Методическая статья

Выделение и терапевтическое применение внеклеточных везикул, полученных из самособранных агрегатов мезенхимальных стволовых клеток

DOI:

10.3791/70534

⸱

24 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of Stomatology, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 4The second Department of Surgery, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 5Military Medical Innovation Center, The Fourth Military Medical University, 6School of Basic Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, 7Department of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of The Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол подробно описывает эффективную изоляцию крупных внеклеточных везикулов (LEV) из самособранных агрегатов стволовых клеток и их терапевтическое применение для регенерации нижней челюсти.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ЭВ) являются жизненно важными посредниками межклеточной коммуникации и перспективными агентами для регенеративной медицины. Среди субпопуляций EV крупные внеклеточные везикулы (LEV) особенно подходят для восстановления тканей благодаря обогащённому прорегенеративному грузу. Однако стандартизированные и воспроизводимые методы получения функциональных LEV, полученных из стоматологических стволовых клеток, для дальнейшей характеристики и терапевтической оценки остаются ограниченными. Используя исключительный остеогенный потенциал стволовых клеток из апикальных папилл (SCAPs), мы разработали 3D-модель культуры при условиях низкой адгезии для индуцирования самособирающихся агрегатов SCAP. Эта модель имитирует физиологическую мезенхимальную конденсацию, значительно усиливая взаимодействие между клетками и усиливая секрецию LEV. Ключевые параметры культуры и примечания по обработке предоставляются для повышения согласованности агрегатов и максимизации выхода LEV при сохранении жизнеспособности клеток. Здесь мы представляем стандартизированный протокол для эффективного производства функциональных LEV, полученных на основе SCAP, включающий генерацию 3D-агрегатов, выделение с помощью дифференциальной центрифугации, распределение размера и концентрации частиц на основе анализа наночастиц (NTA), а также терапевтическую доставку с использованием термически связанного гидрогеля для восстановления дефектов нижней челюсти. Этот подход оптимизирует выработку LEV для дальнейших механистических исследований и доклинической оценки в области краниофациальной регенерации. Этот оптимизированный рабочий процесс обеспечивает воспроизводимую подготовку биоактивных LEVs с устойчивыми выходами и обогащённым проостеогенным грузом, способствуя фундаментальным исследованиям и ускоряя клиническую трансляцию краниофациальной реконструкции черепа, опосредованной EV. В репрезентативных приложениях гидрогелевые LEV обеспечивают локализованный склад в местах дефекта и облегчают удобное обращение во время имплантации. В совокупности этот метод предоставляет масштабируемую платформу для подготовки LEV, полученных из SCAP, и выделяет ключевые аспекты для стандартизированной отчетности и проектирования трансляционных исследований. Такой подход способствует более широкому внедрению в лабораториях черепно-лицевых электромобилей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ЭВ) — это мембранно-связанные наночастицы, высвобождаемые клетками, которые опосредуют межклеточные коммуникации через передачу биоактивных грузов, таких как белки, миРНК и липиды 1,2,3. Среди субпопуляций EV крупные внеклеточные везикулы (LEV) отличаются прямым высвобождением из клеточной мембраны и внутренним обогащением прорегенеративных молекул, что делает их отлично подходящими для восстановления тканей и регенерационныхпотребностей 4,5. В регенеративной медицине ЭВ, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (МСК), всё больше признаются жизнеспособной безклеточной альтернативой цельной клеточнойтерапии 6,7,8. Они повторяют паракринные регенеративные эффекты родительских МСК, избегая ограничений прямой трансплантации клеток, таких как низкая эффективность присаждения, иммуногенность и вариабельностьпартий 7,8,9,10. Среди источников MSC стволовые клетки из апикальной папиллы (SCAPs) обладают превосходным остеогенным и одонтогенным потенциалом дифференцировки 11,12,13, что делает EV, полученные из SCAP, особенно привлекательными для восстановления орофациальной кости изубной ткани 8.

В частности, биогенез и функциональность электромобилей сильно зависят от клеточной микросреды14,15. Традиционные двумерные (2D) монослойные культуры значительно отличаются от контекста нативнойткани 16,17, часто приводя к образованию EV с ослабленной регенеративнойспособностью 18. В отличие от этого, трёхмерные (3D) самособранные агрегаты MSC воспроизводят ключевые аспекты физиологической мезенхимальной конденсации — стадии развития, характеризующейся высокой плотностью клеток, интенсивным контактом между клетками и обогащённым внеклеточным матриксом (ECM), который обеспечивает структурную поддержку и даёт биохимические и механические сигналы, регулирующие адгезию, миграцию и решения о судьбеклеток 19,20,21 . Эта биомиметическая 3D-микросреда не только улучшает межклеточную коммуникацию и паракриннуюсигнализацию 22,23, но и способствует секреции электромобилей с более высоким выходом и улучшенными биоактивными грузовымипрофилями 24,25,26. Использование 3D-самосборочных агрегатов MSC таким образом становится перспективной стратегией получения функционально мощных электромобилей для регенеративныхприложений 18.

Несмотря на очевидные преимущества агрегатных электромобилей, стандартизированные протоколы их изоляции и характеристики из 3D-систем остаются недостаточно развитыми. Современные методологии изоляции электромобилей, такие как дифференциальная центрифуга, хорошо зарекомендованы и предлагают масштабируемую основу для производстваэлектромобилей 27. Аналогично, были описаны методы получения агрегатов MSC, часто основанные на клеточных скручивании и агрегации клеток, вызванных витамином C, из 2D-культивированныхклеток 28. Однако архитектура ЭКМ в этих агрегатах, индуцированных витамином C, может всё же отличаться от пространственно организованной, конденсационной микросреды нативных мезенхимальных тканей. В отличие от этого, самосборка без каркасов при условиях низкой адгезии облегчает формирование компактных сферических агрегатов, приближающих ключевые особенности мезенхимальнойконденсации 19,29. В настоящее время отсутствует систематический и воспроизводимый рабочий процесс для выделения и применения электромобилей из таких 3D-агрегатов SCAP с низкой адгезией. С практической точки зрения, производство LEV из традиционных 2D SCAP-культур обычно находится в диапазоне~10 11 частиц/мл по наноэлементарному отслеживанию (NTA), а 3D-агрегация с низкой адгезией, как ожидается, увеличит выход LEV в несколько раз, сохраняя воспроизводимость для последующих приложений. Чтобы устранить этот пробел, мы подробно рассматриваем комплексный протокол, который использует врождённую SCAP остеогенную/одонтогенную функциональность и оптимизирует микроокружение MSC с помощью 3D-агрегации с низкой адгезией. Этот протокол обеспечивает надёжное производство высококачественных LEV, предоставляя стандартизированный инструмент для продвижения безклеточной регенеративной терапии в краниофациальной медицине.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Четвёртого военно-медицинского университета и проводились в соответствии с руководящими принципами ARRIVE. Сбор и использование человеческих образцов были одобрены Этическим комитетом Четвёртого военно-медицинского университета (одобрение No IRB-REV-2022187). Письменное информированное согласие было получено от всех доноров перед сбором образцов; Для доноров, которые были несовершеннолетними или не могли дать согласие, писмое информированное согласие получалось от их законных опекунов. Все реагенты проходили стерильную фильтрацию, а процедуры культивирования клеток проводились в биобезопасности для поддержания стерильности (см. Таблицу материалов). Рассматривайте все материалы, полученные человеком (зубы, ткани, первичные клетки, кондиционированные среды и препараты для электровоздушных средств) как потенциально инфекционные. Выполнять все процедуры с человеческими образцами в сертифицированном шкафу для биобезопасности с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат, перчатки и защиту глаз. Для биобезопасности и утилизации отходов следуйте институциональным рекомендациям BSL-2: Обращаться со всеми материалами, полученными человеком, и загрязнёнными одноразовыми материалами как биологически опасными отходами BSL-2; После использования дезинфицируйте поверхности и оборудование одобренным дезинфицирующим средством. Собирайте жидкие биологические отходы в маркированные контейнеры и инактивируйте их с помощью одобренных методов перед утилизацией. Немедленно утилизируйте острые изделия в одобренные контейнеры (без возврата). Рассматривать ткани/туши животных и анестетики/химические остатки как регулируемые биологические опасности/химические отходы и утилизировать их через институциональные службы в соответствии с действующими нормативами.

1. Изоляция и культура человеческих SCAPs

ПРИМЕЧАНИЕ: P/S — это биоактивная смесь антибиотиков, которая может вызывать раздражение кожи и глаз или аллергические реакции. При открытии используйте в шкафе BSL-2 для биобезопасности; носить перчатки и защиту глаз; избегайте образования аэрозолей; и утилизировать отходы в соответствии с институциональными руководящими принципами по химическим отходам. Коллагеназа типа I (раствор) — это биоактивный фермент, который может вызывать раздражение кожи/глаз или аллергические реакции. Рукоятка находится в шкафу биобезопасности BSL-2; носить перчатки и защиту глаз; избегайте брызг и образования аэрозолей во время пипетирования; и своевременно обезвреживать разливы в соответствии с институциональными процедурами. Защищайте коллагеназу типа I от света во время хранения и использования (см. Таблицу материалов).

  1. Соберите третьи моляры с незрелыми вершинами здоровых доноров (16–21 год) и тщательно промывайте с помощью фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), содержащего 1% пенициллина/стрептомицина (P/S) (см. Таблицу материалов).
  2. Вскрытие апикальной ткани папиллы с корневой вершины с помощью стерильных офтальмологических пинцетов и ножниц, затем измельчите её на мелкие фрагменты (<1мм 3).
  3. Перенесите все фрагменты тканей в центрифугную трубку объемом 15 мл. Переварить фрагменты с 2 мг/мл коллагеназой I типа при 37 °C в течение 1 часа, аккуратно встряхивая каждые 15 минут.
  4. Остановить переваривание, добавив равный объём полного α-минимум необходимой среды (α-MEM) (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время пищеварения коллагеназы типа I не фиксировано и зависит от состояния переваривания тканей. Внимательно следите за процессом, прекращайте пищеварение, когда ткани становятся полуэродированными, добавляя среду. Чрезмерное переваривание может ухудшить жизнеспособность клеток.
  5. Центрифугуйте суспензию клетки при 100 × г в течение 5 минут при 4 °C, сбросьте супернатант и снова суспензуйте гранулу в 2 мл полного α-MEM.
  6. Засейте переваренную ткань в чашку Петри диаметром 10 см и добавьте 8 мл полного α-MEM к итоговому объёму 10 мл на тарелку.
  7. Культура SCAPs при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При постоянном мониторинге культур клетки обычно мигрируют из фрагментов ткани и прикрепляются к чашке в радиальной форме в течение 3–7 дней. Если жизнеспособность тканей низкая или миграция клеток не наблюдается в течение 5 дней, переходите на полный α-MEM с добавлением сыворотки 20%.
  8. Для передачи клеток клетки промывали 5 мл PBS для удаления остаточной среды после достижения слияния 80–90%. Впоследствии их инкубировали с 2 мл трипсина-1 мМ EDTA при 37 °C в течение 2 минут (см. таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсин–ЭДТА является раздражителем и может повреждать кожу и глаза. Обращайтесь с перчатками и защитой для глаз, избегайте брызг и образования аэрозолей, а при контакте немедленно промывайте большим количеством воды. Утилизировать жидкие отходы, содержащие трипсин, согласно институциональным рекомендациям.
  9. Когда клетки становятся округлыми с нарушением межклеточных соединений под микроскопом, аккуратно отделяйте клетки от антенны без чрезмерных структурных повреждений. Нейтрализуйте трипсин, добавив 4 мл полного α-MEM.
  10. Собирайте клетки аккуратно, повторяющем пипето в свежую центрифугную трубку на 15 мл. После центрифугирования при 100 × г в течение 5 минут сбросьте супернатант и снова суспензуйте клеточную гранулу в полном α-MEM. Засеять восстановленные клетки в свежие культурные чаши или колодцевые тарелки. Меняйте носитель каждые два дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что SCAP, используемые для агрокультуры, находятся в пределах пятого абзаца. Ствол и вместимость агрегации снижаются с увеличением количествапроходов 30,31, что может снизить эффективность и функциональные характеристики заполняющих формировок.

2. Самосборка агрегатов SCAP

  1. Собрать 3–5 SCAPs с помощью трипсинизации, центрифугировать при 100 × г в течение 5 минут и повторно суспензировать в α-MEM с дополнением 10% сыворотки плода (FBS) и 1% P/S (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте FBS, истощённый EV, центрифугировав FBS при 150 000 × г при 4 °C ночью для удаления EV и других примесей32.
  2. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра и семян 1 × 105 клеток на каждую скважину в пластинах с ультранизкой прикреплённостью и 24 ячецами. Отрегулируйте средний объём до 500 мкл на одну скважину, чтобы сохранить состояние подвески.
  3. Инкубировать тарелки при 37 °C с 5% CO₂ в течение 72 часов и заменять посевную среду каждые 48 часов.
  4. Ежедневно контролировать образование агрегата под перевёрнутым оптическим микроскопом. Собирают электромобили, когда заполнители достигают диаметра 200–400 мкм и обладают компактной, гладкой структурой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите одну производственную «партию» как LEV, изолированные из объединённой кондиционируемой среды, собранные из заполнителей SCAP, посеянных в тот же день из того же клеточного прохода и поддерживаемых в одинаковых условиях культуры в рамках одного окна сбора (72 часа). Обрабатывайте каждую партию отдельно с помощью центрифуга. Замените культурную среду через 48 часов после посева и пополните тем же объёмом свежей среды. Для производства LEV собирайте кондиционированную среду через 48 часов и снова через 72 часа после посева, а собранную среду (0–48 ч и 48–72 ч) объединять в одну партию. Держите облегченную среду при 4 °C и обрабатывайте её для выделения LEV.

3. Изоляция и характеристика электромобилей из агрегатов SCAP

  1. Дифференциальное центрифугирование для изоляции больших LEV
    1. Соберите посевную среду с агрегатами SCAP в пробирки центрифуг объемом 15 мл.
    2. Центрифугу при 800 × г в течение 10 минут при 4 °C для удаления целостных заполнителей и крупных клеточных мусора.
    3. Перенесите супернатант в новые трубки на 15 мл и центрифугите при 2 500 × г на 15 минут при 4 °C, чтобы устранить остатки тромбоцитов и мелкие фрагменты.
    4. Аккуратно переведите супернатант в стерильные конические трубки объёмом 1,5 мл и центрифугите при 16 800 × г на 30 минут при 4 °C в гранулы LEV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте конические трубки объёмом 1,5 мл для увеличения выхода LEV.
    5. Сбросьте супернатант, снова суспензируйте гранулу в 1 мл стерильного PBS и снова центрифугуйте при 16 800 × г в течение 30 минут при 4 °C с помощью ротора с фиксированным углом (совместимого со стандартной настольной центрифугой) для гранулирования LEV.
    6. Установите торможение/торможение на «медленное» или «низкое» (обычно уровень тормозов 1 или 2), чтобы предотвратить повторное подвесление LEV в финальной фазе торможения.
    7. Сбросьте супернатант и подвесьте последнюю LEV-гранулу в 50 мкл стерильного PBS. Используйте подвеску немедленно (в течение 24 часов) или храните при 4 °C. Избегайте замораживания, чтобы минимизировать потерю биологической активности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте примерно 80 скважин с заполнителями для получения достаточного количества LEV для типичных экспериментов по следующему этапу. Образцы LEV рекомендуются для немедленной характеристики или терапевтического применения, а не для длительного хранения. Если требуется более длительное хранение, аликвотируйте суспензию LEV (например, 5–10 мкл на трубку), чтобы избежать повторяющихся колебаний температуры и циклов замерзания-оттаивания. Быстро заморозить аликвоты на сухом льду и хранить при −80 °C для краткосрочного длительного хранения (например, до 1–3 месяцев). Разморозьте один раз на льду и используйте сразу. Обратите внимание, что замораживание может снижать биоактивность и изменять восстановление и распределение размеров частиц; поэтому, по возможности проводите функциональные исследования с использованием свежеприготовленных LEV. Для контроля качества после хранения повторно измеряйте концентрацию и распределение размеров частиц с помощью NTA и продолжайте только если значения остаются в пределах заранее определённого диапазона принятия. Кроме того, в этом протоколе концентрация частиц НТА используется как основной метод количественной оценки для предотвращения потери везикул, связанных с анализами на основе белков, такими как BCA, что максимизирует выход для последующих приложений.
  2. NTA для размера и концентрации частиц
    ПРИМЕЧАНИЕ: NTA проводится с помощью коммерчески доступного анализатора отслеживания наночастиц (см. таблицу материалов) для оценки распределения размеров и концентрации частиц.
    1. Разведите 1 мкл подвески LEVs (из раздела 3.1, шаг 6) в 1 499 мкл стерильного PBS в стерильной конической трубке объёмом 1,5 мл и тщательно перемешайте.
    2. Запустите совместимое программное обеспечение и наполните образцовый элемент 10 мл ультрачистой воды. Убедитесь, что количество частиц на фоне составляет < 10 на кадр, чтобы система была чистой (см. Таблицу материалов).
    3. Калибруйте прибор с помощью подготовленного стандартного раствора. Установите программные параметры на: чувствительность 70, затвор 70, минимальная зона 5 и минимальная яркость 20. Выполните «AutoAlignment», чтобы убедиться, что лазер сфокусирован. Отрегулируйте стандартное разбавление до того момента, пока количество частиц, указанное в программном обеспечении, не достигнет 50–400 (желательно ~200), а затем запустите программу калибровки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте стандартный раствор, восстановив 1 мкл калибровочных шариков в 1 мл дистиллированной воды для получения первичного раствора. Разведите 100 мкл первичного раствора в 25 мл дистиллированной воды (разбавление 1:250 000) и храните при 4 °C до 1 недели.
    4. Перед анализом промыйте образец 5 мл дистиллированной воды.
    5. Промыйте канал 1 мл дистиллированной воды и убедитесь, что количество частиц на интерфейсе обнаружения составляет <10.
    6. Вводите 1 мл разбавленной образцы LEVs с постоянной скоростью 0,5 мл/с с помощью стерильного шприца объёмом 1 мл.
      ВНИМАНИЕ: Ручное управление шприцем для поддержания стабильной скорости инъекции.
    7. Проводите анализ частиц и составляйте отчёты. В программном обеспечении создайте новое измерение и выберите режим Размер/Концентрация. Установите запись на 3 записи, по 60 с на каждую запись, при 25 °C, используя те же параметры обнаружения, что и на шаге 3 (чувствительность 70, затвор 70, минимальная зона 5, минимальная яркость 20).
    8. Начните сбор и убедитесь, что количество частиц на экране остаётся в пределах 50–400 частиц на кадр (желательно ~200); если выходит за пределы этого диапазона, остановитесь и скорректируйте разбавление образца, затем повторите шаг 6. После набора проведите анализ для получения среднего размера, размера моды, D10/D50/D90 и концентрации частиц (частиц/мл). Затем экспортируйте графики распределения результатов и размеров в форматах .csv и .pdf (или аналогичных форматах отчёта) и сохраняйте файл измерений для ведения учета.

4. Терапевтическое применение ЛЕВ в регенерации нижней челюсти

  1. Подготовка гидрогеля с нагрузкой LEV
    1. Приготовьте приклад Pluronic F-127 (20% с поверхностью). Добавьте Pluronic F-127 порошок в стерильный PBS до конечной концентрации 20% (w/v) и перемешайте при 4 °C в течение ночи до полного растворения и однородности (см. таблицу материалов). Поддерживайте температуру раствора при 4 °C во время подготовки, чтобы избежать преждевременного гелирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 20% (w/v) Pluronic F-127 является жидким при 4 °C и подвергается термогелированию при ~20–25 °C (в зависимости от трубки/комнаты); он становится стабильным гелем при 37 °C.
    2. Загружайте LEV в холодных условиях. Предварительное охлаждение трубок, наконечников пипеток и гидрогель до 4 °C. Смешать 50 мкг LEV (эквивалент LEV из двух 24-колодных пластин заполнителей) с 1 мл 20% плюронного F127 путём мягкой пипетки и кратковременного низкоскоростного вихря для обеспечения равномерного распределения. Сохраняйте смесь на льду или при 4 °C до имплантации.
    3. Руководство по обращению/использованию (для воспроизводимости). Быстро заправляйте и загружайте шприц/кончик на льду. Если смесь нагревается более ~20–25 °C, вязкость увеличивается, и начинается желирование; в таком случае верните до 4 °C, пока материал снова не станет полностью пригодным для обработки перед использованием. После установки дефекта позволите геляции происходить in situ при температуре тела (37 °C).
  2. Установление модели дефекта нижней челюсти мыши
    1. Анестезия мышей C57Bl/6 возрастом 8 недель (самцов или самок) путём внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия (50 мг/кг) (см. таблицу материалов).
      ВНИМАНИЕ: Пентобарбитал натрий — мощный седативный/анестетик и токсичен для человека при случайном введении, проглатывании или вдыхании. Подготовьте и вводите с использованием безопасных методов использования острых предметов (не повторяйте иглы; сразу выбросьте в контейнер для острых предметов), носите перчатки и защиту для глаз, избегайте контакта с кожей, а также храните/фиксируйте использование в соответствии с институциональной политикой по контролируемым лекарствам. Подтвердите правильную анестезию у мышей, проверив отсутствие роговицового рефлекса и отсутствие отмены конечности при защемлении подушечки стопы. Нанесите защитную офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
    2. Сбрийте шерсть над областью левой нижней челюсти и поочерёдно дезинфекцируйте 10% повидон-йода и 75% этанола.
      ВНИМАНИЕ: 75% этанола очень воспламеняющийся; Используйте его подальше от источников зажигания и обеспечьте хорошую вентиляцию. Повидон-йод может вызывать раздражение кожи/глаз или аллергические реакции; Надевайте перчатки, избегайте контакта с глазами/слизистью и быстро очищайте проливы.
    3. Сделайте продольный разрез длиной 1 см вдоль края нижней челюсти и тупо рассеките мягкие ткани, чтобы обнажить угол нижней челюсти.
    4. Создайте круглый костный дефект (диаметром 2 мм) с помощью стоматологической дрели с непрерывным солевым промывом для предотвращения термического повреждения (см. таблицу материалов).
      ВНИМАНИЕ: Внимательно следите за внутриоперационными кровотечениями, контролируйте кровотечение маленькими ватными шариками для поддержания чистого хирургического поля и снижения риска инфекции. Избегайте контакта с окружающими мягкими тканями с помощью дрели, чтобы предотвратить запутывание.
  3. Имплантация гидрогеля с нагрузкой LEV
    1. Загрузите смесь LEV-гидрогеля в стерильный шприц и введите её в костный дефект, обеспечив полное заполнение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Администрировать ~10 мкг ЛЕВ на мышь. Для получения достаточного количества LEV для эксперимента с n = 5 мышей требуется две пластины SCAP с 24 лунками.
    2. Для контрольной группы введите равный объём гидрогеля Pluronic F-127 без LEV.
    3. Зашвите разрез 4-0 васывающимися швами и введите подкожную анальгезию (карпрофен, 5 мг/кг) для облегчения послеоперационной боли (см. таблицу материалов).
      ВНИМАНИЕ: Карпрофен — это фармакологически активный НПВС и может быть вреден при случайном введении или при контакте с кожей/глазами. Надевайте перчатки, избегайте острых травм, выбрасывайте иглы/шприцы в контейнер для острых предметов и утилизируйте неиспользованные лекарства и загрязнённые материалы в соответствии с институциональными процедурами по отходам фармацевтических отходов.
    4. Положите мышей на согревающее одеяло до восстановления после наркоза, затем переведите их в отдельные клетки с свободным доступом к еде и воде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте мышей без присмотра, пока они не восстановят достаточное сознание для поддержания грудинального лежачества. Возвращайте мышей в групповое жильё только после полного выздоровления.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Согласно экспериментальному рабочему процессу, ключевые этапы, включая выделение SCAP, формирование агрегатов, экстракцию LEVs и терапевтическую имплантацию, были успешно выполнены (рисунок 1). Клинически импактированные третьи моляры доноров имели незрелые вершины с целостной апикальной папилловой тканью, прикреплённой вокруг открытых отверстий корневых каналов, что подтверждает подходящий источник SCAP (рисунок 2A). При культи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растущий интерес к регенеративным терапиям без клеток поставил LEV, полученные из мезенхимальных стволовых клеток, как перспективные альтернативы цельной трансплантации клеток, благодаря их способности доставлять биоактивные молекулы без рисков, связанных с клеточными методами. Однако клиническая трансляция терапий на основе LEV была затруднена отсутствием физиологически значимых систем культуры, способных полностью сохранять и улучшать функциональность LEV. Традиционные двухмерные монос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2021YFA1100600), Национального фонда естественных наук Китая (82471011, 82401201), проекта Государственной ключевой лаборатории реконструкции и регенерации полости рта и челюстно-лицевой части (2024MS04), Китайского фонда постдокторских наук (BX20230485) и проекта партнёрской лабораторной программы сотрудничества и обмена Четвёртого военно-медицинского университета (2024HB014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл Шприц с иглойBD300841Анестезия
Клетка для культуры 10 смКорнинг353003Клеточная культура
Центрифуга из полистирола объемом 15 млКорнинг352095Клеточная культура
Дезинфектант с 75% этаноломХай Ши Хай НоHS-750Эксплуатация
Впитываемый шов 4-0Медицина ЦзиньхуаньR413Эксплуатация
Настольная центрифугаВИГГЕНСCE187Изоляция электромобилей
CO2-инкубатор, 150 л, универсальный типThermoFisher51032874Клеточная культура
Коллагеназный тип IThermoFisher17100017Клеточная культура
Ватные шарикиДероял30-033Эксплуатация
Изогнутые рабочие ножницыХирургический инструмент JZJ21040Эксплуатация
Стоматологический мобильный турбинный блокKaVoS609CЭксплуатация
Электронный балансЧжи КэZK-DSTКлеточная культура
Труба ЭппендорфаЭппендорф3810XИзоляция электромобилей
Щипцем — всё нормальноХирургический инструмент JZJD1020Эксплуатация
Крем для удаления волосVeet1.00097E+11Эксплуатация
Высокоскоростной Шар БурДентсплай СиронаE0123Эксплуатация
Высокоскоростной наручникKaVoKV-1-008-1644Эксплуатация
Инвертированный микроскопMshotMF53-NКлеточная культура
MEM и альфа; (Минимальный базовый носитель и альфа;)ThermoFisher12561056Клеточная культура
Видеомикроскоп с отслеживанием наночастиц PMX-120Частица МетриксZetaView PMX120Анализ отслеживания наночастиц
Пенициллин-стрептомицин (P/S)ThermoFisher15140122Клеточная культура
Пентобарбитал натрийСигма-Олдрич57-33-0Анестезия
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)ThermoFisher10010023Клеточная культура
Pluronic F-127Сигма-ОлдричP2443Имплантация электромобилей
Раствор йода повидонаBaxter PROSL500Эксплуатация
Специализированная сыворотка для плода для крупного рогатого скота (FBS)ThermoFisher12664025Клеточная культура
Стерильный марлевый блокПобеда10-000-681Эксплуатация
Настольная высокоскоростная микроцентрифугаHitachiCT15EИзоляция электромобилей
Трефиновое сверлоМикрофиксация биомет01-9182Эксплуатация
Trypsin-EDTAThermoFisher25200072Клеточная культура
Пластина с ультранизким креплением и 24 лункамиКорнинг3473Клеточная культура
Вихревой миксер ДжинНаучные отраслиSI0425Имплантация электромобилей

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiu, G., et al. Functional proteins of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Stem Cell Res. Ther. 10, 359-372 (2019).
  2. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res. Ther. 9, 50-63 (2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 19, 213-228 (2018).
  4. Rai, A., et al. Proteomic dissection of large extracellular vesicle surfaceome unravels interactive surface platform. J. Extracell. Vesicles. 10, 1-20 (2021).
  5. Ye, T., et al. Large extracellular vesicles secreted by human iPSC-derived MSCs ameliorate tendinopathy via regulating macrophage heterogeneity. Bioact. Mater. 21, 194-208 (2023).
  6. Liang, Z., Luo, Y., Lv, Y. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles mediate BMP2 gene delivery and enhance bone regeneration. J Mater Chem B. 8, 6378-6389 (2020).
  7. Olaechea, A., et al. Preclinical Evidence for the use of oral mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in bone regenerative therapy: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 12, 791-800 (2023).
  8. Zhang, T., et al. Extracellular vesicles derived from human dental mesenchymal stem cells stimulated with low-intensity pulsed ultrasound alleviate inflammation-induced bone loss in a mouse model of periodontitis. Genes Dis. 10, 161-1625 (2023).
  9. Cai, X. Y., et al. Inflammation-triggered Gli1(+) stem cells engage with extracellular vesicles to prime aberrant neutrophils to exacerbate periodontal immunopathology. Cell Mol Immunol. 22, 371-389 (2025).
  10. Wang, Y., et al. Reciprocal regulation of mesenchymal stem cells and immune responses. Cell Stem Cell. 29, 1515-1530 (2025).
  11. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. J Tissue Eng. 29, 1-17 (2017).
  12. Yang, H., et al. Secreted frizzled-related protein 2 promotes the osteo/odontogenic differentiation and paracrine potentials of stem cells from apical papilla under inflammation and hypoxia conditions. Cell Prolif. 53, 1-11 (2020).
  13. Huang, M., Dissanayaka, W. L., Yiu, C. K. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges, and opportunities. Stem Cell Res Ther. 16, 1-20 (2025).
  14. Jaukovic, A., et al. Specificity of 3D MSC Spheroids Microenvironment: Impact on MSC Behavior and Properties. Stem Cell Rev Rep. 16, 853-875 (2020).
  15. Wang, X., et al. Hypoxia promotes EV secretion by impairing lysosomal homeostasis in HNSCC through negative regulation of ATP6V1A by HIF-1 alpha. J Extracell Vesicles. 12, 1-20 (2023).
  16. Yuste, I., et al. Mimicking bone microenvironment: 2D and 3D in vitro models of human osteoblasts. Pharmacol Res. 169, 1-57 (2021).
  17. Fontana, F., et al. In Vitro 3D cultures to model the tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13, 1-16 (2021).
  18. Cook, K., Li, H. Advancing extracellular vesicle production: improving physiological relevance and yield with 3D cell culture. Nanoscale. 17, 15110-15131 (2025).
  19. Sui, B. D., et al. Mesenchymal condensation in tooth development and regeneration: a focus on translational aspects of organogenesis. Physiol Rev. 103, 1899-1964 (2023).
  20. Kobayashi, T., Kronenberg, H. M. Overview of skeletal development. Methods Mol Biol. 2230, 3-16 (2021).
  21. Naba, A. Mechanisms of assembly and remodelling of the extracellular matrix. Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 865-885 (2024).
  22. Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 1-16 (2021).
  23. Zhang, J., et al. Functional tissue-engineered microtissue formed by self-aggregation of cells for peripheral nerve regeneration. Stem Cell Res Ther. 13, 1-20 (2022).
  24. Yu, W., et al. Higher yield and enhanced therapeutic effects of exosomes derived from MSCs in hydrogel-assisted 3D culture system for bone regeneration. Biomater Adv. 133, 1-17 (2022).
  25. Kim, M., et al. Three-dimensional spheroid culture increases exosome secretion from mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med. 15, 427-436 (2018).
  26. Millan, C., et al. Extracellular vesicles from 3d engineered microtissues harbor disease-related cargo absent in EVs from 2D cultures. Adv Healthc Mater. 11, 1-17 (2022).
  27. Petit, I., Levy, A., Aberdam, D. Purification of extracellular microvesicles secreted by dermal fibroblasts. Methods Mol Biol. 2154, 63-72 (2020).
  28. Li, S., et al. Construction, characterization, and regenerative application of self-assembled human mesenchymal stem cell aggregates. J Vis Exp. (15), e64697(2023).
  29. Sui, B. D., et al. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods Mol Biol. 2002, 87-99 (2019).
  30. Mobasseri, R., et al. Peptide-modified nanofibrous scaffold promotes human mesenchymal stem cell proliferation and long-term passaging. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 84, 80-91 (2018).
  31. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
  32. Cao, Y., et al. Isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues. J Vis Exp. 20, e63990(2022).
  33. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell Tissue Res. 347, 701-711 (2012).
  34. Li, Y., et al. Lysosome-Featured Cell Aggregate-Released Extracellular Vesicles Regulate Iron Homeostasis and Alleviate Post-Irradiation Endothelial Ferroptosis for Mandibular Regeneration. Adv Sci (Weinh). 12, 1-22 (2025).
  35. Longjohn, M. N., Christian, S. L. Characterizing Extracellular Vesicles Using Nanoparticle-Tracking Analysis. Methods Mol Biol. 2508, 353373(2022).
  36. Cantore, S., et al. Characterization of human apical papilla-derived stem cells. J Biol Regul Homeost Agents. 31, 901-910 (2017).
  37. Wang, Z., et al. Fibroblast growth factor 2 promotes osteo/odontogenic differentiation in stem cells from the apical papilla by inhibiting PI3K/AKT pathway. Sci Rep. 14, 19-35 (2024).
  38. Li, J., et al. TGF-beta2 and TGF-beta1 differentially regulate the odontogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Arch Oral Biol. 135, 1-15 (2022).
  39. Zhang, W., et al. Foxc2 and BMP2 Induce Osteogenic/Odontogenic Differentiation and Mineralization of Human Stem Cells from Apical Papilla. Stem Cells Int. 18, 23-36 (2018).
  40. Man, K., et al. An ECM-mimetic hydrogel to promote the therapeutic efficacy of osteoblast-derived extracellular vesicles for bone regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 10, 82-99 (2022).
  41. Ming, L., et al. Small extracellular vesicles laden oxygen-releasing thermosensitive hydrogel for enhanced antibacterial therapy against anaerobe-induced periodontitis alveolar bone defect. ACS Biomater Sci Eng. 10, 932-945 (2024).
  42. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Purification of mitochondria by sucrose step density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 14, 8-28 (2014).
  43. Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 2016, 299-310 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Mesenchymal Stem CellsLarge Extracellular VesiclesSCAP Derived LEVs3D Cell CultureDifferential CentrifugationNanoparticle Tracking AnalysisHydrogel DeliveryCraniofacial Regeneration

Похожие статьи