поля.
  3. Передайте непоглощаемый 8-0 полипропиленовый шов вокруг MCA с помощью тонкой игольной держательницы (рисунок 3B и рисунок 1I). Завяжите три узла, чтобы закрыть судно (рисунок 3C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Могут использоваться и другие невпитываемые швы, такие как нейлон, хлопок или шелк.
  4. Подтвердите отсутствие кровотока вниз по течению. Если есть дополнительная ветвь MCA, перевязывайте её тоже.
  5. Промывайте полость физиологическим раствором и проводите гемостаз с помощью электрокоагуляции или мягкого сжатия по мере необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте свертывания мозговой ткани, чтобы предотвратить гистологические или нейровоспалительные артефакты.

6. Закрытие

  1. По возможности приближайтесь к твердой мозговой поверхности, когда это возможно.
  2. Переосмыслить глубокий мышечный слой и зашить фасцию височной мышцы впитывающимся швом 4-0 (рисунок 3D).
  3. Закройте подкожный и кожный слои с помощью впитываемых швов 4-0 полиглактина 910 в непрерывном узоре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте оставлять открытые концы швов. Рекомендуется непрерывное накладывание швов.
  4. Очистите место операции водным хлоргексидином 0,2%.
  5. Держите животных в тепле до восстановления после наркоза. Следите за температурой перед тем, как вернуть их в клетки. Общая продолжительность хирургического вмешательства — от разреза кожи до закрывания раны — обычно составляет от 30 до 45 минут.
  6. Введите вторую профилактическую дозу антибиотика на следующий день после операции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Всего 28 самцов крыс Вистар (10–12 недель, средний вес 349 г) были случайно и поровну разделены на две группы: MCAO (подвергнут полному протоколу) и SHAM (только на стадии краниэктомии). В этом исследовании 3 животных были исключены во время операции и заменены во время операции из-за венозного кровотечения (2 MCAO) или минимального повреждения коры во время краниэктомии (1 SHAM). Ещё одно животное MCAO умерло на пятый день после операции. Общий уровень смертности модели составил 3,6%. И...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Модель MCAO у крыс используется с1975 года 16,17 как экспериментальная парадигма для церебральной ишемии и с годами совершенствовалась, демонстрируя эффективность в индуцировании неврологическихповреждений 8,22,23,24,25,26,27,28 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Эта работа была поддержана Программой поддержки аспирантов (PROAP) в рамках проекта Financial Assistance for Educational or Research Project (Финансовая помощь в области образования или исследований), номер процесса 88881.594204/2020-01, номер гранта 1359/2020. Мы благодарим профессоров, техников и студентов лабораторий физиологии, метаболизма и анатомии человека UNIOESTE (Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Каскавел, Бразилия) за техническую и академическую поддержку на протяжении всего проекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Adson toothed forcepsABC stainlessL47-P4-164Другие варианты могут быть доступны у разных компаний
Castroviejo needle holderGolgran135-3Другие варианты могут быть доступны у разных компаний
ElectrocauteryChunguang medical128Другие варианты могут быть доступны у разных компаний
Freer elevatorABC stainless47P4-819Другие варианты могут быть доступны у разных компаний
Halsted curvedABC stainlessAI1055Другие варианты могут быть доступны у разных компаний
Micro drillNail drillZS-710Другие варианты могут быть доступны у разных компаний
Mini trichotomizerKemeiKM-666Другие варианты могут быть доступны у разных компаний
ProleneEthicon 8730HШов 8-0
StereomicroscopeAlltionASM-112Другие варианты могут быть доступны у разных компаний
Straight scissorABC stainlessL23-W4Другие варианты могут быть доступны у разных компаний
Surgical compresseCremer158595Другие варианты могут быть доступны у разных компаний
Surgical gauzeCremer198669Другие варианты могут быть доступны у разных компаний
ThermometerG-TechDMT-2027Другие варианты могут быть доступны у разных компаний
VicrylEthicon VCP346HШов 4-0

Ссылки

  1. Fisher, M. The ischemic penumbra: identification, evolution and treatment concepts. Cerebrovasc Dis. 17 (1), 1-6 (2004).
  2. Tawil, S. E., Muir, K. W. Thrombolysis and thrombectomy for acute ischaemic stroke. Clin Med (Lond). 17 (2), 161-165 (2017).
  3. Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990–2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).
  4. Pontén, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjö, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. J Neurochem. 21 (5), 1127-1138 (1973).
  5. Bogousslavsky, J., Melle, G. V., Regli, F. The Lausanne Stroke Registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
  6. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema: a new experimental model of cerebral embolism in which recirculation can be introduced into the ischemic area. Jpn J Stroke. 8 (1), 1-8 (1986).
  7. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  8. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).
  9. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133, 245-261 (2017).
  10. Howells, D. W., et al. Different strokes for different folks: the rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 30, 1412-1431 (2010).
  11. Li, Y., et al. Distinctions between the Koizumi and Zea Longa methods for middle cerebral artery occlusion (MCAO) model: a systematic review and meta-analysis of rodent data. Sci Rep. 13, 10247(2023).
  12. Jin, X., et al. Determinants of outcome after endovascular middle cerebral artery occlusion in rats in the SPAN trial. Stroke. 56 (9), 2734-2747 (2025).
  13. Komatsu, T., et al. A novel model of ischemia in rats with middle cerebral artery occlusion using a microcatheter and zirconia ball under fluoroscopy. Sci Rep. 11, 12806(2021).
  14. Lyden, P. D. A multi-laboratory preclinical trial in rodents to assess treatment candidates for acute ischemic stroke. Sci Transl Med. 20 (15), eadg8656(2023).
  15. Bonkhoff, A. K., Karch, A., Weber, R., Wellmann, J., Berger, K. Female stroke: sex differences in acute treatment and early outcomes of acute ischemic stroke. Stroke. 52, 406-415 (2021).
  16. Robinson, R. G., et al. Effect of experimental cerebral infarction in rat brain on catecholamines and behavior. Nature. 255 (5506), 332-334 (1975).
  17. Robinson, R. G. Differential behavior and biochemical effects of right and left hemispheric infarction in the rat. Science. 205 (4407), 707-710 (1979).
  18. Lindemann, J., et al. Vagus nerve stimulation reduces spreading depolarization burden and cortical infarct volume in a rat model of stroke. PLoS One. 15 (7), e0236444(2020).
  19. Yang, Y., et al. Non-invasive vagus nerve stimulation reduces blood-brain barrier disruption in a rat model of ischemic stroke. Brain Stimul. 11 (4), 689-698 (2018).
  20. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1997).
  21. Bederson, J. B., et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17 (3), 472-476 (1986).
  22. Markgraf, C. G., et al. Sensorimotor and cognitive consequences of middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res. 575 (2), 238-246 (1992).
  23. Marcuzzo, S., et al. Different effects of anoxia and hind-limb immobilization on sensorimotor development and cell numbers in the somatosensory cortex in rats. Brain Dev. 32 (4), 323-331 (2010).
  24. Piazza, F. V., et al. Enriched environment prevents memory deficits in type 1 diabetic rats. Behav Brain Res. 217 (1), 16-20 (2011).
  25. Dos Santos, A. S., et al. Characterization of a cerebral palsy-like model in rats: analysis of gait pattern and of brain and spinal cord motor areas. Int J Dev Neurosci. 60, 48-55 (2017).
  26. Tamura, A., Assano, T., Sano, K., Tsumagari, T., Nakagima, A. Protection from cerebral ischemia by a new imidazole derivative (Nizofenone) and pentobarbital: a comparative study in chronic middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 10 (2), 126-134 (1979).
  27. Jiren, Z., et al. A rat model of middle cerebral artery occlusion/reperfusion without damaging the anatomical structure of cerebral vessels. J Vis Exp. (207), e66635(2024).
  28. Garcia, M. D. R., Quintanar, J. L. Acute cerebral ischemia-reperfusion model by endovascular occlusion of the middle cerebral artery in the rat: technical improvements. Biomed J Sci Tech Res. 32 (2), 24907-24911 (2020).
  29. Yang, S. H., et al. Endovascular middle cerebral artery occlusion in rats as a model for studying vascular dementia. Age (Dordr). 28 (3), 297-307 (2006).
  30. Chiang, T., Messing, R. O., Chou, W. H. Mouse model of middle cerebral artery occlusion. J Vis Exp. (48), e2761(2011).
  31. Themistoklis, K. M., et al. Transient intraluminal filament middle cerebral artery occlusion stroke model in rats: a step-by-step guide and technical considerations. World Neurosurg. 168, 43-50 (2022).
  32. Zhao, J. J., et al. The mechanisms through which auricular vagus nerve stimulation protects against cerebral ischemia/reperfusion injury. Neural Regen Res. 17 (3), 594-600 (2022).
  33. Van der Eecken, H. M. The Anastomoses between the Leptomeningeal Arteries of the Brain: Their Morphological Pathological and Clinical Significance. , CC Thomas. Springfield, IL. (1959).
  34. Symon, L., Dorsch, N. W., Crockard, H. A. The production and clinical features of a chronic stroke model in experimental primates. Stroke. 6 (5), 476-481 (1975).
  35. Coyle, P. Arterial patterns of the rat rhinencephalon and related structures. Exp Neurol. 49, 671-690 (1975).
  36. Coyle, P. Middle cerebral artery occlusion in the young rat. Stroke. 13 (6), 855-859 (1982).
  37. Yamori, Y., et al. Pathogenic similarity of stroke in stroke prone spontaneously hypertensive rats and humans. Stroke. 7 (1), 46-53 (1976).
  38. Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30 (11), 2464-2471 (1999).
  39. Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).
  40. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
  41. Morais, A., et al. Biological and procedural predictors of outcome in the Stroke Preclinical Assessment Network (SPAN) trial. Circ Res. 16 (5), 575-592 (2024).
  42. Li, Z., et al. Secondary degeneration of white matter after focal sensorimotor cortical ischemic stroke in rats. Front Neurosci. 18 (14), 611-696 (2021).
  43. Modianos, D. T., Pfaff, D. W. Brain stem and cerebellar lesions in female rats: I. Tests of posture and movement. Brain Res. 106 (1), 31-46 (1976).
  44. Bartko, S. J., Winters, B. D., Cowell, R. A., Saksida, L. M., Bussey, T. J. Perirhinal cortex is necessary for object-place associative memory. J Neurosci. 27 (10), 2548-2554 (2007).
  45. Barker, G. R. I., Warburton, E. C. When is the hippocampus involved in recognition memory. J Neurosci. 31 (29), 10721-10731 (2011).
  46. Aggleton, J. P., Nelson, A. J. D. Distributed interactive brain circuits for recognition memory. Eur J Neurosci. 51 (4), 1-17 (2020).
  47. Hales, J. B., Olivas, L., Abouchedid, D., Blaser, R. E. Contribution of the medial entorhinal cortex to performance on the traveling salesperson problem in rats. Behav Brain Res. 463, 114883(2024).
  48. Cindy, P., Agarwal, G., Bonacchi, N., Mainen, Z. F. Spatial maps in piriform cortex during olfactory navigation. Nature. 601, 595-599 (2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Селективная и постоянная окклюзия средней церебральной артерии у крыс: экспериментальный подход к изучению моторных и пространственных дефицитов памяти
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.