Method Article

Декодирование эпитранскриптома: In Silico Insights Regulatory Network M6A при раке молочной железы

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предлагает подход к проведению in silico генетических, молекулярных и прогностических анализов регуляторов модификации m6A, интегрируя профили мутаций, изменения числа копий, экспрессию генов и клинические результаты с использованием общедоступных наборов данных из Атласа генома рака (TCGA), проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx) и платформ микрочипов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N6-метиладенозин (m6A) является самой распространённой внутренней модификацией РНК в эукариотических транскриптах и играет ключевую роль в метаболизме РНК, экспрессии генов и клеточном гомеостазе. Дисрегуляция регуляторов m6A, включая «писателей», «ластиков» и «читателей», всё чаще связывается с биологией рака; Однако их всесторонняя роль в борьбе с раком молочной железы остаётся неизучённой. Основная цель этой статьи — предоставить новичкам в биоинформатике пошаговую структуру для использования общедоступных наборов данных по раку для проведения мутационного анализа, оценки изменений экспрессии генов и изучения их связи с выживаемостью пациентов. В качестве примера регуляторы m6A при раке молочной железы анализировались с использованием наборов данных из Атласа генома рака (TCGA), проекта Genotype-Tissue Expression (GTEx) и платформ микрочипов. Транскриптомические профили были систематически проанализированы для демонстрации рабочих процессов оценки прогностической значимости регуляторных компонентов m6A при раке молочной железы. Используя эту аналитическую основу, были выявлены характерные закономерности генетических изменений и дифференциальной экспрессии среди ключевых регуляторов m6A. Несколько регуляторов, включая METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 и RBMX, были связаны с улучшением выживаемости пациентов, тогда как YWHAG — с низкой общей выживаемостью. Это исследование предоставляет комплексный обзор системной геномики регуляторных генов m6A при раке молочной железы, демонстрируя практический и воспроизводимый веб-ориентированный биоинформатический рабочий процесс. Эти результаты способствуют пониманию эпитранскриптомической регуляции при раке молочной железы и служат основой для разработки новых диагностических и терапевтических стратегий на основе m6A.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпитранскриптомические модификации представляют собой важный слой посттранскрипционной регуляции генов и способствуют формированию различных клеточных процессов и состояний заболеваний. Из более чем 170 выявленных на сегодняшний день модификаций РНК наиболее распространённым и хорошо охарактеризованным является N6-метиладенозин (m6A) в эукариотическихмРНК 1. Устанавливаемый «писательскими» комплексами, включая METTL3/METTL14, удаляемый «ластиками», включая FTO и ALKBH5, и интерпретируемый «читательными» белками, включая членов семейства YTH и IGF2BP, m6A организует сплайсинг, стабильность, транспорт и трансляцию РНК, тем самым влияя на ключевые биологические процессы, включая развитие, дифференцировку и стрессовуюреакцию 2,3.

Изменения в регуляторных компонентах m6A были зарегистрированы в широком спектре злокачественныхопухочек 4. Во многих видах рака аномальная активность m6A вызывает появление злокачественных фенотипов; например, повышенная экспрессия METTL3 способствует инициации и прогрессированию рака простаты за счёт модуляции пути ёжика и метилирования MYCРНК 5,6. Изначально было установлено, что ФТО участвует в онкогенном воздействии при остром миелоидном лейкозе, но было показано, что ФТО способствует прогрессированию опухолей при раке печени, лёгкихи колоректального рака 7,8,9,10. Однако были выявлены контекстно-зависящие роли FTO и ALKBH5, которые иллюстрируют двойственную природу регуляции, опосредованной m6A, что может способствовать как онкогенному, так и опухолоподавляющемусигналам 11,12,13,14. Считыватели M6A, включая YTHDF1/2/3, гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины (hnRNP) и белки, связанные с фактором роста-2 (IGF2BP1-3), также были связаны с канцерогенезом 15,16,17.

При раке молочной железы всё больше данных указывает на то, что регуляторы m6A часто нарушены и могут быть связаны с подтипами опухолей, иммунными особенностями и клиническимирезультатами 18,19. Многочисленные механистические исследования позиционируют METTL3 как часто повышающийся проонкогенный фактор при раке молочной железы. Установка m6A, опосредованная METTL3, может стабилизировать или усилить трансляцию транскриптов, способствующих пролиферации, эпителиально-мезенхимальному переходу (EMT), метастазированию и химиорезистентности20. Также было показано, что METTL3 способствует прогрессированию рака молочной железы за счёт таргетинга наBcl-221. ALKBH5 участвует в регулировании программ ствола рака с помощью NANOG и других молекул, связанных со стволом, однако его влияние может варьироваться в зависимости от контекстаопухоли 22.

Поскольку список регуляторов m6A продолжает расширяться в последние годы, необходимо обновить информацию о том, как недавно выявленные регуляторы могут быть дисрегулированы при раке молочной железы. Таблица 1 содержит список регуляторов m6A, включающих записи, считыватели и ластики модификации m6A. Кроме того, были выявлены новые регуляторы m6A, включая LRPPRC и YWHAG, с последствиями для прогрессирования рака 23,24,25. Поэтому была проведена комплексная генетическая и молекулярная характеристика всех известных регуляторов m6A при раке молочной железы с использованием инструментов, которые могут применяться исследователями с ограниченным биоинформатическим опытом.

Цель этой статьи в разделе «Методы» — представить пошаговый протокол биоинформатики на основе платформы для анализа регуляторов m6A при раке молочной железы с использованием общедоступных ресурсов геномики рака. Используя наборы данных из The Cancer Genome Atlas (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), Genotype Tissue Expression (GTEx) проекта26 и веб-аналитических платформ, таких как cBioPortal и UCSC Xena, этот протокол демонстрирует воспроизводимые рабочие процессы для оценки мутационных профилей, изменений экспрессии генов и связи с выживаемостью пациентов. Этот визуализированный и доступный подход предназначен для облегчения внедрения эпитранскриптомического анализа данных исследователями, начинающими в биоинформатике рака.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Список генов, кодирующих регуляторы метилирования m6A, классифицированных как авторы, считыватели и стиратели, представлен в таблице 1. Все перечисленные гены были включены в последующие анализы мутаций, паттернов экспрессии и общей выживаемости. Всё программное обеспечение и инструменты, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Выявление генетических изменений в регуляторах m6A

  1. Получите доступ к cBioPortal для геномики рака. Перейдите на сайт cBioportal (www.cbioportal.org)27,28. На главной странице выберите вкладку «Запрос», чтобы начать новый анализ.
  2. Выберите подходящее исследование и группу рака.
  3. В поисковой строке «Выбрать исследования для визуализации и анализа» введите «Инвазивная карцинома молочной железы» и выберите «Инвазивная карцинома молочной железы (TCGA, Панраковый атлас)».
  4. Внизу выберите «Запрос по Джину».
    КРИТИЧНО: Убедитесь, что выбранная когорта (996 образцов) включает как данные о мутациях, так и об изменении числа копий (CNA).
  5. Определите генетический запрос. В разделе «Введите гены» введите символы гена HUGO для полного списка исследуемых регуляторов m6A.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гены можно вводить в виде списка, разделённого пробелами. В разделе «Выбрать геномные профили» убедитесь, что отмечены следующие два типа данных: мутации и изменения номера копирования.
  6. В разделе «Выбрать набор пациента/случая» выберите набор выборок по умолчанию, соответствующий когорте со всеми профилями случаев.
  7. Нажмите синюю кнопку «Отправить запрос».
  8. Получить и интерпретировать данные о генетических изменениях. После отправки результат загрузится на вкладке «summary». Центральная визуализация «OncoPrint» даёт немедленный обзор генетических изменений по всем запросным генам когорты, который можно скачать.
  9. Рядом с OncoPrint найдите график «Краткое описание типа рака». Это даёт количественный анализ изменений между подтипами рака молочной железы.
  10. Проведите панраковый анализ. Вернитесь на главную страницу cBioPortal и выберите «TCGA PanCancer Atlas Studies» во вкладке «Запрос».
  11. В поле ввода гена введите тот же список генов m6A-регуляторов.
  12. Нажмите «Отправить запрос», а на странице результатов перейдите на вкладку «Краткое описание типов рака». Это даёт панраковый взгляд.

2. Сравнительный транскриптомический анализ регуляторов m6A с использованием UCSC Xena.

  1. Получите доступ к платформе UCSC Xena. Перейдите на сайт UCSC Xena (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. На главной странице нажмите кнопку «Запустить Xena», чтобы войти в основной браузер анализа.
  3. В браузере Xena нажмите «DATA SETS».
  4. Среди наборов данных выберите «TCGA TARGET GTEx». Он содержит однородно обработанные данные RNA-Seq из нормальных тканей проектов TCGA и GTEx.
  5. На следующей странице нажмите «ВИЗУАЛИЗИРОВАТЬ».
  6. Определим переменную Фенотипа (выборочная группа). В разделе «Выберите первую переменную» выберите «Основную категорию» в типе данных Фенотипически.
  7. Нажмите «К ВТОРОЙ ПЕРЕМЕННОЙ». Затем в геномном типе данных поставьте галочку «Экспрессия генов» в наборе данных. Добавьте список генов в поле «Добавить ген или позицию». Нажмите «Готово».
  8. Визуализируйте узоры выражения с помощью тепловой карты.
  9. Чтобы отделить образцы груди (TCGA+GTEx) от TCGA TARGET GTEx, введите «Breast» и используйте фильтр для сохранения образцов.
  10. Тепловая карта теперь видна и её можно скачать в формате PDF.
  11. Создайте сравнительные бокс-графики для отдельных генов. Чтобы количественно оценить и визуализировать различия экспрессии для конкретного гена, используйте «View as chart». Используя эту опцию, данные можно рассматривать как коробчатый график, точечный график и скрипичный график, сравнивая распределение выражений между двумя группами выборок.
  12. Используйте опцию «Скачать в формате PDF», чтобы скачать диаграммы.
  13. Статистическую значимость (p-значение) можно получить, нажав на «СТАТИСТИКА».

3. Оценка прогностической значимости регуляторов m6A с помощью плоттера Каплана-Майера.

  1. Получите доступ к инструменту Kaplan-Meier Plotter. Перейдите на сайт Kaplan-Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis)30.
  2. На главной странице выберите вкладку «рак молочной железы», чтобы инициировать анализ, специфичный для наборов данных по раку молочной железы.
  3. Настройте генный запрос для одного гена.
  4. В разделе первичного входа найдите поле «Символ гена».
  5. Появляется официальный символ регулятора m6A, который подлежит анализу (например, METTL3).
    КРИТИЧНО: Прямо под окном ввода гена найдите и включите галочку «Only JetSet best probe set». Это гарантирует, что для вашего гена автоматически выбирается самый надёжный и специфический зонд, оптимизируя качество данных и воспроизводимость.
  6. Определите параметры анализа выживаемости. В разделе «Выживание» выберите «Общая выживаемость (OS) » как основную конечную точку для этого анализа. Инструмент автоматически использует данные от 1880 пациенток с раком груди при выборе этой настройки.
  7. Убедитесь, что опция «Разделить пациентов по» установлена на «медиана». Это разделит пациентов на две равные группы; Высокая и низкая экспрессия, основанные на медианном значении экспрессии запрашиваемого гена по всем образцам.
  8. Для выбора периода последующего наблюдения можно использовать «порог последнего наблюдения ». Для этого исследования был выбран 180 месяцев.
  9. Сгенерировать и интерпретировать график Каплана-Майера.
  10. Нажмите кнопку «Нарисовать график Каплана-Майера».
  11. Закроется новое окно, показывающее кривую выживания.
  12. Интерпретировать ключевые элементы сюжета; Ось X указывает время в месяцах, ось Y — вероятность общей выживаемости, две цветные линии — кривые выживаемости для групп пациентов с высокой экспрессией (красная) и низкой экспрессии (чёрный). Отображается логарифмическое значение P, указывающее на статистическую значимость разницы между двумя кривыми выживаемости.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мутационный ландшафт регуляторов метилирования m6a при раке молочной железы

В более раннем исследовании геномного анализа наборов данных TCGA было сообщено о повторяющихся мутациях в нескольких генах, кодирующих регуляторы метилированияДНК, 31. В настоящем исследовании cBioPortal был использован для анализа набора данных «Инвазивная карцинома молочной железы (TCGA, PanCancer Atlas)» с целью изучения мутационных профилей генов, кодирующих авторов, считыв...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Статья этого метода предлагает комплексный, доступный и интегрированный рабочий процесс для систематического мультиомического профилирования и клинической трансляции любой генной сигнатуры в исследованиях рака, продемонстрированный здесь через анализ регуляторов метилирования m6A РНК при раке молочной железы. Объединяя эти крупные публичные платформы биоинформатики, этот подход позволяет исследователям эффективно перейти от геномных открытий к клинически значимым гипотезам без необходимо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Части этой рукописи были переработаны с помощью языковых инструментов на базе искусственного интеллекта для повышения ясности и читаемости. Вся содержательная информация, интерпретация, анализ и выводы принадлежат авторам. Мы заявляем, что конфликта интересов нет.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Грант от Университета Альфайсал (IRG 25450) для RM, к счастью, признан.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalМемориальный онкологический центр Слоан-Кеттерингhttps://www.cbioportal.org
Генотип-Экспрессия тканей (GTEx)Консорциум GTExhttps://gtexportal.org
График Каплана-МейераЛаборатория Джёрфи/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
Атлас раковых геномов (TCGA)Национальный онкологический институт (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
Лаборатория UCSC XenaУниверситет Калифорнии в Санта-Крузhttps://xenabrowser.net

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

Related Articles