Базальное дыхание почвы как метод определения влияния управления почвой и микробной активности

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол оценки базального дыхания почвы с помощью инфракрасного газоанализатора (IRGA), позволяющего контролируемый непрерывный мониторинг динамики CO₂ в почве при контролируемых условиях и воспроизводимую оценку микробной активности.

Аннотация

Дыхание почвы представляет собой перенос CO₂ из почвы в атмосферу и является одним из крупнейших наземных потоков углерода после валового первичного производства. Поскольку он в значительной степени обусловлен метаболической активностью почвенных организмов, он широко признан чувствительным индикатором биологической активности почвы, оборота углерода и воздействия экологических или управленческих нарушений. Дыхание почвы интегрирует несколько источников CO₂, включая автотрофное дыхание от корней растений и ризосферных микроорганизмов, а также гетеротрофное дыхание, связанное с микробным разложением органического вещества. При измерении при отсутствии внешних субстратов или недавних поступлений питательных веществ микробное дыхание называется базальным дыханием почвы (SBR).

В этой статье представлен протокол на основе инфракрасного газоанализатора (IRGA) для количественной оценки SBR в контролируемых лабораторных условиях. Для выделения гетеротрофного компонента, обусловленного только микробным метаболизмом, растительные потоки CO₂ исключаются с помощью предварительно кондиционированных, просеянных и гомогенизированных образцов почвы, инкубированных при стандартизированных условиях влажности и температуры, что позволяет количественно оценить накопленную эволюцию C-CO₂ со временем, обеспечивая надёжный показатель микробной биомассы, активности и здоровья почвы. Протокол включает подготовку почвы, регулировку влажности, инкубацию в герметичных флаконах, измерение CO₂ на основе IRGA и расчёт кумулятивного дыхания.

В этом исследовании мы оценивали SBR с помощью инфракрасного газоанализатора (IRGA), который позволяет отслеживать динамику CO₂ в почве при контролируемых условиях. Репрезентативные результаты показали, что добавление компоста усиливает микробное дыхание в засушливых почвах пустыни Табернас, что свидетельствует о сильном стимулировании микробных процессов после органического изменения. Эти результаты подчёркивают полезность SBR как индикатора влияния управления почвой на микробную активность, особенно в деградированных засушливых условиях. Методологически протокол, основанный на IRGA, предоставляет практический инструмент для исследований и обучения применениям, связанным с динамикой углерода в почве.

Введение

Дыхание почвы — это центральный биогеохимический процесс, охватывающий поток углекислого газа (CO₂) с поверхности почвы в атмосферу. Считается, что это второй по величине наземный поток углерода после валового первичного производства¹ и значительный вклад в глобальный углеродный^{цикл 2}. Этот процесс является ключевым для обмена углерода в наземных экосистемах и всё чаще используется как чувствительный индикатор биологической активности почвы и динамики секвестра углерода в^{почве 3,4}.

Дыхание почвы происходит из множества источников и обычно делится на два основных биологических компонента: автотрофное дыхание, возникающее от метаболизма корней растений и микроорганизмов, связанных с ризосферой, и гетеротрофное дыхание, связанное с микробным разложением органического вещества^{в почве 5,6}. Небиологические источники, такие как карбонатное^{выветривание 7} и^{фотодеградация 8}, также могут влиять на определённые условия. Чтобы выделить гетеротрофный компонент, обусловленный только микробным метаболизмом, необходимо исключить растительные потоки CO₂.

В этом контексте микробное дыхание определяется как выработка CO₂ или поглощение O₂ микроорганизмами — включая бактерии, грибы, простейших и водоросли — в результате аэробных или анаэробных метаболических^{процессов 9}. При измерении при отсутствии внешних субстратов или недавних поступлений питательных веществ микробное дыхание называется базальным^{дыханием 10}. Базальное дыхание отражает эндогенную метаболическую активность местного микробного сообщества и часто используется как показатель микробной биомассы, активности и чувствительности к экологическим или антропогенным^{нарушениям 11,12}.

Для точной оценки базального дыхания лабораторные измерения проводятся на предварительно кондиционированных, просеянных и гомогенизированных образцах почвы. Такое предварительное лечение эффективно удаляет корни и макрофауну, устраняя автотрофное дыхание и позволяя сосредоточиться на гетеротрофной микробной активности. Хотя просеивание изменяет исходную структуру почвы, оно улучшает однородность и воспроизводимость образцов, а также облегчает изучение микробных процессов в^{изоляции 9}. Инкубация обычно проводится в контролируемых условиях окружающей среды, таких как 25 °C и 60% от ёмкости почвенных полей, чтобы оптимизировать микробную активность без преимущества отдельных функциональных^{групп 13,14}. В этом контексте влажность почвы и ёмкость поля являются критически важными параметрами, поскольку микробное дыхание очень чувствительно к доступности воды, которая регулирует диффузию субстрата, приток кислорода и метаболизм микробов. По этой причине измерения базального дыхания обычно проводятся при стандартизированных условиях влажности, выражаемых в пропорции ёмкости поля. C-CO₂, эволюционировавший в течение инкубационного периода, количественно оценивается как мера базального^{дыхания 15}.

Этот протокол особенно подходит для контролируемых лабораторных инкубационных исследований, направленных на оценку микробной активности через базальное дыхание в предварительно кондиционированных почвах. Он особенно полезен для сравнения почв, подвергшихся различным методам управления, таким как органическое дополнение или другие нарушения, используя гомогенизированные образцы в условиях стандартизированных температур и влажности. Поскольку растительные выбросы CO₂ исключаются, метод наиболее подходит для оценки гетеротрофной составляющей дыхания почвы, а не общего дыхания почвы в полевых условиях.

Разработано несколько аналитических методов для количественной оценки дыхания почвы, каждая из которых отличается по чувствительности, пропускной способности и эксплуатационной^{сложности 9,16}. Классические подходы включают поглощение щелочей с последующим титрированием, проводимые системы, газовую хроматографию и анализ инфракрасных газов. Щелочные методы надёжны и относительно недороги, но обеспечивают ограниченное временное разрешение и могут зависеть от неполного поглощения или утечки CO₂. Кондуктивные методы позволяют проводить непрерывные измерения, хотя на них могут влиять температура и ионная сила. Газовая хроматография обеспечивает точную количественную оценку CO₂ и позволяет одновременно определять другие газы, но требует специализированного оборудования и обученного персонала, а пропускная способность может быть ограничена. В отличие от этого, инфракрасные газоанализаторы (IRGA) позволяют быстро и многократно отслеживать концентрацию CO₂ в контролируемых условиях инкубации, что делает их особенно полезными для временных измерений микробного дыхания. Однако измерения IRGA также требуют правильной калибровки и тщательного контроля условий инкубации для обеспечения воспроизводимости и могут подвергаться дрейфу сигнала, помехам водяного пара и сниженной надёжности при высоких концентрациях CO₂. Недавние разработки расширили доступность систем дыхания почвы на основе инфракрасного и NDIR, включая более дешёвые камерные и сенсорные платформы для лабораторных и полевых ^{приложений на 24,25}. В инкубациях с закрытыми флаконами соотношение промежутка головы к почве и интервал между измерениями следует корректировать в соответствии с ожидаемой скоростью дыхания, чтобы избежать чрезмерного накопления CO₂ во время инкубации. Недавние протоколы на базе IRGA также были опубликованы для поддержки стандартизированных лабораторных измерений дыхания почвы в контролируемых инкубационных^{условиях 26,27}, а стандартизированные методологические рекомендации по измерениям дыхания почвы также предложены в недавнем протоколе^{ФАО 28}.В этом более широком контексте базальное дыхание также может рассматриваться как один из компонентов оценки состояния почвы в долгосрочных сельскохозяйственных экспериментах. Он отражает микробную метаболическую активность и C-минерализацию, в то время как такие показатели, как CO₂-промывка, перманганатно-окисляемый углерод и органическое улавливание углерода в почве, комплементарят аспекты функционирования^{почвы 29}. В этом исследовании мы использовали метод IRGA дляколичественной оценки базальных частот дыхания из инкубированных образцов почвы. Этот метод позволяет многократно отслеживать выброс CO₂ в течение инкубационного периода, облегчая оценку метаболической активности микроорганизмов при определённых условиях влажности и термических условий. Следующий протокол описывает лабораторную процедуру, используемую для измерения базального дыхания почвы в почвах, подвергшихся различным условиям управления.

Протокол

1. Подготовка

1. Коллекция образцов:
   1. Собирайте образцы по горизонту почвы или от 0 до 10 см в случае поверхностных исследований.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте дезинфицированные инструменты и перчатки, чтобы избежать микробных загрязнений.
   2. Поместить образцы в изотермальные пакеты и транспортировать в лабораторию в холодильнике.
   3. Если предварительную обработку почвы нельзя провести немедленно, оставьте образцы при 4ºC (желательно не дольше 48 часов).
   4. Дайте образцам уравновеситься до комнатной температуры не менее 2 часов перед обработкой и инкубацией.
2. Подготовка материала и предварительная обработка почвы:
   1. Продезинфицируйте лабораторные материалы, погрузив их в 10% отбеливатель или 70% этанол на 30 минут, затем тщательно прополосните дистиллированной водой и дайте им высохнуть на воздухе перед использованием.
      ВНИМАНИЕ: При работе с этими химикатами используйте перчатки, лабораторный халат и очки.
   2. Оставьте образцы при комнатной температуре на 2 часа для стабилизации.
   3. Пробы сита до 2 мм. Избавляйтесь от корней и крупного мусора пинцетом.
   4. Очищайте сито после каждого образца растворами для дезинфекции и сушите бумажным полотенцем.
3. Определите влажность почвы (количество воды) и вместимость поля (вода, способная удерживать почву)¹⁷.
   1. Расчёт влажности почвы: Определите влажность почвы путём сушки в духовке (105ºC) 20 г образца в керамической капсуле в течение 24 часов¹⁸ [Экв. 1].
      [Экв. 1]
   2. Определите ёмкость поля с помощью аппарата с мембраной под давлением^{«Ричардса» 19}.
      1. Разместите образцы почвы поверх керамических пластин устройства, ограниченных пластиковыми кольцами.
      2. Добавьте дистилированную воду до насыщения и оставьте минимум 24 часа. Позже приложите давление −0,33 бар (−33 кПа) для других 24 часов. Затем снова определите влажность почвы согласно уравнению 1.
4. Определите плотность почвы (г·^мл-1). Наполните банку с известным объёмом просушенной в печи образцом почвы и запишите вес почвы. Плотность почвы — это соотношение веса и объёма банки.
5. Подготовка образца для инкубации:
   1. Установите температуру инкубатора на 25 °C. Стандарт UNE-EN ISO 16072:2002 (Качество почвы: лабораторные методы определения дыхания микроорганизмов, https://www.iso.org/standard/32096.html) предполагает, что температура для сопоставимости между исследованиями).
   2. Оценка условий влажности: Рассчитайте объём дистиллированной жидкости, необходимый для каждого образца, чтобы достичь 60% от вместимости поля при исходном содержании влажности^{почвы 20,21}. Это будет уровень влажности в начале эксперимента, и корректировка воды в инкубационном периоде не требуется.
   3. Выбор количества почвы: Количество используемой почвы может варьироваться в зависимости от содержания органического вещества (чем выше содержание органического вещества, тем меньше почвы требуется для эксперимента)²¹. Однако рекомендуется использовать 20 г в качестве эталонной величины.
   4. Разместите образцы в стеклянные флаконы объёмом 100 мл и добавьте дистилированную воду до 60% влаги по полевой ёмкости. Запечатайте флаконы септаумом и поместите их в инкубатор.

2. Измерения концентрации_CO2

1. Интервал измерения:
   1. Проводите измерения_CO2 с определёнными интервалами в соответствии с ожидаемой скоростью дыхания почвы, чтобы избежать чрезмерного накопления CO₂ в головке флаконов.
   2. Избегайте концентраций выше 10% (100 000 ppm), чтобы предотвратить подавление микробной активности. Сокращать интервалы измерений, если концентрации превышают этот порог. Проводите измерения ежедневно в течение первой недели и каждые 3–4 дня после этого в примере, приведённом далее.
2. Измерения концентраций CO2 (%) с помощью инфракрасного газоанализатора (IRGA)
   1. Калибруйте IRGA перед каждой сессией измерения в соответствии с инструкциями производителя или с использованием нулевого стандарта (воздух или азот без CO₂) и как минимум одного стандарта пролёта с известной концентрацией CO₂ в пределах диапазона измерений. Проверьте устойчивость прибора и корректируйте базовый дрейф в соответствии с инструкциями производителя. Записывайте параметры калибровки перед измерениями образца.
   2. В устройстве IRGA, описанном в списке материалов, иглу с одним капилляром соединят с инструментом...
   3. Вставьте неддл через перегородку в флакон, чтобы извлечь аликвот газа и зафиксировать концентрацию CO₂ (%).
   4. Повторяйте показания каждого образца до стабилизации сигнала.
3. Рекондиционирование образца
   1. Оставьте флаконы открытыми в чистом месте, защищённом от пыли и потоков воздуха (желательно в ламинарной камере потока) на полчаса после каждого измерения, чтобы обновить воздух и предотвратить анаэробные условия. Не смешивайте и не перемешивайте почву во время этого этапа аэрации.
   2. Заново запечатайте флаконы с помощью септума и верните их в инкубационную камеру.
4. Коррекция_CO2
   1. Добавьте флакон без грунта, но с теми же условиями эксплуатации, чтобы учесть заготовку.
   2. Вычитаем значения бланка к образцам, чтобы устранить_{условия CO} 2 окружающей среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при выдыхании рядом с открытыми флаконами. Это может повлиять на результаты.

3. Расчёт базального дыхания почвы (SBR)

1. Определите объём пространства в флаконе (Vhs), вычитая объём, занятый почвой (объёмная плотность) и добавленной воды из общего объёма флакона [Экв. 2].
2. Оцените объём почвы с помощью измерений плотности и рассчитывайте объём воды на основе добавленной влаги. Используйте этот скорректированный громкость в последующих вычислениях.
3. Определение объёма пространственного пространства в флаконе (Vhs): Это объём флакона минус объём почвы и содержание воды [Экв. 2].
   [Экв. 2]
4. Оценка объема CO₂ в флаконе
   1. Получите объём CO₂ в флаконе по IRGA с концентрацией_CO2 (%), учитывая эффективную голову объёма флакона [Eq 3].
      
      [Экв. 3]
5. Оценка CO₂-молей, выдыхаемых из образцов почвы:
   1. Получить CO₂ молей, выдыхаемых из образцов почвы, решая для n в уравнении закона идеального газа (P ∙ V = n ∙ R ∙ T) [Уравнение 4], после замены ранее рассчитанного V в [Eq 3].
      [Экв. 4]
6. Оценка потока CO₂ (мг C-CO₂ ^кг-1 сухая ^{почва, день 1})
   1. Необходимо добавить индивидуальные измерения %_CO2 , а окончательный поток_CO2 оценивается с использованием [экв. 5] с учетом следующих соображений: i) правильный вес образца с учётом влажности почвы; ii) учтите, что один моль_CO2 составляет 12 г C (12000 мг C).
      
      [Эквалайзер 5]
      где:
      P = давление газа внутри флакона. Это должно быть эквивалентно атмосфере (atm). Правильные значения вашего местоположения.
      Vhs = объём газового пространства в флаконе (L)
      [% CO₂ ]= концентрация_CO2 , измеренная с помощью IRGA
      R = газовая постоянная = 0,082 л·атм· K⁻¹·mol⁻¹
      T = температура инкубации в Кельвине
      сухая почва = сухая почвенная масса в кг
      t = инкубационное время в днях
      Краткий рабочий процесс протокола показан на рисунке 1.

Рисунок 1: Рабочий процесс протокола базального дыхания почвы на базе IRGA — от отбора проб и предварительной подготовки почвы до инкубации, измерения IRGA и расчётов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Результаты

Результаты, показанные в этой статье, соответствуют одному эксперименту, в котором низкоплодородные почвы были дополнены компостом для повышения фертильных параметров и микробиологической активности. Первоначальные почвы были обследованы в «пустыне Табернас» (юго-восток Испании), регионе с полузасушливым климатом и слабо развитыми^{почвами 22}. Примерно 40 кг из верхних 30 см одного сельскохозяйственного поля были взяты образцы, доставлены в лабораторию и просеяны 2 ...

Обсуждение

Дыхание почвы является чувствительным индикатором микробной активности и разложения органических веществ, предоставляя значимую информацию о влиянии управления ^{почвами 23,24}. Экспериментальный подход, описанный в этой статье, предоставляет простую и мощную основу для количественной оценки микробной активности почвы посредством измерений выбросов CO₂ в контролируемых лабораторных^{условиях 25}, и был основан и...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2 мм сито
Герметичные колбы или флаконы с септумами (100 мл)
Аналитическая весы
Извлекатель с давлением бара	Soil Moisture Equipment Corp, Goleta, CA, USA	1600F1	Для расчета полевого капитала
Деионизированная вода или стерилизованная дистиллированная вода
Инкубаторное оборудование	VWR Inc. Radnor, PA, USA	IL 250R PREMIUM
Нистираемая маркер
ИРГА измеритель концентрации СО2	Ametek Inc. Berwin, PA, USA	CheckMate 4	https://www.ametekmocon.com/products/headspacemapgasanalyzers/checkmate-4
Изотермические сумки и ящик			Для перевозки почвы в лабораторию
Лабораторная печь			Должна позволять установить 105ºC
Ламинарная камера потока	CRUMA	HZ-1	Опционально на шаге 2.3
Пробка септума для герметичного пломбирования флаконов
Образцы почвы			Собранные представительным образом из зоны, подлежащей изучению.
Стерилизующие реактивы			Можно использовать отбеливатель (10%) или этиловый спирт (70%)