Методическая статья

Репрограммирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из образцов замороженных образцов шерсти Buffy

DOI:

10.3791/70522

⸱

10 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Interdisciplinary Neuroscience, University of Georgia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 4Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, 5Division of Pediatric Endocrinology, Emory University School of Medicine, 6Dysautonomia Center, New York University Langone Health, 7Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Emory University School of Medicine, 8Stem Cell Core, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University, 9Department of Cellular Biology, University of Georgia

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Текущий протокол подробно описывает шаги по устранению неполадок, вызванных индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (iPSC), полученными из периферических мононуклеарных клеток крови (PBMC) образцов пациентов, которые было сложно перепрограммировать по инструкциям производителя. Этот протокол специфичен для образцов замороженной оболочки Buffy, но может применяться и для перепрограммирования очищенных PBMC.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSC) являются ценным инструментом для моделирования заболеваний. Дальнейшие стволовые клетки могут быть перепрограммированы из взрослых соматических клеток, называемых индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (iPSC). Технология iPSC позволяет оценивать конкретных участников исследований и популяций, а также расширять направление персонализированной медицины. Кровь регулярно берётся и криоконсервируется для исследовательских целей. Эти образцы обрабатываются либо в виде buffy coats, образца крови с лейкоцитами и тромбоцитами, либо в виде периферических мононуклеарных кровяных клеток (PBMC), которые представляют собой более очищенную популяцию лейкоцитов без эозинофилов, базофилов, тромбоцитов или эритроцитов. Оба являются легко доступным и относительно неинвазивным источником перепрограммируемых соматических клеток. Несколько отчётов подробно описывают перепрограммирование из PBMC, тогда как только один описывает этот процесс из замороженных шерстяных пальто. Недавний опыт показал, что протоколы перепрограммирования PBMC, доступные в литературе и у производителей, оказались неэффективными при применении к замороженным образцам шерсти Buffy, что потребовало адаптаций и стратегий устранения неполадок, описанных здесь. Для многих исследователей, использующих технологии iPSC, крайне важно иметь подробные протоколы с высоким уровнем успеха, особенно в случаях, когда образцы пациентов содержат лишь несколько клеток, получаются с большими временными интервалами, принадлежат ограниченному пулу участников или имеют иную высокую ценность. Здесь определяются контрольные точки и стратегии устранения неполадок, чтобы увеличить вероятность перепрограммирования замороженных человеческих баффи или очищенных PBMC. В конечном итоге этот протокол позволит исследователям выявлять предикторы успеха перепрограммирования и разрабатывать альтернативные подходы для повышения шансов на успешное получение iPSC.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Технология человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) — это легко масштабируемый и возобновляемый источник человеческих клеток, который можно дифференцировать в любой тип клеток организма, позволяя исследователям изучать типы клеток и тканей, которые труднодоступны или недоступны пациентам. Кроме того, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) могут быть получены непосредственно из соматических клетокпациента 1. Это позволяет различать специфические для пациента типы клеток, что является бесценным инструментом для моделирования заболеваний и открытия лекарств. Поэтому крайне важны строгие, воспроизводимые и успешные методы перепрограммирования соматических клеток в iPSC.

Фибробласты, клетки мочи и кровяныеклетки 2,3, каждая из которых имеет свои ограничения, являются одними из самых часто используемых источников соматических клеток для получения iPSC. Фибробласты, исторически наиболее популярные дляперепрограммирования 3, получить не так просто и требуют довольно инвазивной биопсии кожи. Перепрограммируемые клетки можно получить из образцов мочи, которые легко получить и они неинвазивны, но процесс перепрограммирования должен начинаться с новых образцов до 48 часов после сбора4. Кровь является отличным источником для перепрограммируемых клеток, так как она малоинвазивна и легко доступна. Существует множество доступных протоколов перепрограммирования из периферических мононуклеарных клеток крови (PBMC), кровяных клеток с одним ядром, включая лимфоциты, моноциты и натуральныекиллеры 5. Поскольку PBMC менее плотны, чем другие кровяные клетки, их можно изолировать/очищать из свежеизолированных образцов цельной крови с помощью центрифугации с градиентомплотности 5. Альтернативно, при центрифугировании цельная кровь разделяется на три отдельных слоя: плазму, шерсть баффи и эритроциты6. Шерсть баффи содержит PBMC, тромбоциты и некоторые эритроциты. Однако PBMC менее доступны в большинстве биобанков, тогда как цельнокровные или баффи шерсти широко распространеныи доступны 7. Несмотря на наличие buffy coats в биобанках и наличие перепрограммируемых PBMC в этих образцах, очень немногие протоколы подробно описывают перепрограммирование из замороженных buffycoats 8, оставляя этот ресурс неиспользованным.

В настоящее время существует множество опубликованных протоколов1, 8, 9 и коммерчески доступных наборов10 для оптимизации перепрограммирования; Однако они не решают глубокие проблемы, как максимизировать успех донорских клеток пациентов, которые трудно перепрограммировать. Общепринято, что некоторые клетки просто не перепрограммируют, и когда это происходит, многие исследователи могут попробовать использовать другой тип донорских клеток или другого пациента. Однако для многих исследователей или пациентов это может быть неприемлемым вариантом. В отличие от ранее опубликованныхпротоколов 8,9, этот протокол включает руководство с контрольными точками и критериями, основанные на прогнозировании успеха перепрограммирования, и использует уникальный подход — очищает замороженные шерсти с помощью центрифугирования градиента плотности при размораивании.

Процесс начинается с взятия крови у выбранных особей и выделения либо PBMC, либо buffy coats. Для новых экспериментов это, скорее всего, будет включать привлечение новых доноров, которые будут проходить свежие анализы крови по одобрению IRB и с надлежащей формой согласия. Следующий этап — расширение соматических клеток, при котором замороженные кровяные клетки оттаиваются и культивируются в условиях, способствующих пролиферации гемопоэтических стволовых клеток и эритроидных предшественников — кровяных клеток, наиболее подходящих дляперепрограммирования 11. Через 10–14 дней клетки должны быть готовы к перепрограммированию, что подтверждается определённой морфологией, не обсуждаемой в предыдущих протоколах, и затем трансдуцируются путём инокуляции вирусом Сендай, несущим факторы Яманака Oct4, Sox2, c-Myc и Klf41. После трансдукции клетки начинают экспрессировать транскрипционные факторы Яманака и возвращаются в плюрипотентное состояние, опять же обозначается выраженным морфологическим изменением и пролиферацией в колонии стволовых клеток. Затем появляющиеся колонии индивидуально собираются, расширяются и криоконсервируются. После десяти пассажей характеристика с подтверждением экспрессии маркеров ствола и потенциала дифференцировки в три зародышевых слоя подтверждает успешно перепрограммированную линию iPSC.

Этот протокол лучше всего работает для криоконсервированных баффи-шерст, которые хранились < 1 месяца, или криоконсервированных PBMC, хранящихся до 2 лет с не менее чем 1 миллионом жизнеспособных клеток после оттаивания. Однако описанные контрольные точки могут помочь в устранении неполадок перепрограммирования из любого качественного образца крови. Кроме того, детали адаптации перепрограммированных iPSC к условиям без питания могут быть применимы к любому рабочему процессу перепрограммирования iPSC, независимо от исходного типа соматической ячейки.

Этот протокол, разработанный с помощью практического устранения неполадок, подробно перепрограммирует iPSC из замороженных шерсть Buffy и выявляет морфологические показатели успеха перепрограммирования, предоставляя рабочее руководство по перепрограммированию сложных сэмплов. В конечном итоге внедрение этих стратегий приводит к экономии времени, денег, реагентов и образцов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол следует руководящим принципам комитета по этике человеческих исследований Университета Джорджии. Все исследования на людях проводились в соответствии с руководящими принципами Декларации Всемирной медицинской ассоциации в Хельсинки. Согласно собственным данным, добровольцы не страдали от следующих заболеваний: муковисцидоз, хроническая обструктивная болезнь лёгких, туберкулёз, астма, диабет или острые инфекции дыхательных путей. Были привлечены добровольцы в возрасте от 18 до 50 лет и обоих полов. Беременные женщины были исключены из исследования.

1. Пальто Buffy или экстракция и криоконсервация PBMC

Критерии решения: если образцы будут храниться долго, лучше выбрать вариант 2. Если реагенты для очистки PBMC недоступны или образцы будут храниться на короткое время, вариант 1 подходит.

  1. Вариант 1: Извлечение шерсти Баффи
    1. Проведите флеботомию (пункцию вены для взятия крови) согласно лучшим практикамВОЗ 12 и возьмите 7–10 мл цельной крови в антикоагулянтные трубки для сбора крови. Храните образцы на льду.
    2. Перенесите 7–10 мл цельной крови в коническую трубку объёмом 15 мл. Спустите воду с помощью центрифуги с качающимся ведром при 200 x g в течение 15 минут при 4 °C с выключенными тормозами. Это должно состоять из трёх слоёв с жёлтой плазмой сверху, белым слоем шерсти посередине и красными эритроцитами внизу.
    3. Собирайте плазму с помощью стерильной серологической пипетки, не нарушая слой шерсти Buffy. Выбросьте плазму. Перенесите слой белой шерсти в свежую коническую трубку объёмом 15 мл (примерно 1–2 мл).
      ВНИМАНИЕ: Утилизировать плазму в соответствующий контейнер для биологических отходов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторое плазменное загрязнение шерсти баффи допустимо, так как оно помогает восстанавливаться после оттаивания.
    4. Добавьте DMSO в шерсть баффи так, чтобы итоговый состав составлял 10% DMSO v/v, и сразу же заморозьте в криовиале (1 мл/флакон) при -80 °C. На следующий день переместите флаконы в жидкий азот для длительного хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для 2 мл Buffy Coat добавьте 200 мкл DMSO, хорошо перемешайте, затем аликвот в 2 флаконы. Обычно это приводит к 1–3 замороженных флаконам на образец.
  2. Вариант 2: Очистка PBMC
    1. Проведите флеботомию (пункцию вены для забора крови) согласно лучшим практикамВОЗ 12 и возьмите 7–10 мл цельной крови в трубки с антикоагулянтным покрытием. Храните образцы на льду.
    2. Добавьте 4 мл раствора градиента плотности 1 в свежую коническую трубку объёмом 15 мл. Аккуратно нанесите 4 мл крови поверх раствора градиента плотности 1.
    3. Центрифугу с помощью качающейся центрифуги на 400 g при RT в течение 30 минут, отключая тормоза. Это приведёт к появлению плазмы в верхнем слое, PBMC — в среднем, а остальная часть крови — в нижнем слое.
    4. Соберите фракцию PBMC в свежую коническую трубку объёмом 15 мл, затем промыйте её 2–3 раза с помощью 1x PBS, центрифугировав в подвижном ведре при 350 x g при RT в течение 5 минут с включённым тормозом. Отбросьте супернатант. Чтобы пропустить криосохранение и сразу начать перепрограммирование, перейдите к шагу 2.3.4.
      ВНИМАНИЕ: Выбросьте супернатант в соответствующий контейнер для биологических отходов.
    5. Суспензировать гранулы в криоконсервационной среде (90% сыворотки и 10% DMSO) и немедленно заморозить в криовиальном (1 мл/флакон) при -80 °C. На следующий день переместите флаконы в жидкий азот для длительного хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для очистки PBMC из свежей крови могут использоваться изоляционные трубки для сбора крови вместо центрифугирования с градиентом плотности. Также возможно криоконсервирование с использованием коммерчески доступных альтернативных замораживающих сред. Типичный выход составляет 1–4 замороженных флакончика на образец.

2. Подготовка образцов для расширения соматической ячейки

  1. Подготовка медиа
    1. Подготовьте Расширяющуюся Среду (EM)9 , процитировав 45 мл EM основания. Добавьте 127,8 мкл L-аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл из 100 мМ запаса) и 450 мкл пенициллин-стрептомицина (100 раз на запасе).
    2. Приготовьте ЭМ + цитокины13 –4 мл ЭМ, добавьте 2 мкл фактора стволовых клеток (SCF) (50 нг/мл из 100 мкг/мл), 2 мкл интерлейкина-3 (ИЛ-3) (10 нг/мл из 20 мкг/мл), 16 мкл эритропоэтина (ЭПО) (2 мк/мл из 500 мкг/мл), 4 мкл инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1) (40 нг/мл из 40 мкг/мл), и 4 мкл дексаметазона (1 мкМ из 1 мМ запаса). Используйте ЭМ + цитокины в тот же день, когда препарат готовятся.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Могут использоваться альтернативные коммерческие системы расширения.
  2. Вариант 1: Очистка PBMC из замороженного пальта Баффи
    Критерии решения: если был выбран вариант 1 на шаге 1 (например, экстракция баффи-шерсти), то на шаге 2 выберите вариант 1 (то есть очистка PBMC из замороженной шерсти баффи).
    1. Возьмите раствор с градиентом плотности 2 и дайте ему достичь комнатной температуры. Тщательно перемешайте, перевернув бутылочку. Асептически переносите раствор плотности 2 с градиентом плотности 3 мл в коническую трубку объемом 15 мл.
    2. Подготовьте ещё одну коническую трубку объёмом 15 мл с 12 мл фосфатного буферного раствора Dulbecco (DPBS).
    3. Достаньте флакон с замороженной шерстью Buffy из жидкого азота. Держите на льду до размораживания. Аккуратно разморозьте образец, помешав в водяной бане при температуре 37 °C. Удаляйте, когда останется только маленький ледяной кристалл.
    4. Аккуратно (по капле) перенесите содержимое флакона в коническую трубку с DPBS. Промывайте флакон 1 мл DPBS и добавьте в коническую трубку с извлеченными клетками.
    5. Центрифугу с помощью качающейся центрифуги на 200 г при RT в течение 10 минут. Аккуратно удалите супернатант и ресуспензуйте клеточную гранулу в 4 мл DPBS с 1% плодовой бычий сывороткой (FBS).
    6. Аккуратно нанесите смесь Buffy Coat поверх раствора градиента плотности, стараясь не допустить смешивания. Центрифуга в центрифуге с поворотным ведром при давлении 800 x g в течение 20 минут на RT с выключенным тормозом.
    7. С помощью пипеты удалите и сбрасываете верхний слой плазмы, не нарушая интерфейс плазма:градиент. С помощью пипеты удалите слой PBMC на интерфейсе (рисунок 1A) и перенесите на чистую трубку объёмом 15 мл.
      ВНИМАНИЕ: Утилизируйте остальные слои в соответствующий контейнер для биологических отходов.
    8. Промыйте PBMC 3 мл EM, центрифугая при 200 x g в течение 10 минут при RT. Аккуратно удалите супернатант и снова суспензуйте гранулу в 2 мл EM + цитокины. Пластина в одной яме пластины на 12 лунках.
    9. Поставьте пластину в инкубатор при 37 °C, 5%CO2 и 20%O2.
  3. Вариант 2: Размораживание замороженных PBMC
    Критерии решения: если был выбран вариант 2 на первом шаге (то есть очистка PBMC), или если есть опасения, что замороженные шерсти Buffy будут иметь низкую жизнеспособность (то есть хранятся более месяца) (рисунок 1B), то выберите вариант 2 на шаге 2 (то есть размораживание замороженных PBMC).
    1. Подготовьте коническую трубку объёмом 15 мл с DPBS 12 мл.
    2. Извлечь флакон с замороженные PBMC из жидкого азота. Держите на льду до тех пор, пока он не будет готов к оттаиванию. Аккуратно разморозьте образец, помешав в водяной бане при температуре 37 °C. Снимайте, когда останется только маленький кристалл.
    3. Аккуратно (по каплям) переложите содержимое флакона в коническую трубку. Обязательно извлеките все клетки из флакона, промывая флакон 1 мл DPBS.
    4. Центрифуга в центрифуге с поворотным ведром при 200 г при RT на 10 минут. Аккуратно удалите супернатант и снова суспензируйте гранулу (рисунок 1C) в 2 мл EM, затем возьмите 10 мкл для проведения теста на трипан-синий исключительный тест на жизнеспособность клетки для получения количестваклеток 14.
      ВНИМАНИЕ: Выбросьте супернатант в соответствующий контейнер для биологических отходов.
    5. Пластина 1,0 x 106–2,0 x 106 клеток/мл в 2 мл EM + цитокины в одной яме 12-луночной пластины. Поставьте пластину в инкубатор при 37 °C, 5%CO2 и 20%O2.

3. Расширение соматических клеток (1 день после оттаивания)

  1. Аккуратно удалите 1 мл отходящего материала из каждой скважины. Отработанные материалы можно собрать в другую скважину или центрифугу и проверить, не терялись ли клетки.
  2. Замените отработанные материалы на 1 мл свежего EM + цитокинов.
  3. Повторяйте шаги 3.1 и 3.2 и фотографируйте PBMC через день, пока не наблюдается значительное изменение морфологии с яркими и круглыми клетками большого и малого размера (рисунок 2A, оранжевая и синяя стрелка соответственно), которые являются эритробластами — типом клеток для перепрограммирования. Это займёт около 10–14 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, не проявляющие этих морфологий, обычно без крупных круглых ячеек (рисунок 2B), вряд ли будут успешно перепрограммированы и могут быть мертвыми (рисунок 2C).

4. Трансдукция (10–14 дней после оттаивания)

  1. Подготовьте вирус Сэндай
    1. Используя специфическое значение титра, рассчитывайте объём каждого вируса, необходимого для трансдукции 2,0 × 105 клеток с помощью KOS: c-Myc: Klf4 с мультипликатностью инфекции (MOI) 5:5:3, как рекомендует производитель. Уравнение для этого расчёта можно найти в документах продукта, предоставленных производителем.
    2. Доставайте вирусы из морозилки, храните их на льду до момента, когда они оттают. Один за другим аккуратно оттаивайте вирусы, размешивая их в водяной бане при температуре 37 °C.
    3. Приготовьте аликвоты, в которых все три вируса смешиваются в нужном объёме для трансдукции 2,0 × 105 клеток при MOI 5:5:3. Заморозьте аликвоты при -80 °C до готовности к использованию.
      ВНИМАНИЕ: Обязательно тщательно отбелите все отходы, которые контактировали с вирусом Сендай.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В инструкциях производителя рекомендуется фактический подсчёт клеток с расчётом MOI для определения объёма добавленного вируса, но приближение 2,0 × 105 оказалось успешным для целей этого протокола. Алицитирование может быть более экономичным и уменьшить количество циклов замораживания и оттаивания вирусов.
  2. День трансдукции (d0)
    1. Если PBMC не были поданы накануне, удалите 1 мл отходящего материала и замените на 1 мл свежего EM + цитокинов. Разморозить вирус аликвот на льду, затем добавить прямо в колодец, закрутить медиа.
    2. Оберните пластину в парапленку и центрифугуйте её в подвижной центрифуге с ведром при 350 г при RT в течение 90 минут. Поставьте тарелку в инкубатор при 37 °C, 5%CO2 и 20%O2 на ночь.
      ВНИМАНИЕ: Обязательно тщательно отбелите все отходы, которые контактировали с вирусом Сендай.
  3. 1 день после трансдукции (d1)
    1. Соберите клетки в коническую трубку объёмом 15 мл. Хорошо прополосните 2 мл EM и проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что все клетки собраны. Центрифугные ячейки при 300 г при RT на 10 минут.
    2. Аккуратно удалите супернатант и восстановите суспензию в 2 мл EM + цитокины. Поместите в свежую пластину на 12 лунок и верните её в инкубатор при температуре 37 °C, 5%CO2 и 20%O2.
      ВНИМАНИЕ: Обязательно тщательно отбелите все отходы, контактировавшие с вирусом Сендай.

5. Перепластины трансдуцированных клеток на питательные клетки

  1. Подготовьте питающую ячейку
    1. К 43,5 мл модифицированной среды Eagle (DMEM) от Dulbecco добавьте 5 мл FBS (конечная концентрация 10%), 0,5 мл минимального раствора несущественных аминокислот (MEM-NEAA) (из 100x запаса), 50 мкл 2-меркаптоэтанола (55 мкм из 55 мкм запаса) и 0,5 мл антибиотико-антимикотика (из 100x запаса).
    2. Подготовьте пластины с желатиновым покрытием 6 колодц, добавив 600 мкл желатина (0,1% от 2% запаса) до 12 мл DPBS и распределив 2 мл на каждую скважину. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут.
    3. Достать замороженный флакон с облучёнными эмбриональными фибробластами мыши (MEF) и аккуратно разморозить, покрутив их в водяной ванне при температуре 37 °C.
    4. Добавьте по капли в коническую трубку объёмом 15 мл с 10 мл DPBS и промывайте флакон дополнительно 1 мл DPBS. Центрифугу при 200 г при RT в течение 5 минут.
    5. Аккуратно удалите супернатант и снова суспензуйте клеточную гранулу в 1 мл фибробластной среде. Удалите 10 мкл для проведения теста на исключение трипана синего на жизнеспособность клеток и получение количестваклеток 14.
    6. Удалить желатиновый раствор из пластин с 6 лунками и облучить МЭФ в 2,5 × 104 ячейки/см 2. Инкубировать в инкубаторе при 37 °C, 5%CO2 и 20%O2 в течение 6–48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Питательные клеточные пластины должны быть подготовлены перед повторением трансдуцированных клеток. Наилучшие результаты наблюдаются при инкубации облучённых MEF около 2 дней перед репликацией, но инкубация не менее 6 часов может быть достаточной.
  2. Перепластинчатые трансдуцированные клетки
    1. Приготовьте iPSC среду 90 мл DMEM/F12 с 10 мл FBS (10% конечная концентрация), 1 мл MEM-NEAA (из 100x запаса), 1 мл L-глутамина (2 мМ из запаса 200 мм), 1 мл пенициллин-стрептомицина (из 100x запаса), 100 мкл 2-меркаптоэтанола (55 мкм из 55 мм) и коэффициент роста фибробластов 100 мкл (FGF2) (10 нг/мл из 10 мкг/мл). Добавляйте L-аскорбиновую кислоту (50 мкг/мл) свежей при каждом кормлении.
    2. На третий день после трансдукции соберите все среды и клетки из трансдуцированной колодцы в коническую трубку объемом 15 мл. Хорошо прополосните не менее чем 1 мл дополнительного электромагнитного раствора и центрифугу в качающем ведре при 300 г при RT в течение 10 минут.
    3. Суспензируйте гранулу в среде iPSC 6 мл. Аспирировать среду из трёх яжек пластины с помощью облучённых MEF.
    4. Пластинчатые клетки трансдуцированы в эти три источника облучённого MEF (2 мл/скважины). Инкубировать в инкубаторе при 37 °C, 5%CO2 и 20%O2.

6. Обслуживание до появления колонии

  1. На 4, 5 и 6 дни после трансдукции ежедневно добавляйте по 1 мл свежего iPSC в каждую скважину. Это ограничивает ненужное возмущение свежепрограммированных клеток при их усадке на кормушках, одновременно обеспечивая их свежими питательными веществами.
  2. На седьмой день после трансдукции удалите весь старый носитель и замените на каждую скважину 2 мл свежего iPSC носителя. Продолжайте питаться iPSC через день, пока не начнут появляться колонии.
  3. Приготовьте hES среду 78 мл DMEM/F12 с 20 мл FBS без добавки (20%), 1 мл MEM-NEAA (100x), 1 мл L-глутамин (2 мМ из 200 мМ запаса), 1 мл пенициллин-стрептомицина (100x), 100 мкл 2-меркаптоэтанола (55 мкм из 55 мМ) и 100 мкл FGF2 (10 нг/мл из 10 мкг/мл). Добавляйте L-аскорбиновую кислоту (50 мкг/мл) свежей при каждом кормлении.
  4. Когда небольшие колонии начинают появляться, продолжайте поддерживать трансдуцированные клетки, питаясь через день hES-средой (рисунок 3A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии начинают появляться уже через 7 дней после трансдукции. Если колонии не вышли в течение трёх недель после трансдукции, маловероятно, что они когда-либо появятся.

7. Собирать колонии, когда они вырастут до большего размера (рисунок 3B)

ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда трансдуцированные клетки претерпевают морфологические изменения, которые не приводят к образованию стволовых клеток, подобных колониям (рисунок 3C). Это не считается колонией, которая могла бы привести к успешной линии iPSC.

ПРИМЕЧАНИЕ: С момента появления колонии линии iPSC должны быть адаптированы к предпочтительной лабораторной культуре hPSC. Этот протокол продемонстрирует, как линии iPSC адаптировались к условиям без питания, культивируемые на пластинах, покрытых витронектином (VTN), питаемые химически определёнными и коммерчески доступными hPSC средами. Если колонии плохо адаптируются к новым условиям, им может понадобиться более мягкий переход, например, когда их подбирают на питательные клетки с hES-средой.

  1. Подготовьте тарелки с покрытием VTN, размораживая и тщательно перемешивая VTN. Для пластины с 24 лунками подготовьте 12 мл DPBS с 120 мкл VTN (5 мкг/мл из 500 мкг/мл запаса) и распределите раствор/скважину 0,5 мл VTN. Инкубировать при комнатной температуре 1 час.
  2. Приготовьте HPSC среду, разморозив 1 бутылку добавки hPSC при 4°C на ночь. После размораивания добавьте 10 мл hPSC в одну бутылку базального материала hPSC объемом 500 мл.
  3. Подготовьте пластины к отбору, извлекая раствор VTN из скважин 24-колодцевой пластины и добавляя в каждую скважину среду 0,5 мл hPSC с 0,5 мкл Y-27632 (10 мкм с запаса 10 мм).
  4. Принесите новую пластину, шестиколодку, содержащую трансдуцированные клетки/колонии, стерильные шприцовые иглы и пипетку p200 и наконечники, к микроскопу для вскрытия в стерильных условиях.
  5. Поместите пластину с трансдуцированными клетками и появляющимися колониями на рассудочный микроскоп и используйте микроскоп, чтобы определить одну колонию для отбора. Поднимите крышку пластины, чтобы открыть колодец.
  6. Асептически откройте шприц и обнажите иглу. Под микроскопом используйте кончик иглы, чтобы отделить колонию от окружающих питательных клеток, обведя контур колонии иглой.
  7. Используйте кончик иглы, чтобы разрезать колонию на несколько одинаковых кусочков. Если части колонии ещё не отделились от пластины, используйте бок иглы, чтобы зачерпнуть или соскребать их с пластины, чтобы они плавали.
    ВНИМАНИЕ: Выбросьте иглу в соответствующий контейнер для острых предметов.
  8. С помощью p200 используйте микроскоп, чтобы переместить выбранную колонию. Аспирируйте плавающую колонию пипеткой и перенесите в колодец подготовленной пластины на 24 лунки. Постарайтесь загнать всю колонию в колодец, не получая других колоний или питательных клеток.
  9. Поставьте пластину в инкубатор при 37 °C, 5%CO2 и 20%O2.
  10. Кормите собранные колонии 1 мл hPSC-среды каждый день, пока они не соединятся.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии могут быть генетически различимы друг от друга. Каждая скважина плиты с 24 скважинами должна содержать только одну собранную колонию. Каждой выбранной колонии присваивается отдельный идентификатор, и с этого момента она рассматривается как отдельная клеточная линия от других отобранных колоний. Для тщательного перепрограммирования выберите как минимум 24 колонии и расширите и охарактеризуйте как минимум 3.

8. Расширить

  1. Техническое обслуживание hPSC
    1. Выбранные колонии готовы к разделению, когда они становятся крупными и круглыми с светящимися краями (рисунок 4A). Колонии распадаются на несколько частей при сборе. Если в одной колодце несколько колодий — разделите их, пока они не вырастут достаточно большими для контакта друг с другом и начнут различаться.
    2. Подготовьте пластину с 6 колодцями с покрытием VTN: для пластины с 6 лунками подготовьте 12 мл DPBS с 120 мкл VTN (5 мкг/мл из 500 мкг/мл запаса) и распределите 1 мл раствора/скважины. Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа. Раствор VTN можно заменить на DPBS и хранить при 37 °C, 5%CO2 в течение месяца. В скважинах, которые будут разделены, аспирировать DPBS и заменить на среду 1 мл hPSC.
    3. Аспирируйте среду из колодца для расщепления, затем прополосните один раз 1 мл DPBS. Аспирируйте DPBS и добавьте 500 мкл 0,5 мМ буфера диссоциации ЭДТА (подготовленный в 500 мл DPBS с 0,9 г NaCl и стерилизованный фильтр)15. Инкубировать при 37 °C, 5%CO2 в течение 2 минут, пока колонии не начнут расслабляться, и клетки внутри каждой колонии не скругляются и не отделяются друг от друга.
    4. Вынимите пластину из инкубатора, аспирируйте буфер диссоциации ЭДТА. С помощью пипетки p1000 собирайте клетки с средой 1 мл hPSC, аккуратно протирая вверх и вниз, пока колонии не будут полностью отделены и слегка раздроблены. Перенесите 1 мл среды и ячеек в новую 6-колодцу с 1 мл свежей среды hPSC. Это первое разделение проводится в соотношении 1:1, все ячейки из оригинальной пластины переносятся на новую пластину.
    5. Поместите клетки в инкубатор при 37 °C, 5%CO2 и 20%O2. Подкармливайте iPSC ежедневно, пока колодец не срастётся и не будет готов к разделению.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плохую морфологию стволовых клеток (рисунок 4B) можно смягчить путём корректировки протокола расщепления, например, более раннего расщепления, сокращения инкубации EDTA или корректировки коэффициента расщепления.
    6. Разверните в чашку размером 10 см.
      1. После слияния ячеек в каждой яме пластин с шестью лунками покройте чашку диаметром 10 см VTN (7 мл DPBS с 70 мкл VTN (5 мкг/мл из запаса 500 мкг/мл), инкубировать в течение 1 часа при RT).
      2. Повторяйте протокол расщепления, на этот раз расширяя из 6-колодцы в 10-сантиметровую чашу для культуры тканей (соотношение расщепления 1:1). Используйте 7–10 мл hPSC среды на 10 см тарелку.
      3. Когда клетки в 10-сантиметровой чашке соединятся, повторите этот процесс расщепления (проход). В каждом отрывке обратите внимание на номер отрывка. Коэффициент расщепления зависит от морфологии и плотности клетки. Типичное соотношение составляет 1:10, когда одна десятая ячеек из оригинальной пластины переносится на новую пластину.
  2. Заморозки и подготовка бульона
    1. После примерно трёх проходов разверните в четыре контейнера для тканевых культур диаметром 10 см для ранних напитков. Когда клетки в 10-сантиметровых тарелках сходятся, они готовы к заморозке.
    2. Приготовьте криовиалы и положите их в морозильник для охлаждения. Убедитесь, что на этикетке указана линия ячейки, клон, номер отрыва и дата заморозки.
    3. Приготовьте замораживающий материал: 90% hPSC средней и 10% DMSO, понадобится 1 мл/флакон (3 замороженных флакона на 10-сантиметровую тарелку).
    4. Проведите протокол разделения как обычно, используя буфер диссоциации EDTA объемом 4 мл 0,5 мМ для каждой тарелки диаметром 10 см.
    5. После инкубации ЭДТА аспирируйте ЭДТА. Аккуратно добавьте в блюдо 10 мл hPSC medium.
    6. Аккуратно смойте ячейки с тарелки, используя пипетом. Ячейки легко снимаются с пола тарелки и смешиваются в среде. Пипетить всего 2–5 раз, чтобы мягко расщеплять колонии, но при этом избежать диссоциации на отдельные клетки.
    7. Центрифугировать в течение 5 минут при 200 г при RT. Аспирировать наверх и снова суспензировать клеточную гранулу в замороженной среде.
    8. Изолировать и заморозить сразу при -80 °C. Переместите замороженные флаконы в резервуар с жидким азотом для длительного хранения.
    9. Заморозьте больше акций таким же образом после завершения характеристик.

9. Характеристика iPSC:

  1. Экспрессия маркеров ствола. После расширения как минимум на 10 пассажей, когда колонии в 24-колодцы будут готовы к разделению, фиксируется 4% параформальдегидом и окрашивается иммуногистохимией для маркера ствола NANOG. Потребуется как минимум 10 проходов, чтобы колонии были отрицательными на вирус Сендай (SeV), что можно подтвердить иммунофлуоресценцией (рисунок 4C).
  2. Проверьте способность плюрипотентности: Три дифференциации зародышевых слоёв. Плюрипотентность iPSC подтверждается успешной дифференциацией в каждый из трёх зародышевых слоёв. Каждая дифференцировка начинается с слияющейся 10-сантиметровой тарелки с хорошей морфологией hPSC (рисунок 4A).
    1. Эктодерма 16
      1. День перед началом дифференцировки (день 1): семена iPSC на матрично покрытых пластинах с 24 лунками плотностью 2,6 × 105 ячеек/см² в среде hPSC с Y-27632 (конечная концентрация 10 мкм) и XAV-939 (конечная концентрация 2 мкм).
      2. День 0–день 1: Подача с основанием дифференцировки 1 мл/скважина с LDN (100 нМ конечная концентрация), SB (10 мкм конечная концентрация) и XAV (2 мкм конечная концентрация).
      3. День 2–7: Кормление с основанием дифференцировки 1 мл/скважины с LDN (100 нМ конечная концентрация) и SB (10 мкм конечная концентрация). С d3 кормите через день.
      4. День 8: фиксация 4% параформальдегида и окрашивание с помощью иммуногистохимии для маркера эктодермыPAX6 17 и подтверждение потери маркера плюрипотентности NANOG (рисунок 4D).
    2. Мезодерма 18:
      1. День до начала дифференцировки (день -1): семена iPSC на матричным покрытии пластин с 24 лунками плотностью 2,5 × 105 клеток/см² в среде hPSC с Y-27632 (конечная концентрация 10 мкм).
      2. День 0: Подавать DMEM/F12 L-аскорбиновой кислотой (конечная концентрация 64 мкг/мл), селенитом натрия (конечная концентрация 13,6 нг/мл), голотрансферрином (конечная концентрация 10 мкг/мл), химически определённым липидным концентратом (100x) и CHIR (конечная концентрация 5 мкм).
      3. День 1: Подкармливайте DMEM/F12 с L-аскорбиновой кислотой (64 мкг/мл конечной концентрации), селенитом натрия (13,6 нг/мл конечной концентрации), голотрансферрином (10 мкг/мл конечной концентрации), химически определённым липидным концентратом (100x) и гепарином (0,6 U/mL конечная концентрация).
      4. День 2: Фиксация с помощью 4% параформальдегида и окрашивание с помощью иммуногистохимии для BRACHYURY-T19 и подтверждение потери маркера плюрипотентности NANOG (рисунок 4E).
    3. Эндодерма 20
      1. День перед началом дифференцировки (день -1): семена iPSC на матрично покрытых пластинах с 24 лунками плотностью 1,0 × 105 клеток/см² в среде hPSC с Y-27632 (конечная концентрация 10 мкм).
      2. День 0–день 4: На d0 промывайте с DPBS и кормите с RPMI с заместителем L-глутамина (100 раз), FBS (0,5% конечной концентрации) и Activin A (конечная концентрация 100 нг/мл). Из d0 ежедневно подавай с тех же носителей.
      3. День 5: Фиксация с помощью 4% параформальдегида и окрашивание с помощью иммуногистохимии для маркера эндодермы SOX1721 и подтверждение потери маркера плюрипотентности NANOG (рисунок 4F).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференциации проводились в соответствии с ранее опубликованными протоколами. По нашему опыту, матричные покрытия могут быть взаимозаменяемыми.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успех этого протокола можно отслеживать на разных этапах. Таблица 1 содержит сводку образцов, на которых был выполнен этот протокол. Стартовые образцы, которые представляют собой либо криоконсервированные оболочки Buffy, хранящиеся в течение недели, либо криоконсервированные PBMC, которые имеют хорошее качество образца после оттаивания и отличающиеся морфологические виды после расширения клеток, успешно перепрограммированных 6/7 раз (Таблица 1, категория 1

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Технология iPSC обладает огромным потенциалом в биомедицинской сфере в области открытия механизмов заболеваний, персонализированной медицины и «клинических испытаний в тарелке»22,23. Эффективные и адаптивные протоколы перепрограммирования iPSC из образцов крови — ключ к раскрытию огромного потенциала технологии iPSC, так как их легко собирать и они часто легко доступны в биобанках. Хотя существует множество опубликованных протоко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы заявляем, что исследование было проведено без коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Были привлечены люди и получили информированное согласие на донорство крови согласно протоколу IRB UGA# 2012-10769-06, NYU# s21-01701, Emory# 2024P008659 и Emory# 000002114. Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национального института здравоохранения под номером 5T32GM142623 Дж. Арту, R01MH115174 В. Михопулосу и R01NS114567 Н. Цельтнеру. Содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стандартные контейнеры для культуры тканей диаметром 10 смFalcon353003
12 скважинных плитFalcon353043
Конические трубки объёмом 15 млФишер7200886
24 скважинные пластиныКорнинг7200740
4% параформальдегидное решениеThermo ScientificJ19943-K2
6 скважинных плитFisher ScientificFB012927
accuSpin1RFisher Scientific75003449
Activin AБиотехне338 год от Завоевания
AF488 — осёл и альфа; козёлinvitrogenA11055
AF555 — осёл и альфа; RBTinvitrogenA31572
AF647 — осёл и альфа; minvitrogenA31571
AF647 — осёл и альфа; RBTinvitrogenA31573
Антибиотик-антимикотик (100X)Фишер15 240 096 
Серологические пипетки из полистирола из базиксаФишер14955233
14955234
14955235
14955236
Шприцы для туберкулина BDФишер14-826-87
Трубки для подготовки мононуклеарных клеток BD из стекла вакутана (CPT)Fisher Scientific02-685-125PBMC изолирующие трубки для сбора крови
BD  Пластиковые трубки для сбора крови Vacutainer с K2EDTA: закрытие HemogardFisher Scientific02-657-32Антикоагулянтные трубки для сбора крови
B-меркаптоэтанолФишер21 985 023 
Бычий желатинSigmaG1393
IgG с антителами Брахюры-Т поликлональной козыR& DAF2085
CellDrop BFDenovixCellDrop BF
Центрифуга 5702ЭппендорфEP022628102-1EA
Химически определённый липидный концентратФишерNC9022744
Chir 99021 R& D4423
CO2 инкубаторSanyoMCO-20AIC
Система хранения криоконсервацииКастомные биогенные системыV-1500AB
CryoStor CS10Технологии стволовых клеток100-1061альтернативная среда замораживания
Набор перепрограммирования CytoTune-iPS 2.0 SendaiФишерA16517
ДексаметазонSigmaD2915
DMEMФишер11965118
DMEM/F12Фишер11330057
DMSOФишерBP231-1
DPBS 1X БЕЗ CA MG ФишерMT21031CM
EDTAФишерAM9262
Эритропоэитин (ЭПО)Bio-Techne287-TC-500
Основные 6 средних предметов (E6)ФишерA1516401дифференциация, основание и bbsp;
Основные 8 носителей (E8)ФишерA1517001hPSC базальная среда
Микроскоп EVOS FLТермоAMF4300
Сыворотка плода для быкаVWR45000-734
Базовый FGF (FGF2)Биотехне233-FB/CF 
GeltrexФишерA1413202Матричное покрытие
Раствор незаменительных аминокислот Gibco MEM (100X)Фишер11140050
ГлутамаксФишер35050061заместитель L-глутамина 
ГепаринТехнологии стволовых клеток7980
Гистопак 1077Sigma10771раствор градиента плотности 1 
ГолотрансферринSigmaT0665
Фактор человеческих стволовых клеток (SCF)Peprotech300-07-100UG
Фактор роста, похожий на инсулин, 1 (IGF1)Peprotech100-11-100UG
Интерлейкин-3 (ИЛ-3)Peprotech200-03-2UG
Водяная баня Isotemp 210Fisher Scientific210
Нокаут-сыворотка-замена (KSR)Фишер10828028Бесплатная добавка FBS 
L-аскорбиновая кислотаSigmaA4544-100G
LDN193189Stemgent04-0074
L-глутаминФишер25030081
ЛимфопрепТехнологии стволовых клеток7801Раствор с градиентом плотности 2
МатригельКорнингCB-40234Матричное покрытие
Эмбриональные фибробласти мышейФишерA34964 
IgG поликлональной козы НаногаR& DAF1997-SP
Криогенные трубки Nunc Biobanking и клеточная культураFisher Scientific12-565-163N
Пенициллин/стрептомицинФишер15140122
Очищенный анти-Pax-6 антитела, поликлональный кролик IgGБиолегенда901301
QBSF-60 Среда без сывороткиКачество биологических характеристик160-204-101Электромагнитная база
Среда замораживания для восстановления клетокТермо Фишер Сайентифик12648010альтернативная среда замораживания
rhVitronectin (VTN)ФишерA31804
RPMI 1640 MediumФишер11875093
SB431542R& D1614
Вирус Сендай HN Моноклональное антитело мыши IgG2aИнвитроген14649482
Селенит натрияSigmaS5261
IgG с антителами Sox17 поликлональный козёлR& DAF1924
Добавка StemSpan для расширения эритроидаТехнологии стволовых клеток2692Альтернативное коммерческое дополнение для расширения
Medium StemSpan SFEM IIТехнологии стволовых клеток9605Альтернативная коммерческая среда расширения
Морозильник с ультранизкой температуройТермо Фишер СайентификTSX60086A
Универсальные насадки Pipette — фильтрованныеVWR76322-132
76322-134
76322-150
76322-156
XAV939Биотехне3748/10
Дигидрохлорид Y-27632BioGems1293823

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Ray, A., et al. An overview on promising somatic cell sources utilized for the efficient generation of induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 17 (6), 1954-1974 (2021).
  3. Raab, S., Klingenstein, M., Liebau, S., Linta, L. A comparative view on human somatic cell sources for ipsc generation. Stem Cells Int. 2014, 768391(2014).
  4. Sauer, V., et al. Human urinary epithelial cells as a source of engraftable hepatocyte-like cells using stem cell technology. Cell Transplant. 25 (12), 2221-2243 (2016).
  5. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 161-167 (2015).
  6. Quirynen, M., Siawasch, S. aM., Yu, J., Miron, R. J. Essential principles for blood centrifugation. Periodontol 2000. 97 (1), 43-51 (2025).
  7. Perry, J. N., Jasim, A., Hojat, A., Yong, W. H. Procurement, storage, and use of blood in biobanks. Methods Mol Biol. 1897, 89-97 (2019).
  8. Meraviglia, V., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from frozen buffy coats using non-integrating episomal plasmids. J Vis Exp. (100), e52885(2015).
  9. Yang, W., et al. iPSC reprogramming from human peripheral blood using Sendai Virus mediated gene transfer. , Stembook. Cambridge (MA). (2008).
  10. Cerneckis, J., Cai, H., Shi, Y. Induced pluripotent stem cells (ipscs): Molecular mechanisms of induction and applications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 112(2024).
  11. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  12. guidelines on drawing blood: best practices in phlebotomy. , World Health Organization. Geneva. (2010).
  13. Robb, L. Cytokine receptors and hematopoietic differentiation. Oncogene. 26 (47), 6715-6723 (2007).
  14. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3 B 1-A3 B 3 (2015).
  15. Chen, G. Splitting hESC/hiPSC lines with EDTA in feeder free conditions. , Stembook. Cambridge (MA). (2008).
  16. Zeltner, N., Lafaille, F. G., Fattahi, F., Studer, L. Feeder-free derivation of neural crest progenitor cells from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (87), e51609(2014).
  17. Zhang, X., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7 (1), 90-100 (2010).
  18. Lin, Y., Zou, J. Differentiation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in fully chemically defined conditions. STAR Protoc. 1 (1), (2020).
  19. Technau, U. Brachyury, the blastopore and the evolution of the mesoderm. Bioessays. 23 (9), 788-794 (2001).
  20. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a psc-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  21. Kanai-Azuma, M., et al. Depletion of definitive gut endoderm in sox17-null mutant mice. Development. 129 (10), 2367-2379 (2002).
  22. Kirkeby, A., Main, H., Carpenter, M. Pluripotent stem-cell-derived therapies in clinical trial: A 2025 update. Cell Stem Cell. 32 (1), 10-37 (2025).
  23. Verma, I., Seshagiri, P. B. Current applications of human pluripotent stem cells in neuroscience research and cell transplantation therapy for neurological disorders. Stem Cell Rev Rep. 21 (4), 964-987 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NANOG

Похожие статьи