Стандартизированный протокол оценки токсичности кадмия в колоректальных органоидах человека с помощью анализа жизнеспособности на основе люциферазы

Краткое содержание

Протокол направлен на установление человеческих колоректальных органоидов и оценку биолюминесцентного анализа на основе люциферазы для выявления токсичности, вызванной кадмием. Он оценивает осуществимость и чувствительность теста, количественно оценивая зависящие от дозы и времени изменения жизнеспособности органоидов.

Аннотация

Кадмий (Cd) классифицируется как канцероген первой группы и представляет собой серьёзную глобальную экологическую проблему. Целью данного исследования было создание человеческой колоректальной органоидной модели и оценка целесообразности и чувствительности биолюминесцентного анализа на основе люциферазы АТФ для обнаружения токсичных реакций колоректальных органоидов (СО) на воздействие Cd. Стволовые клетки были выделены из человеческой колоректальной ткани и культивированы в трёхмерном матриксе базальной мембраны для образования CO. Органоиды обрабатывались градуированной серией концентраций Cd для различных периодов воздействия. Реагент для люминесцентной жизнеспособности добавлялся при равном соотношении объёма, аккуратно смешивался при комнатной температуре для стимулирования лизиса и проникновения реагентов, а затем инкубировался для прохождения биолюминесцентной реакции. Люминесценция записывалась в режиме люминесценции на многорежимном микропластинном считывателе. Для расчёта половины максимальной концентрации ингибитора и оценки изменений жизнеспособности или относительной жизнеспособности использовалась кривая доза-ответ. Первичные стволовые клетки были успешно выделены из человеческой колоректальной ткани и использованы для генерации CO. Воздействие Cd приводило к снижению метаболической активности органоидов, зависящих от дозы и времени; Анализ дозы и ответа дал кривые выживаемости и значения IC50 для органоидов. Это исследование предоставляет методологические рекомендации и практические знания по использованию человеческих СО в исследованиях токсикологии тяжёлых металлов окружающей среды.

Введение

Cd — это природный тяжёлый металл, классифицируемый как канцероген первой группы и ставший глобальной экологической^{проблемой 1}. Воздействие CD происходит преимущественно через вдыхание и питание. Хотя хроническое воздействие низких доз связано с рядом негативных последствий для здоровья, существенное сокращение его использования и выбросов окружающей среды остаётся^{сложным 2,3}. Традиционные двумерные культуры растут на плоских субстратах и не имеют тканевой архитектуры, полярности клеток и микросреды опухоли. Следовательно, они обладают ограниченной способностью воспроизводить гетерогенность in vivo и подлинные токсикологические реакции на воздействие кадмия⁴. Такие системы не могут адекватно моделировать взаимодействие между клетками и клетками, матрикс-зависимый рост или биологические процессы, лежащие в основе развития лекарственной^{устойчивости 5}. Трёхмерные органоидные системы, полученные из тканей пациента, предлагают более физиологически значимую платформу по сравнению с традиционными двумерными клетковыми^{линиями 6}. Органоиды сохраняют геномные особенности, гистологическую организацию и функциональные состояния первичной ткани. Это позволяет более точно моделировать рост, эволюцию опухолей и чувствительность к токсичности кадмия, обеспечивая явные преимущества для моделирования заболеваний и токсикологических^{исследований 7}. СО обладают сложной трёхмерной архитектурой, клеточной гетерогенностью и внутренними способностями к самообновлению и самоорганизации ^8,9. Трансплантация COs в принимающих мышей может способствовать самообновлению стволовых клеток кишечника и модулировать иммунную микросреду хозяина, создавая защитный^{эффект 4}. В 2009 году Сато и др. впервые продемонстрировали, что одна взрослая кишечная стволовая клетка Lgr5⁺ может спонтанно самоорганизовываться и дифференцироваться, образуя структуры крипты–ворсинки, охватывающие все линии кишечных^{клеток 10}.

Кишечный эпителий является первой линией защиты от токсичности Cd после проглатывания. Фактически, пероральная биодоступность Cd обычно составляет менее 5%. Токсичность кишечника, вызванная CD, характеризуется нарушением межклеточных соединений, увеличением параклеточной проницаемости и индуцированием воспалительных реакций. Кроме того, Cd нарушает иммунную работу кишечника и изменяет состав и гомеостаз микробиоты^{кишечника 11}. В зависимости от дозы и продолжительности воздействия Cd может вызывать дисрегуляцию клеточного цикла, способствуя онкогенным фенотипам в одних случаях и вызывая апоптоз в других. CD может косвенно стимулировать выработку ROS (реактивных видов кислорода), вызывая окислительный стресс и редокс-дисбаланс. Функция рецепторов, киназ, фосфатаз, протеаз, адгезионных молекул и транскрипционных факторов может модулироваться с помощью редокс-сигнализации. Cd также нарушает сигнальные каскады, изменяя статус активации ERK1/2, JNK (c-Jun N-терминальная киназа) и p38 MAPK (p38-митоген-активированная протеинкиназа) на нескольких клетках^{типа 12}. Активируя ERK1/2 в каскаде MAPK, Cd способствует пролиферации и выживанию клеток, подавляет запрограммированную гибель клеток и способствует аномальной гиперпролиферации¹³. Cd может прямо или косвенно регулировать экспрессию и активность ключевых эффекторных белков. Например, он понижает уровень опухолесупрессора p53 и усиливает антиапоптотические белки, такие как Bcl-2 и Bcl-xL, что в конечном итоге нарушает апоптоз и гомеостаз^{клеточного цикла 14}.

В моделях CO, используемых для оценки цитотоксических эффектов Cd, измерение содержания АТФ широко применяется для оценки жизнеспособности органоидов. АТФ, центральная молекула энергетического метаболизма, напрямую отражает общее метаболическое состояние и жизнеспособность органоидов. При воздействии кадмия в COs Cd в первую очередь вызывает дисфункцию митохондрий, усугубляет окислительный стресс и нарушает гомеостаз органоидной энергии. Эти события в совокупности ухудшают выработку АТФ и в конечном итоге снижают жизнеспособность органоидов. Поэтому изменения уровней АТФ служат надёжным функциональным показанием цитотоксичности, вызванной кадмием. Традиционные анализы цитотоксичности включают колориметрические анализы MTT/CCK-8, окрашивание Live/Dead и анализы на основе проточной цитометрии. По сравнению с этими методами, анализы на основе АТФ обладают явными преимуществами в трёхмерных органоидных системах. Из-за структурной сложности и выраженной пространственной гетерогенности органоидов традиционные методы окрашивания и визуализации часто ограничены недостаточным проникновением тканей и сниженной количественной точностью. В отличие от этого, анализы АТФ основаны на биолюминесцентной реакции, опосредованной люциферазой, что позволяет напрямую количественную оценку без нарушения структуры органоидов. Измерение АТФ демонстрирует высокую чувствительность и широкий динамический диапазон. Это позволяет обнаруживать непрерывные биологические реакции — от раннего подавления метаболизма до гибели органоидов, обеспечивая точный анализ дозы и ответа при различных концентрациях кадмия. Уровни АТФ всесторонне отражают общее функциональное состояние органоидов, превосходя подходы, основанные на морфологической оценке или отдельных молекулярных маркерах. Следовательно, этот анализ особенно подходит для высокопроизводительного скрининга токсичности, обеспечивая повышенную стабильность и воспроизводимость.

Основной принцип, лежащий в основе использования биолюминесценции АТФ для оценки чувствительности COs к воздействию Cd, заключается в том, что люцифераза светлячков катализирует окисление D-люциферина в присутствии АТФ,^{Mg 2}⁺ и O₂ для образования оксилюциферина и испускания фотонов. Интенсивность излучаемого света пропорциональна измеряемому содержанию АТФ в образце в определённом линейном диапазоне. Таким образом, люминесценция служит косвенным количественным суррогатом клеточной метаболической активности или жизнеспособности. Органоиды встроены в внеклеточную матрицу и обладают многослойной трёхмерной структурой. Для этого реагенты для анализа АТФ оснащены оптимизированными составами и процедурами лизис-буфера. Эти оптимизации улучшают разрушение внутренних органоидных клеток, способствуют высвобождению АТФ и стабилизируют биолюминесцентный^{сигнал 15}. Важно, что биолюминесценция АТФ сообщает о метаболической активности, а не о точном количестве клеток. Например, ингибиторы митохондрий могут значительно снижать уровень АТФ в клетках за короткие промежутки, даже когда клетки остаются жизнеспособными. Напротив, некоторые ранние формы клеточной гибели могут временно сохранять относительно высокий уровень АТФ.

Несмотря на демонстрацию превосходной физиологической значимости при оценке токсичности кадмия (Cd), колоректальные органоидные модели имеют ряд практических ограничений. По сравнению с традиционными двумерными (2D) клеточными линиями, культивация органоидов занимает больше времени и требует больших затрат. Кроме того, их зависимость от матриц животного происхождения вводит вариабельность от партии к партии, что ограничивает их полезность в крупномасштабном и высокопроизводительном скрининге токсичности. Хотя эти модели весьма подходят для оценки прямого токсикологического воздействия тяжёлых металлов на кишечный эпителий, они пока не могут полностью заменить in vivo модели для оценки системной токсичности или сложных токсикокинетических процессов.

В этом исследовании человеческая колоректальная ткань использовалась в качестве исходного материала для выделения колоректальных стволовых клеток и создания СО in vitro. Органоиды подвергались воздействию Cd в различных концентрациях и с разной продолжительностью воздействия. Затем люминесценция измерялась с помощью многомодового считывателя микропластин в режиме обнаружения люминесценции. Жизнеспособность ячеек или значения IC50 были рассчитаны и визуализированы с помощью операционного программного обеспечения для конкретного считывателя микропластин.

Протокол

Эксперимент был одобрен Этическим комитетом Сучжоуского профессионального медицинского колледжа (Одобрение No SWYXLL202516) и проводился в соответствии с медицинскими этическими стандартами. Все участники этого исследования предоставили письменное информированное согласие.

1. Изоляция человеческой колоректальной ткани и установление COs

1. Транспорт и сохранение образцов тканей
   1. Перед экспериментом медленно оттаять матрицу базальной мембраны при температуре 4 °C и уравновесить необходимую культурную среду до комнатной температуры.
   2. Немедленно поместить человеческую колоректальную ткань, полученную в ходе клинических процедур, в предварительно охлаждённый раствор для сохранения тканей (2–8 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткань полностью погружена во время транспортировки. Перенесите образцы в лабораторию.
2. Под шкафом для биобезопасности поместите ткань в 6-сантиметровую чашу для осмотра. Аккуратно удаляйте видимую жировую ткань и мышечные слои с помощью скальпеля и щипцов, сохраняя эпителиальные компоненты.
3. Переместите ткань в 6-сантиметровую чашу с 3 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) с добавлением 300 мкл антибиотиков. Разрежьте ткань на фрагменты по 2 мм × 5 мм.
4. Перенесите фрагменты ткани в центрифугную трубку объёмом 50 мл.
5. Добавьте 10 мл предварительно охлаждённого PBS и 200 мкл 0,5 м EDTA (конечная концентрация ~10 мм) в трубку.
6. Поставьте трубку на шейкер при комнатной температуре и аккуратно перемешайте при 0,072 г в течение 15 минут.
7. Используйте щипцы, чтобы перенести ткань в посевную чашу и осмотреть её под микроскопом. Переходите к следующему этапу, когда структуры крипты станут видимы или начинают отделяться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда структуры крипты становятся видимыми при микроскопическом наблюдении после лечения ЭДТ, пищеварение обычно достигает достаточного уровня для изоляции крипты, и крипты начинают отделяться от расхлызанных фрагментов эпителиальной ткани. Целые крипты обычно сохраняют чётко выраженную железистую или трубчатую морфологию с заметным центральным просветом, тогда как чрезмерное пищеварение приводит к образованию большого количества диссоциированных отдельных клеток и некротических обломков.
8. Прекратить пищеварение, когда становятся видимы многочисленные целые крипты, а фрагменты тканей становятся свободными и прозрачными, что позволяет мягкому пипетированию легко освобождать крипты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Длительная инкубация ЭДТА нарушает целостность крипты, увеличивает накопление клеточного мусора и снижает жизнеспособность кишечных стволовых клеток, тем самым снижая эффективность формирования органоидов.
9. Добавьте 15 мл PBS с антибиотиками, чтобы остановить пищеварение ЭДТА. Аккуратно перемешивайте.
10. Центрифугуйте образец при 300 × г в течение 3 минут при 4 °C.
11. Удалите супернатант.
12. Добавьте 1 мл полной ячеточной среды и перенесите суспензию в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
13. Центрифугуйте подвеску при 300 × г на 3 минуты и уберите супернатант.
14. Добавьте 500 мкл матрици базальной мембраны в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл и хорошо перемешайте.
15. Минимизировать воздействие комнатной температуры во время смешивания и держать матрицу базальной мембраны на льду, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание.
16. Добавьте 25 мкл смеси по капле в каждую яме пластины на 24 лунки, чтобы получить каплю.
17. Переверните пластину с 24 лунками и инкубуйте её при 37 °C с 5% CO₂ в течение 20 минут.
18. Добавьте в каждую скважину 600 мкл среды с CO.
19. Получите колоректально-органоидную культурную среду и реагенты для диссоциации из коммерческих источников и используйте их строго в соответствии с инструкциями производителя.
20. Для подготовки полной среды для клеточной культуры добавьте 500 мл базальной среды DMEM 50 мл плодовой бычьей сыворотки (FBS) и 5 мл пенициллин-стрептомицина. Тщательно перемешайте раствор мягкой инверсией.

2. Анализ чувствительности CO, подвергшихся воздействию Cd

1. Покрытие и культивирование COs в пластинах с 96 скважинами
   1. Выбросьте культурную среду из каждой скважины и добавьте 500 мкл раствора для диссоциации органоидов. Аккуратно пипетуйте вверх и вниз, чтобы рассеять матрицу базальной мембраны.
   2. Поместите обработанную тарелку в инкубатор с содержанием CO₂ при температуре 37 °C, 5% CO₂ для пищеварения, с начальным временем переваривания 10 минут.
   3. Соберите раствор для расщепления из каждой скважины 24-луночной пластины в центрифугную трубку объемом 15 мл и добавьте 10 мл полной среды для клеточной культуры.
   4. Центрифугу при 300 × г в течение 3 минут, чтобы собрать органоид и выбросить супернатант.
   5. Добавьте 1 мл полного клеточного культурного материала, тщательно перемешайте с помощью пипетирования и переведите суспензию в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл.
   6. Центрифугу при 300 × г в течение 3 минут, затем сбросьте супернатант.
   7. Добавьте 100 мкл матрицы базальной мембраны и тщательно перемешайте с помощью пипетирования.
   8. Распределить органоиды и оценить количество отдельных клеток под микроскопом перед посадкой примерно 3 000–5 000 отдельных клеток на колодцу.
   9. Поддерживать относительно стабильную плотность посева во всех экспериментальных группах для обеспечения воспроизводимого роста органоидов и экспериментальных результатов.
   10. Корректируйте диапазон посева на основе микроскопической оценки после диссоциации органоидов и ранее описанных состояний, часто используемых в исследованиях органоидной культуры.
   11. Добавьте 6 мкл смеси в центр каждой колодцы пластины на 96 лунок. Всего используйте 30 скважин, с тремя техническими репликами.
   12. Инвертируйте пластину и инкубируем её при 37 °C в инкубаторе с 5% CO₂ в течение 15 минут.
   13. Добавьте 100 мкл органоидной культурной среды в каждую скважину пластины с 96 лунками.
   14. Начните обработку кадмием ровно через 7 дней после посева.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Этот 7-дневный период культуры позволяет отдельным клеткам полностью развиваться в структурно целостные CO.
2. Разбавление концентрации CD
   1. Растворите 3,67 мг порошка хлорида кадмия в 2 мл стерильной сверхчистой воды, чтобы получить 10 мл стандартного раствора с итоговым объёмом 2 мл.
   2. Стерилизуйте 2 мл раствора кадмия 10 мм, пропустив его через фильтр 0,22 мкм.
   3. Стерилизованный раствор кадмия наливайте в центрифугные трубки объёмом 1,5 мл и храните их при 4 °C, защищённых от света.
   4. На протяжении всего эксперимента носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат, защитные перчатки и защитные очки.
   5. Выполняйте все связанные операции внутри вытяжной вытяжки, чтобы минимизировать риски воздействия.
   6. Классифицировать и управлять всеми отходами, содержащими CD, включая культурные среды с кадмий, наконечники пипеток, центрифугные трубки и посевные чашки, как опасные химические отходы.
   7. Выбрасывайте эти материалы в специальные контейнеры для сбора жидких или твердых металлов.
   8. Утилизировать все отходы строго в соответствии с институциональными нормами и местными экологическими нормами.
   9. Никогда не относитесь к отходам CD как к обычному лабораторному мусору и не высыпайте их в раковину.
   10. Пометьте крышку пластины с 24 лунками как 4, 3, 2, 1 и 0.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте органоиды Cd при конечных концентрациях 40 мкм, 20 мкм, 10 мкм, 5 мкм и 0 мкм. Разбавление кадмийского раствора рассчитывалось по стандартной формуле:
               C₁ V₁ = C₂ V₂
3. Чтобы получить 4 мл рабочей концентрации 20 мкм, добавьте 8 мкл из 10 мМ стандартного раствора к 3992 мкл полной культурной среды. Тщательно перемешайте раствор, чтобы обеспечить равномерное распределение.
   1. Добавьте 1,4 мл культурной среды в колодец с меткой 4 и 700 мкл культурного материала в каждый из оставшихся колодцев.
   2. Удалите 5,6 мкл культурной среды из колодца, помеченного как 4, и добавьте 5,6 мкл кадмийского раствора. Тщательно перемешайте.
   3. Перенесите 700 мкл раствора из колодца, отмеченной как '4', в колодец с маркировкой '3' и тщательно перемешайте.
   4. Повторяйте процесс переноса и смешивания из каждой ямы в следующую с меньшим номером (от '3' до '2', '2' до '1' и '1' до '0'), тщательно перемешивая на каждом этапе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не выполняйте никаких операций в яме с пометкой 0.
   5. Удалите пластину с 96 лунками из инкубатора и выбросьте существующую культурную среду.
   6. Обозначите крышку пластины с 96 лунками слева направо как 40 мкм, 20 мкм, 10 мкм, 5 мкм и 0 мкм.
   7. Добавьте 100 мкл кадмийсодержащей культурной среды в каждую соответствующую маркированную яму.
   8. Поставьте тарелку в инкубатор.

3. Добавление люминесцентного реагента жизнеспособности

1. Удалите люминесцентный реагент жизнеспособности из морозильника с температурой −20 °C и дайте ему оттаять при комнатной температуре. Добавьте люминесцентный реагент жизнеспособности в объёмном соотношении 1:1.
2. Добавьте 2,5 мл люминесцентного реагента для жизнеспособности в резервуар одноразового реагента.
3. Добавьте 2,5 мл колоректально-органоидной культурной среды и тщательно перемешайте с помощью пипетирования.
4. Используйте систему аспирации отходов для удаления органоидной культурной среды из каждой скважины пластины с 96 лунками. Избегайте аспирирования матрицы базальной мембраны из скважин.
5. Пересадите 200 мкл раствора из резервуара одноразового реагента в каждую скважину плиты с 96 скважинами, содержащие CO, и тщательно перемешайте с помощью интенсивного пипетирования. Избегайте появления пузырьков воздуха во время пипетирования.
6. Инкубировать тарелку при комнатной температуре в течение 25 минут. Инкубировать при комнатной температуре, защищённой от света.

4. Измерение люминесцентной жизнеспособности реагента

1. Откройте операционное программное обеспечение для конкретного считывателя микропластин (дополнительный рисунок 1A).
2. Нажмите «Читать сейчас» (дополнительный рисунок 1B).
3. Нажмите «Новое» (дополнительная рисунок 1B).
4. Нажмите «Чтение» (дополнительный рисунок 1C).
5. Выберите люминесценцию (дополнительный рисунок 1D).
6. Выберите люминесцентное волокно (дополнительный рисунок 1D).
7. Нажмите OK (дополнительная рисунок 1D).
8. Выберите полную тарелку (дополнительный рисунок 1E).
9. Нажмите «Очистить всё» (дополнительная рисунок 1F).
10. Выберите соответствующие позиции на целевой плите с 96 колодцами, всего 15 скважин (дополнительный рисунок 1G).
11. Нажмите OK (дополнительная рисунок 1G).
12. Вставьте 96-ядровую пластину в прибор (дополнительная рисунок 1H).
13. Выберите использовать крышку (дополнительный рисунок 1I).
14. Нажмите OK, чтобы начать измерение (дополнительный рисунок 1I).
15. После завершения измерения нажмите «Экспорт», чтобы экспортировать данные в Excel (дополнительный рисунок 1J).

5. Обработка и анализ данных

1. Открытое программное обеспечение для анализа статистических данных, способное к нелинейной регрессии. (Дополнительный рисунок 2A).
2. Выберите таблицу данных XY (дополнительный рисунок 2A).
3. Установить x в числа (дополнительный рисунок 2A).
4. Установите Y на ввод значений реплицирования в соседних подстолбцах и введите 3 репликации (дополнительный рисунок 2A).
5. Введите данные (дополнительный рисунок 2B).
6. Клик-анализ (дополнительный рисунок 2C).
7. Click XY анализы (дополнительный рисунок 2D).
8. Нажмите «Нелинейная регрессия (подгонка кривой) (дополнительный рисунок 2D).
9. Нажмите OK. (Дополнительный рисунок 2D).
10. Выберите Доза–ответ – Торможение (дополнительный рисунок 2E).
11. Выберите лог (ингибитор) против нормализованного ответа — переменный наклон (дополнительный рисунок 2E).
12. Нажмите OK для запуска анализа (дополнительный рисунок 2E).
13. Нажмите Файл (дополнительный рисунок 2F).
14. Нажмите «Экспорт» (дополнительный рисунок 2F).
15. Нажмите OK (дополнительный рисунок 2G).

Результаты

Создание человеческих командиров
Мы успешно изолировали структуры колоректальных крипт из образцов тканей, и типичная морфология крипты была чётко наблюдана как при микроскопии с низким, так и при высоком увеличении. Во время экстракорпоральной культуры изолированные крипты постепенно расширялись и демонстрировали упорядоченный процесс морфологического созревания (рисунок 1A,B). К третьему и 6-му дню культуры сформировались структурно целые колоректальные органоиды, преимущественно демонстрирующие сферические или раннепородные структуры (рисунок 1C,D).

Чувствительность COs к воздействию Cd
COs были засеяны в пластины с 96 скважинами и культивировались ещё 5 дней, после чего обработаны кадмием в концентрациях 0, 5, 10, 20 и 40 мкм. После 72 часов воздействия был проведён люминесцентный анализ на основе АТФ для измерения относительных люминесцентных единиц (RLU), данные были проанализированы и визуализированы. Результаты показали значительное снижение жизнеспособности органоидов в зависимости от дозы при увеличении концентрации кадмия (рисунок 2A). CO, подвергшиеся воздействию кадмия 10 мкм, 20 мкм и 40 мкм кадмия, демонстрировали заметно сниженные значения RLU (см. рисунок 2B). Мы не наблюдали значимой токсичности у колоректальных органоидов, подвергшихся воздействию 5 мкм Cd. В соответствии с данными о жизнеспособности, морфологический анализ выявил выраженные структурные изменения в колоректальных органоидах, обработанных кадмием, включая уменьшение размера органоидов, серьёзное нарушение эпителиальной архитектуры и прогрессирующую структурную фрагментацию (рисунок 2C). Эти данные свидетельствуют о том, что колоректальные органоиды крайне чувствительны к цитотоксичности, вызванной кадмием.

Рисунок 1: Изоляция человеческих колоректальных крипт и установление колоректальных органоидных культур. (A) Репрезентативное изображение изолированных человеческих колоректальных крипт. (10×). (B) Изображение с большим увеличением одной крипты (20×). (C) Репрезентативное изображение командиров после 3 дней в культуре (4×). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Цитотоксические и морфологические изменения COs, вызванные Cd. (A) Относительная кривая доза-ответ CO, подвергшихся различным концентрациям Cd. Ось x обозначает концентрации Cd, а ось y — относительную жизнеспособность органоидов. (B) Относительные значения RLU COs после обработки с различными концентрациями Cd. Ось X представляет концентрации Cd, а ось Y — относительные значения RLU. Односторонний ANOVA *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. (C) Репрезентативные яркополевые изображения необработанных (0 мкм) и обработанных с Cd COs при 5 мкм, 10 мкм, 20 мкМ, 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Детальный 16-шаговый рабочий процесс обнаружения RLU с использованием операционного программного обеспечения для конкретного считывателя микропластин .(A) Иконка программного обеспечения. (B) Интерфейс запуска программного обеспечения. (C) Меню настроек. (D) Интерфейс выбора анализа. (E) Меню настройки раскладки тарелки. (F) Стандартная раскладка номерного знака. (G) Настройте расположение скважин в соответствии с экспериментальной схемой пластин. (H) Загружаю микропластину. (I) Прибор запускает измерение RLU. (J) Экспорт данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: После экспорта данных обработка данных и статистический анализ выполняются в программном обеспечении для анализа статистических данных. (A) Главный экран. (B) Таблица ввода данных. (C) Аналитический диалог. (D) Меню параметров анализа. (E) Меню конфигурации для нелинейной регрессии. (F) Меню опций файлов. (G) Диалог экспорта данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Это исследование устанавливает стандартизированный протокол для анализа жизнеспособности кадмия и АТФ с использованием COs для оценки влияния кадмия на жизнеспособность органоидов. Этот протокол специально оптимизирует этапы диссоциации органоидов и 96-колодцевого покрытия для повышения экспериментальной воспроизводимости и стабильности последующих показаний анализов АТФ. Хотя текущий экспериментальный протокол в основном сосредоточен на создании 3D-модели органоидов колоректального рака для оценки токсичности Cd, обширные исследования показали, что традиционные двумерные клеточные культуры и 3D-модели органоидов существенно различаются по ответам на лекарства, взаимодействию между клетками, архитектуре тканей и токсикологических профилях. По сравнению с двумерными монослоями, органоиды более точно воспроизводят пространственную архитектуру, клеточную гетерогенность и микроокружение, похожее на in vivo, опухоли, что обеспечивает превосходную физиологическую значимость. Из-за отсутствия сложных взаимодействий между клетками и клеточно-внеклеточным матриксом (ECM) реакция двумерных культур на воздействие тяжёлых металлов может не точно отражать подлинные in vivo^{токсикологические процессы 16}. Напротив, модель CO, установленная в этом исследовании, эффективно моделирует трёхмерную динамику роста опухолевых тканей, предоставляя высоко физиологически значимую платформу для оценки токсичности, вызванной Cd.

Во время передачи органоидов время диссоциации строго поддерживалось примерно на уровне 10 минут. Эта оптимизация предотвращает неполную диссоциацию, что приводит к чрезмерно большим агрегатам клеток, а также предотвращает чрезмерную диссоциацию, которая приводит к чрезмерному числу отдельных клеток. Точно контролируя степень диссоциации, мы добились относительно однородных органоидных структур, что повысило согласованность последующих фармакологических методов лечения и тестов жизнеспособности АТФ.

Мы применили высокопроизводительную систему культурирования из 96 колодец и стандартизировали объём матрицы базальных мембран до 6 мкл на скважину. Эта стандартизация минимизирует изменчивость между скважинами, обеспечивая единообразную плотность и характеристики роста органоидов во всех скважинах, что в конечном итоге повышает воспроизводимость экспериментов и сопоставимость данных. Объединяя анализы люминесценции АТФ с анализом кривой доза-отклик с использованием программного обеспечения для статистического анализа данных, мы получили надёжную количественную оценку изменений жизнеспособности органоидов после воздействия Cd. В совокупности это исследование устанавливает высоковоспроизводимый экспериментальный протокол применения органоидных моделей в экологической токсикологии и воздействии тяжелых металлов.

Во время культуры COs тщательное смешивание гранулы крипты с матрицей базальной мембраны является важным этапом для правильного формирования COs и стабильного роста. Доля матрицы базальной мембраны должна быть поддержана выше 70% (объём матрицы базальной мембраны > 70%). Рекомендуемые объёмы матрицы базальных мембран составляют 6 мкл на скважину для пластин с 96 лунками, 20 мкл на скважину для пластин с 48 лунками и 25 мкл на скважину для пластин с 24 лунками. После матричной полимеризации добавляют в скважины следующие объёмы: 100 мкл на скважину для пластин с 96 колодцами, 300 мкл на скважину для пластин с 48 лунками и 500 мкл на скважину для пластин с 24 лунками. Следует быть осторожным, чтобы избежать прямого пипетирования среды на куполах матрицы базальных мембран, так как это может нарушить трёхмерную архитектуру. Для сохранения фенотипической и генетической стабильности в этом исследовании было ограничено использование колоректальных органоидов максимум 4 проходами.

Когда крипты или СО достигают диаметра примерно 600 мкм или демонстрируют затемнение и остановку роста, проход следует проводить оперативно, чтобы позволить последующие анализы чувствительности. Во время ферментативной диссоциации COs пищеварение следует контролировать под микроскопом. Если COs недостаточно диссоциированы на мелкие клеточные кластеры или отдельные клетки, время пищеварения может постепенно увеличиваться в зависимости от размера органоида и статуса диссоциации. Следует избегать длительного пищеварения на одном этапе, чтобы минимизировать риск чрезмерного переваривания и потери жизнеспособности клеток.

Рассчитайте относительную жизнеспособность для каждой скважины с помощью следующего уравнения и используйте средний процент от реплицированных скважин в качестве значения отклика для каждой концентрации

 

Биолюминесцентный анализ АТФ основан на окислении D-люциферина, катализируемой светлячками, что приводит к эмиссии фотонов. Благодаря высокой чувствительности, совместимости с пластинчатыми высокопроизводительными форматами и наличию стандартизированных коммерческих наборов, этот метод широко применяется для предварительного скрининга на токсичность в органоидных^{моделях 17}.

Необходимо учитывать несколько факторов, вызывающих замешательство. Некоторые химические вещества могут напрямую подавлять ферментативную реакцию люциферазы через химические интерференции или подавление ферментов, что приводит к подавлению сигнала. Фоновая люминесценция трёхмерного внеклеточного матрикса, гетерогенность размера и плотности органоидов, а также неполный лиз могут вводить значительную межколодную и межпартийную вариабельность. Одна только люминесценция на основе АТФ не может точно различать модальности клеточной гибели или выяснить лежащие в основе токсикологические^{механизмы 18}.

Для повышения методологической надёжности рекомендуются систематические меры контроля качества. использование рекомендованных производителем или ранее проверенных буферов лизис, а также увеличенного времени лиза, механической диссоциации или циклов заморазания–оттаивания, когда это необходимо, для повышения эффективности лизиса клеток внутри матрицы. Во-вторых, проведите эксперименты по восстановлению АТФ-пикового ввода во время оптимизации анализа, чтобы оценить потенциальное прямое подавление люминесцентной реакции исследуемыми соединениями или лизисной средой. В-третьих, подтвердить линейный диапазон обнаружения с помощью стандартной кривой АТФ и строго контролировать время между добавлением реагента, инкубацией и показанием пластин, чтобы минимизировать техническую вариабельность. Наконец, включайте в каждый анализ заготовки, транспортные и отрицательные контроли и достаточные технические реплики для оценки и коррекции эффектов по краям и вариаций, связанных с пакетами. В последнее время были разработаны несколько анализов жизнеспособности, оптимизированных для органоидов, с улучшенной химией лизиса и повышенной стабильностью сигнала, и эти формулы, как правило, демонстрируют превосходные результаты в трёхмерных токсичных^{анализах 19}. В итоге, в этом исследовании использовались человеческие COs как модель in vitro для токсикологии тяжелых металлов окружающей среды и установлен высокопроизводительный, чувствительный биолюминесцентный анализ на основе АТФ для оценки восприимчивости органоидов к воздействию Cd. Эта работа предоставляет практический экспериментальный справочник и методологическое руководство для оценки токсичности в системах исследований на основе органоидов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150
1mL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-well plates	Corning Incorporated	3524
50 mL centrifuge tubes	CLUXCELL	321050
96-well plates	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	Программное обеспечение для работы с конкретным микропластинчатыми анализатором.
Cadmium chloride,10g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability Assay	Vazyme	DD1102-01/02/03	Светящийся реагент для определения жизнеспособности клеток в соотношении объемов 1:1.
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	thermo fisher	6125552
Forceps	Beyotime	FS019
Ice box	Beyotime	FBX078
Low-temperature high-speed centrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	Базальная мембранная матрица
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	Разжижающий раствор для органоидов
Penicillin-Streptomycin	Beyotime	C0222
Phosphate-buffered saline (1XPBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032
Pipettes	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Программное обеспечение для работы с конкретным микропластинчатыми анализатором.
Scissors	Beyotime	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S