Изучение механизма использования гранулы Губэнь Пинчуань в лечении бронхиальной астмы

Краткое содержание

Этот протокол исследует механизм действия гранул Губен Пинчуань при бронхиальной астме с помощью сетевой фармакологии, молекулярного докинга и валидации in vivo .

Аннотация

В данном исследовании изучается механизм действия гранул Губэнь Пинчуань при лечении бронхиальной астмы с использованием сетевой фармакологии, молекулярного докирования и экспериментальной валидации. Активные ингредиенты и соответствующие мишени были выявлены с помощью баз данных TCMSP, HERB и SymMap. Мишени, связанные с астмой, были собраны из GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank и PharmGKB. Были выявлены перекрывающиеся мишени, а также построены сети взаимодействия компонент–мишень и взаимодействия белка (ИПП). Анализы обогащения генной онтологии (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) проводились с коррекцией коэффициента ложного открытия (FDR). Для оценки аффинности связывания проводилась молекулярная стыковка, затем валидация in vivo. Всего было выявлено 121 активный компонент и 234 мишеня, связанные с лекарствами, что дало 155 перекрывающихся целей. Основные цели включали TP53, AKT1, TNF и IL6. Анализ KEGG показал значительное обогащение сигнального пути PI3K–Act, который был выбран для экспериментальной валидации. Молекулярное стыкование выявило сильную связь между компонентами ядра и AKT1. У астматических крыс, индуцированных овальбумином, гранула Губен Пинчуань снижала уровень IL-4 и IL-10 в сыворотке, увеличивала экспрессию FoxP3 в ткани лёгких и повышала уровень мРНК PI3K и AKT. Эти данные показывают, что гранула Губен Пинчуань облегчает бронхиальную астму, модулируя сигнальный путь PI3K–Akt., регулируя воспалительные цитокины и усиливая функцию регуляторных Т-клеток.

Введение

Бронхиальная астма — это гетерогенное хроническое респираторное заболевание, характеризующееся воспалением дыхательных путей, гиперчувствительностью дыхательных путей, гиперсекрецией слизи и ремоделированием^{дыхательных путей 1}. Его патогенез включает сложные взаимодействия между активацией иммунных клеток, воспалительных медиаторов и несколькими сигнальными путями. Клинически астма проявляется с повторяющимся свистящим дыханием, одышкой, сдавлением в груди и кашлем. Воспаление дыхательных путей — это центральный механизм, лежащий в основе начала и прогрессирования заболевания, характеризующийся увеличением секреции провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, IL-4, IL-17 и TNF-α, инфильтрацией воспалительных клеток, включая эозинофилы и нейтрофилы, а также структурными изменениями, такими как пролиферация гладких мышц дыхательных путей, утолщение базальных мембран и гиперплазия слизистых^{желез 2˒3}. Эти патологические процессы в конечном итоге приводят к закупорке дыхательных путей и нарушению воздушного потока.

Патофизиология астмы регулируется несколькими взаимодействующими сигнальными путями, а не одним механизмом. Сигнальный путь PI3K–Akt играет ключевую роль в модулировании иммунного баланса, особенно оси Treg/Th17, регулируя экспрессию FoxP3. Этот путь также взаимодействует с сигнальными путями IL-17 и TNF, усиливая воспалительные реакции и ремоделирование дыхательных путей, способствуя гетерогенности заболеваний и устойчивости к^{лечению 3,4}. Эпидемиологические данные свидетельствуют о постоянном глобальном росте распространённости астмы: более 358 миллионов заболевших по всему миру и примерно 45,7 миллиона взрослых пациентов в^{Китае 5,6}. Современные стратегии лечения в основном основаны на ингаляционных агонистах β₂ и глюкокортикоидах; Однако эти терапии нацелены на ограниченные патологические механизмы и могут приводить к побочным эффектам и устойчивости к глюкокортикоидной устойчивости у некоторых пациентов. Дисрегуляция путей, таких как PI3K–Akt., связана с снижением терапевтической реакции, что подчёркивает необходимость многоцелевых терапевтических^{подходов 7,4}.

Традиционная китайская медицина (ТКМ) классифицирует астму как «синдром Сяо», который связан с дефицитом функций легких, селезёнки и почек, в сочетании с внешними патогенными факторами. Формулы ТКМ широко используются в лечении астмы благодаря их многокомпонентным и многоцелевым^{характеристикам 8,9}. В отличие от фармакологических агентов с одной целью, соединения ТКМ оказывают терапевтический эффект, координируя регуляцию нескольких биологических путей, что соответствует сложной патофизиологии^{астмы 10}. Сетевая фармакология предоставляет системный подход к анализу взаимодействий между компонентами лекарств, мишенями и путями заболевания, позволяя выявлять ключевые биоактивные соединения и молекулярные^{механизмы 11}. Молекулярное докирование дополнительно дополняет этот подход, оценивая аффинность связывания между малыми молекулами и целевые белки.

Гранула Губэнь Пинчуань — это традиционная китайская лекарственная формула, состоящая из восьми растительных компонентов, включая Ephedra sinica (трава эфедры), плод Psoralea corylifolia , семена Prunus armeniaca (абрикос), корень Pseudostellaria heterophylla , плод Perilla frutescens , лист Eriobotrya japonica (лист локваты), луковицу Lilium brownii и Epimedium brevicornum. Эта формула традиционно используется для укрепления жизненной энергии, вывода мокроты и облегчения хрипов. Предыдущие клинические исследования продемонстрировали его терапевтическую эффективность при бронхиальной астме, при этом уровень ответа выше по сравнению с традиционными методами^{лечения 12}.

Для прояснения основного механизма действия применяется интегрированный подход, сочетающий фармакологию сетей, молекулярное докирование и экспериментальную валидацию in vivo . Сетевая фармакология используется для выявления активных компонентов и потенциальных мишеней, связанных с бронхиальной астмой. Для оценки взаимодействий между ключевыми соединениями и белками-мишени применяется молекулярное стыковывание. Затем проводится экспериментальная валидация на животной модели для оценки регуляторного воздействия на критически важные сигнальные пути, особенно на путь PI3K–Akt. Этот подход направлен на предоставление механистических представлений о многоцелевых терапевтических эффектах гранулы Губэнь Пинчуань и поддержку её применения в лечении бронхиальной астмы.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Ляонинского университета традиционной китайской медицины (Одобрение No 21000042023058) и выполнялись в соответствии с институциональными рекомендациями. Исследовательские инструменты, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Базы данных и программное обеспечение

1. Получите доступ к следующим базам данных и программному обеспечению: TCMSP, HERB, SymMap, PubChem, STRING, GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank, PharmGKB, DAVID, UniProt и Cytoscape (версия 3.9.1).

2. Приобретение компонентных целей

1. Извлечь химические компоненты травы эфедры, семян абрикоса, корень псевдостеллярии, плода периллы, лист мушмуры, виды Lilium и эпимедиум из базы данных^{TCMSP 13}. Получить соединения Psoralea из баз данных HERB и SymMap.
2. Скрининг активных соединений с использованием пероральной биодоступности (OB ≥ 30%) и подобия препарата (DL ≥ 0.18)^14,15.
3. Прогнозировать целевые гены с помощью TCMSP. Стандартизируйте все цели с помощью базы данных UniProt, выбрав Homo sapiens. Удалять дублирующиеся и недействительные цели, включая нечеловеческие записи, неаннотированные белки и устаревшие идентификаторы.

3. Приобретение бронхиальных мишень для астмы

1. Ищите на GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank и PharmGKB по ключевому слову «бронхиальная астма». Установите показатель релевантности GeneCards на >4. Объедините все полученные цели и удалите дубликаторы.

4. Идентификация целей пересечения

1. Импортируйте мишени для лекарств и мишеней для заболеваний в онлайн-инструмент анализа Венна. Определите перекрывающиеся цели и зафиксируйте общее количество для последующего анализа.

5. Построение сети компонент–цель

1. Импортировать цели пересечения в Cytoscape 3.9.1. Постройте сеть компонент–цель. Регулируйте размер узла и цвет в зависимости от значений градусов.

6. Построение сети взаимодействия белков и белков (PPI)

1. Загрузите цели пересечения в базу данных STRING. Выберите Homo sapiens и установите уровень уверенности в ≥0.900. Экспортируйте сеть и импортируйте её в Cytoscape.
2. Вычислите топологические параметры (центральность степени, центральность промежуточности и центральность близкости). Определите основные цели по медианным порогам и степени >20.

7. Анализ обогащения GO и KEGG

1. Загрузите перекрывающиеся цели в базу данных DAVID или проанализируйте с помощью пакета R clusterProfiler.
2. Проведите анализ обогащения генной онтологии (GO) для категорий биологических процессов, клеточных компонентов и молекулярных функций.
3. Проведите анализ обогащения путей KEGG. Примените коррекцию коэффициента ложного обнаружения (FDR) и установите порог значимости на FDR < 0,05.
4. Визуализируйте лучшие обогащённые термины с помощью баровых или пузырьковых графиков.

8. Молекулярная стыковка

1. Скачайте 2D-структуры основных соединений с PubChem. Генерируйте 3D-структуры с помощью ChemOffice и сохраняйте как mol2-файлы.
2. Скачайте белковые структуры из базы данных RCSB PDB. Удалите молекулы воды и лиганды с помощью PyMOL.
3. Выполните молекулярную стыковку с помощью AutoDock Vina. Определите параметры grid box и запускайте симуляции стыковки.
4. Фиксировать энергии связывания (ккал/моль) и взаимодействующие остатки ключей. Визуализируйте результаты стыковки с помощью платформ молекулярного моделирования, визуализации и симуляции.

9. Экспериментальная валидация

1. Животные
   1. Заведите 48 самцов крыс Спрага–Доули (9 недель, вес 220–240 г). Домашние животные при 20–25 °C при влажности 55–60% при стандартных условиях.
2. Лекарства и реагенты
   1. Приготовьте гранулы Губен Пинчуань, состоящие из травы эфедры, псоралеи, абрикосового семян, корня псевдостелларии, плода периллы, листья мушмулы, лилиума и эпимедиума.
   2. Подготовьте дексаметазон, овальбумин (ОВА), гидроксид алюминия, наборы для ИФС, наборы для экстракции РНК и антитела, как указано в Таблице материалов.
3. Инструменты
   1. Подготовьте стандартное лабораторное оборудование, включая считыватель микропластин, систему электрофореза, микротом для парафина и систему визуализации.
4. Группировка и лечение животных
   1. Случайным образом распределите крыс на шесть групп (n = 8): пустая контрольная группа, модельная группа, группа дексаметазона (0,3 мг/кг), группа низкодозовой китайской медицины, группа средней дозы китайской медицины и группа с высокими дозами китайской медицины.
   2. На 1, 7 и 14 дни введите 1 мл внутрибрюшинной инъекции 10% OVA + 10% Al(OH)₃ крысам из модельной группы, низкодозовой китайской медицины, средней дозы китайской медицины, группы высоких доз китайской медицины и дексаметазона для сенсибилизации.
   3. Введите 1 мл внутрибрюшной инъекции 0,9% физиологического физиологического раствора крысам в контрольной группе с пустым тестом на 1, 7 и 14 дня.
   4. С 15 по 21 день выполняйте стимуляцию небулайзерной ингаляции один раз в день в течение 20 минут. Введение 5% ингаляции OVA крысам в модельной группе, низкодозовой китайской медицине, средней дозе китайской медицины, группе высоких доз китайской медицины и дексаметазона.
   5. С 15 по 21 день крысам ввели 0,9% физиологического небулизированного ингаляции с помощью физиологического раствора в контрольной группе.
   6. Назначайте лечение пероральной гаважей один раз в день с 22 по 36 день в зависимости от назначенной группы лечения.
   7. Ежедневно отслеживайте вес тела и общее состояние на протяжении всего эксперимента. Хронология экспериментов изложена в таблице 1.
5. Гистопатология
   1. Собирайте легкую ткань. Исправление, встраивание и срезные образцы. Проведите окрашивание гематоксилин–эозина.
   2. Проведите окрашивание по методу Массона для оценки отложения коллагена.
6. RT-ПЦР-анализ
   1. Извлекать полную РНК из ткани лёгких.
   2. Гомогенизация замороженной ткани лёгких при условиях ультранизкой температуры. После взвешивания образца быстро переложите его в предварительно охлаждённую ступку с жидким азотом и измельчите в порошок.
   3. Перенесите образец порошка в центрифугную трубку. Добавьте 1 мл TransZol UP и 0,2 мл реагента для экстракции РНК на каждые 50–100 мг ткани. Встряхните трубку при комнатной температуре 5 минут.
   4. Центрифугуйте образец при 1000 × г и 2–8 °C в течение 15 минут. Перенесите бесцветную водную фазу в новую центрифугную трубку.
   5. Добавьте 1 мл TransZol ДО 0,5 мл изопропанола. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 10 минут.
   6. Центрифугуйте образец при 1000 × г на 10 минут. Добавьте 1 мл этанола 75% и снова центрифугуйте на 5 минут.
   7. Сбросьте супернатант и высушите осад на воздухе при комнатной температуре в течение 5 минут. Растворить осадок в 50–100 мкл раствора РНК, затем инкубировать в течение 10 минут.
   8. Храните образец при −70 °C для длительного сохранения.
   9. Синтезировать кДНК и провести количественную ПЦР для измерения экспрессии PI3K и AKT.
7. ЭЛИЗА
   1. Размораживание образцов сыворотки при 4 °C. Измеряйте уровни IL-4 и IL-10. с помощью наборов ELISA согласно инструкциям производителя.
8. Иммуногистохимия
   1. Фиксированная ткань лёгких с 4% параформальдегида, встроенная в парафин, нарезана, очищена от воска и гидратирована.
   2. Проведите забор, блокировку и инкубацию антител. Окрашивание согласно набору для иммуногистохимии FoxP3, раствор для окрашивания DAB и положительная экспрессия выглядят как коричневато-жёлтая или тёмно-коричневая окрашивание.
   3. Наблюдайте и фотографируйте под микроскопом, а также используйте программное обеспечение Image J для количественного статистического анализа экспрессии FoxP3.
9. Статистический анализ
   1. Нормальность тестовых данных с помощью теста Шапиро–Вилка и однородность дисперсии с помощью теста Левена.
   2. Анализируйте данные с помощью односторонних ANOVA или непараметрических тестов по мере необходимости. Выражайте данные как среднее ± стандартное отклонение.
   3. Определите p < 0,05 как статистически значимое. ★★p < 0,01 и ★p < 0,05 против контрольной группы; ◆◆p < 0,01 и ◆p < 0,05 по сравнению с группой моделей; ##p < 0.01 и #p < 0.05 против группы дексаметазона.

Таблица 1: Экспериментальная хронология. График повышения чувствительности, вызовов и процедур лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Результаты

Скрининг активных ингредиентов
В базе данных TCMSP было выявлено всего 121 активный компонент после фильтрации по целевой активности. Среди них было 23 компонента из травы Ephedra , 7 из Psoralea, 19 из семян абрикоса, 8 из корня Pseudostellaria , 16 из плодов Perilla, 18 из листа мушмулы, 7 из лилиума и 23 из Epimedium. (Таблица 2). Были выявлены шестнадцать распространённых компонентов, включая лютеолин, ...

Обсуждение

Бронхиальная астма — распространённое заболевание в^{респираторных отделах 16}. Это обструктивное заболевание дыхательных путей, вызванное аллергенами и гиперотзывчивостью^{дыхательных путей 17}. Она имеет высокую клиническую частоту, склонна к рецидивам и трудно вылечена, что значительно влияет на здоровье и качество жизни пациентов. Глобальная инициатива по астме 2025 года (GINA) сообщает, что ингаляционная терапия глюкокортикоидами эффективна ...

Материалы

```html

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
qPCR Kit	Novogene	NQ-001, 2×1mL	Обнаружение относительного выражения мРНК целевых генов
aluminum hydroxide Al(OH)3	Shanghai Yubo Biotechnology Co., LTD	YB-AL001, 500г	Иммунологический адъювант для повышения иммунного ответа на антиген
BCA protein Concentration Test Kit	Fode Biotechnology Co., LTD	FD2001, 100 штук в коробке	Количественное определение общего белка для стандартизации загрузки образца
Chemiluminescence imaging system	Tanon	5200Multi	Изображение ленты WB, сбор и анализ изображений гелей и блотов
Color Pre-stained Protein Marker	Biolaibo Technology Co., LTD	BL005, 10-180кДа, 500μЛ	Справочный белковый молекулярный вес для электрофоретических экспериментов
Enhanced RNA Extraction Kit	Whole Golden Branch	ET111-01v2, 50 штук в коробке	Извлечение и очистка общей РНК из тканей и клеток
Enzyme-linked immunosorbent assay reader	U.S. Biotek Company	Epoch/BioTek	Количественное определение цитокинов и содержания белка в образцах
FOXP3 primary antibody	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	AG5002, 50мкл/штука	Целевая связь с белком FOXP3 для иммуноанализа
Gel Rapid Preparation Kit	Shanghai Yamei	PG212, 30 комплектов	Быстрая подготовка разделительного геля и накапливающего геля для электрофореза
masson Staining Kit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1340, 100 таблеток	Специфическое окрашивание для наблюдения за коллагеновыми волокнами тканей и фиброзом
OVA	Beijing Boaotoda Technology Co., LTD.	OVA-10г, ≥98%	Классический аллерген для создания аллергических моделей животных
primary Antibody Dilution solution	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	P0256-100мл	Разбавление первичного антитела, поддержание активности и снижение неспецифической связи
Rat IL-10ELISA Kit	Andy Bio	E-30649, 96T	Количественное определение антивоспалительного фактора IL-10 у крыс
Rat IL-4ELISA Kit	Andy Bio	E-30623, 96T	Количественное определение воспалительного фактора IL-4 Th2 у крыс
Reverse Transcription Kit	Baori Medical Technology Co., LTD	E047-01A	Обратная транскрипция РНК в комплементарную ДНК для последующего генного анализа
Saturated Oil Red O Kit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1261, 50мЛ×2 бутылки	Специфическое окрашивание и обнаружение жировых капель в тканях
Shangyang Anti-Rabbit Secondary Antibody	Proteintech Biological Co., LTD	SA00001-2, 1мЛ	Связывание с первичным антителом кролика для цветовой реакции WB
TBST Buffer	Wuhan Sewell Biotechnology Co., LTD	G2150, 1л / бутылка	Буфер для мойки мембраны и разбавления антител в Western blot
Transfer Electrophoresis System	Shanghai Jingcanshi Precision Machinery Co., Ltd.	PowerPac Basic	Используется для электрофореза белков и переноса мембраны в Western blot
Ultra-low temperature refrigerator	Zhongke Meiling	MDF-382	Криоконсервация реагентов, образцов белка и тканей при низкой температуре
Vertical electrophoresis tank	BIO-RAD	JY-ZY5	Вертикальная электрофоретическая разделительная установка для белков и нуклеиновых кислот

```