Методическая статья

Система контротбора на основе токсинов для удаления генов без маркеров и высокоплотного транспозоновного мутагенеза Tn5 у Pectobacterium brasiliense

DOI:

10.3791/70567

⸱

9 июня 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Biocontrol, School of Agriculture and Biotechnology, Sun Yat-sen University, 2Potato Engineering ' Technology Research Center, Inner Mongolia University, 3Urumqi Experimental School, 4Department of Plant Pathology and Weed Research, Agricultural Research Organization-Volcani Institute, 5Chinese Academy of Agricultural Sciences, Institute of Vegetables and Flowers

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для генерации немаркированных делеций генов и создания общегеномных библиотек мутантов Tn5 для вставки Tn5 у Pectobacterium brasiliense — фитопатогена, ответственного за картофельную чёрную ногу и мягкую гниль. Этот подход позволяет эффективно проводить обратный генетический анализ и способствует функциональной характеристике генов, связанных с вирулентностью, в организме.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пектобактерия brasiliense — это высокопатогенная бактерия, ответственная за мягкую гниль клубней картофеля, чёрную ногу и гниль воздушного стебля. Выяснение его патогенных механизмов крайне важно для контроля заболеваний; однако генетические инструменты для этого организма остаются ограниченными. Была разработана система контрселекции на основе токсинов для обеспечения безмаркерной делеции гена и высокоплотного транспозоновного мутагенеза Tn5. Токсин vmi480, полученный из плазмиды pLP12, использовался в качестве маркера контрселекции для построения самоубийственного вектора pKV2. С помощью этой системы ген recA из штамма P. brasiliense SM был успешно удален. Получившийся мутант recA служил родительским штаммом для создания библиотеки вставки Tn5, включающей более 12 000 мутантов, посредством конъюгации с помощником RHO3, несущим pKV2-LLtnp. В этой производной плазмиде токсин vmi480 был заменён гиперактивной транспозазой Tn5 под контролем наружу промотора lac для снижения полярных эффектов. Высокопроизводительные анализы инокуляции клубней позволили выявлять мутанты с дефицитом патогенности, включая вставки в систему секреции типа II — ключевой фактор вирулентности, который опосредует секрецию ферментов, разрушающих клеточные стенки растений. Эта платформа поддерживает функциональную геномику и облегчает изучение механизмов вирулентности у этого экономически значимого патогена.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P. brasiliense — один из самых агрессивных видов рода Pectobacterium и является причинником мягкой гнили картофеля, черноногий и воздушной гнилистебля 1. Эти болезни приводят к примерно 30% потере урожайности картофеля, который занимает третье место по значимости источник питания в мире и является ключевым компонентом сельскохозяйственной системыКитая 2. Несмотря на экономическое воздействие, молекулярные механизмы, определяющие патогенность P. brasiliense, остаются недостаточно изученными, главным образом из-за отсутствия эффективных и воспроизводимых инструментов генетической манипуляции для этоговида 3,4,5.

Функциональные геномные исследования у многих фитопатогенных бактерий основаны на устойчивых системах аллельного обмена и транспозонных мутагенеза; однако сопоставимые генетические инструменты для P. brasiliense остаются ограниченными или неэффективными. В частности, эффективных маркеров контротбора, совместимых с этим видом, мало. В то время как ген sacB широко используется как маркер контрселекции для удаления генов у различных бактерий, P. brasiliense может демонстрировать высокую толерантность до 50% сахарозыв процессе отбора 5. Эта толерантность, вероятно, отражает недостаток чувствительности к токсинам, возможно, из-за ферментативного превращения сахарозы в сахарные полимеры. Кроме того, высокие концентрации сахарозы могут вызывать вредный осмотическийшок 6. Кроме того, эффективные крупномасштабные методы мутагенеза, такие как построение библиотеки вставки транспозонов Tn5, пока не были хорошо изучены для этого организма.

Для решения этих технических ограничений была разработана система противоотбора на основе токсинов и надёжный рабочий процесс скрининга мутагенеза Tn5 для P. brasiliense. По сравнению с традиционными методами на основе сахарозы, этот подход на основе токсинов обладает явными преимуществами, включая повышенную жёсткость отбора, улучшенную специфичность при выявлении событий двойного кроссовера и устранение смешанного осмотического стресса. Похожие системы на основе токсинов vmi480 были успешно реализованы для преодоления барьеров отбора у Vibrio 7. Установленная методология широко применима для высокопроизводительной функциональной характеристики неизвестных генов и предоставляет универсальную платформу, которую можно адаптировать к другим родственным мягким гниению Pectobacteriaceae.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Генерация мутанта удаления recA без маркеров у P. brasiliense

  1. Извлекать геномную ДНК из плазмиды P. brasiliense SM и pKV2 (pLP12, полученного с модификацией маркера отбора антибиотиков и множественного участка клонирования) из донорского штамма E. coli с использованием стандартных процедур подготовки ДНК.
  2. Проверьте качество и концентрацию экстракционной геномной и плазмидной ДНК с помощью агарозного геля электрофореза и спектрофотометрии NanoDrop.
  3. Линеаризуйте плазмиду pKV2 с помощью двойного переваривания с помощью EcoRI и NheI при 37 °C в течение 5 часов. Проверьте полное переваривание с помощью агарозного геля электрофореза и очистите линеаризованную плазмиду.
  4. Определить примерно 800 участков с точки зрения гена RecA вверх и ниже гена RecA с помощью программного обеспечения для анализа генома и спроектировать соответствующие пары праймеров LBF/LBR и RBF/RBR (см. таблицу материалов для всех используемых в этом исследовании праймеров).
  5. Усилить обе гомологичные руки при стандартных условиях циклирования ПЦР и очистить продукты ПЦР. ПЦР с объёмом 50 мкл обычно даёт 2,5 мкг продукта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения Tm и содержание GC в праймерах могут быть корректированы путём изменения границ гомологичных областей.
  6. Собрать рекомбинантную самоубийственную плазмиду pKV2-recA с помощью комплекта для сборки ДНК, связывая очищенные гомологичные руки с линеаризованным плазмидным хребтом.
  7. Преобразование сборочной смеси в химически компетентные клетки E. coli S17-1 λpir с помощью теплового удара, извлечение клеток в LB-среде и нанесение на LB-агар, содержащий канамицин (LB + kan).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные используемые концентрации: 50 мг/мл канамицина, 0,2% (w/v) глюкозы, 0,3% (w/v) арабиноза и 0,3 мМ 2,6-диаминопимелиновой кислоты (DAP).
  8. Подтверждайте положительные клоны с помощью рестриктивного пищеварения или ПЦР с колониями. (См. Таблицу материалов для всех рецептов, использованных в этом исследовании).
  9. Извлечь подтверждённую плазмиду pKV2-recA и преобразовать её в E. coli WM3064 с помощью теплового шока (ожидаемая скорость превращения > 106 cfu/мкг).
  10. Выберите трансформаторы на ЛБ-агаре, содержащие канамицин и диаминопимелиновую кислоту (DAP).
  11. Проведите бипарентальную конъюгацию, смешивая ночные культуры донорского штамма (WM3064 pKV2-recA) и реципиента P . brasiliense SM в соотношении 1:1 (v/v), обычно получая от 104 до10 6 трансконъюгантов на миллилитр клеток донора и реципиента.
  12. Промыйте смешанную культуру стерильной водой, нанесите её на LB агар с добавлением канамицина и DAP, и инкубуйте при 28 °C в течение 48–72 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если трансъюгантов не наблюдаются, соотношение донор-реципиент может быть увеличено до 2:1 (v/v) для повышения эффективности конъюгации. Если наблюдается высокий фоновый рост, остатки DAP можно удалить, дважды промывая смешанную культуру стерильной водой.
  13. Восстанавлите конъюгационную смесь и поставьте на LB-агар, содержащий канамицин и глюкозу (без DAP) для встречного отбора.
  14. Выберите 6–8 колоний и нанесите их на LB + kan и LB + kan + arabinose.
  15. Выберите колонии, которые растут на LB + kan, но не выращиваются на LB + kan + арабинозе; Это кандидаты первого кроссовера.
  16. Инокулят подтвердил первые кроссоверные штаммы в среднюю часть LB и инкубировался ночью. Посевы наносят на LB агар, содержащий L-арабинозу, чтобы вызвать вторую гомологичную рекомбинацию.
  17. Выберите несколько колоний и нанесите их на LB + арабиноза и LB + кан. Выберите колонии, которые растут на LB + арабинозе, но не на LB + kan; это предполагаемые мутанты с делецией RecA .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если после второго кроссовера колоний не наблюдается, следует оценить потенциальную значимость целевого гена для роста бактерий. Альтернативно, верхние и нижние гомологичные области могут быть расширены до 1200 бп для повышения эффективности гомологичной рекомбинации.
  18. Подтвердите наличие мутантов RecA с помощью ПЦР колонии с помощью пары праймеров checkF/checkR, предназначенных для амплификация по регионам промотора RecA и терминатора с целью проверки удаления целевой гена в системе памяти. Секвенируйте продукт ПЦР для подтверждения точного удаления recA в кадре.
  19. Успешное удаление обозначается уменьшением размера продукта ПЦР, который должен соответствовать длине фрагмента дикого типа минус удельной длине удалённого сегмента гена.

2. Конструкция pKV2-LLtnp для мутагенеза Tn5 у P. brasiliense

  1. Амплифицировать кассету транспозазы Tnp из pMCS2-LLtnp8 с помощью пары праймеров Tnp-F/Tnp-R и усилить основной каркас oriγR6K Tn5 из pKV2 с помощью пары праймеров ori-F/ori-R. Очищайте все продукты ПЦР с помощью комплекта для очистки ДНК.
  2. Собрать очищенную кассету Tnp и основную основу oriγR6K Tn5 с помощью комплекта для сборки ДНК. Преобразование сборочной смеси в химически компетентные клетки E. coli S17-1 λpir с помощью теплового удара, восстановление в LB-среде и нанесение на LB-агар с добавлением канамицина (LB + kan).
  3. Валидация положительных клонов с помощью ПЦР колонии с использованием пар праймеров ori-F/ori-R и Tnp-F/Tnp-R.
  4. Подготовьте клетки, соответствующие E. coli RHO3, инокуляцируя одну колонию в среду LB и инкубировав их ночью. Разведите культуру 1:100 до свежей LB среды и выращите доOD 600 при 0.6.
  5. Охлаждайте культуру на льду и трижды промывайте клетки предварительно охлаждённой 0,1 M CaCl₂. Суспензировать конечную гранулу в 500 мкл предварительно охлаждённого 20% глицерина и хранить при −80 °C.
  6. Преобразовать 10 мкл валидированной рекомбинантной плазмиды (pKV2-LLtnp) в 100 мкл ячеек, способных к RHO3, с помощью теплового удара (ожидаемая скорость превращения > 106 cfu/мкг). Инкубировать на льду 30 минут, поддержать тепловой шок при 42 °C 45 секунд, затем остыть на льду 2 минуты.
  7. Добавьте 500 мкл LB среды и инкубуйте при 37 °C в течение 1 часа с перемешиванием. Поставьте на LB агар, содержащий канамицин и DAP (LB + кан + DAP), и инкубировать при 37 °C ночью.
  8. Валидация положительных RHO3-трансформаторов с помощью ПЦР с использованием Tnp-F/Tnp-R.

3. Создание библиотеки мутантов транспозона Tn5 у P. brasiliense

  1. Выращивать P. brasiliense ΔrecA в среде LB при 28 °C и выращивать RHO3/pKV2-LLtnp в среде LB с добавлением канамицина и DAP (LB + kan + DAP) при 37 °C. Позволить обоим штаммам достичьOD 600 из 1.
  2. Смешайте 100 мкл P. brasiliense ΔrecA со 100 мкл RHO3/pKV2-LLtnp, центрифугуйте смесь, сбросьте супернатант и повторно суспензируйте промытую гранулу в 10 мкл LB-среды.
  3. Поставьте восстановленную смесь на LB агар с добавлением DAP и инкубировать при 28 °C в течение 8 часов для конъюгации.
  4. Восстанавливайте конъюгационную смесь, промывая поверхность пластины стерильной LB средой объемом 1 мл. Ненадолго центрифугайте, сбросьте супернатант и дважды промыйте гранулу LB средой, чтобы удалить DAP.
  5. Суспензировать промытую гранулу в среде 300 мкл ЛБ и сделать 10-кратное серийное разбавление на ЛБ-агар с добавлением канамицина и глюкозы (LB + кан + глюкоза; без DAP) для выбора трансконъюгантов.
  6. Инкубировать тарелки при 28 °C в течение 48 часов. Выберите пять колоний и проверьте каждую с помощью ПЦР колонии, используя пары праймеров ori-F/ori-R и Tnp-F/Tnp-R, чтобы подтвердить успешное введение транспозона Tn5. Секвенируйте все пять колоний для подтверждения вставки Tn5 в геном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: До формального создания библиотеки мутантов шесть отдельных колоний случайным образом выбирались из пластины спряжения. Для определения мест вставки были проведены анализы спасения плазмид, используя два разных рестрикционных фермента отдельно как две параллельные контрольные группы. Всего было получено 36 последовательных чтений. Одно событие вставки Tn5 верифицировалось только тогда, когда шесть мест вставки для каждой отдельной колонии были идентичны.
  7. Оцените ёмкость библиотеки мутантов, повторяя шаг спряжения и подсчитывая количество колоний. Обеспечить, чтобы общий размер библиотеки превышал 12 000 колоний для достижения достаточного геномного покрытия для дальнейшего скрининга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается низкая частота мутагенеза, следует рассмотреть возможность использования гиперактивного варианта Tn5-транспозазы, такого как мутант E54K/M56A/L372P, для повышения эффективности транспозиции.
  8. Переместить отдельные мутантные колонии, полученные на этапе 6, в пластины с 96 лунками, содержащие 200 мкл LB + кан на одну скважину. Инкубировать тарелки ночью при 28 °C с встряхиванием при 200 об/мин.
  9. Добавьте 133 мкл стерильного 50% глицерина в каждую скважину для достижения конечной концентрации примерно 20%. Запечатайте и храните пластины с 96 лунками при −80 °C для длительного сохранения.

4. Высокопроизводительные анализы патогенности с помощью инокуляции картофельных клубней и горшок

  1. Приготовьте клубни картофеля (см. Favorita), промывая стерильной водой, ненадолго окуняя в 75% этанола и сушив на чистом столе. Нарежьте клубни на куски толщиной ~8 мм и положите их в стерильные чашки Петри толщиной 90 мм. Подготовьте как минимум три ломтика для биологических репликат.
  2. Инокуляция по 1 мкл каждого мутантного штамма на ломтики картофеля с помощью многоканальной пипетки, следуя схеме пластин 96-ячественной библиотеки мутантов. Включите P. brasiliense ΔrecA как положительный контроль, а LB + kan — как отрицательный контроль.
  3. Инкубировать инокуляционные дольки картофеля при 28 °C в течение 7–8 часов. Рекордные мутанты демонстрируют заметно уменьшенную мацерацию или меньшие участки поражения по сравнению с контролем ΔrecA . Измерите площадь поражения, измерив её длину и ширину. Назначьте их кандидатами на первичный скрининг.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что значенияOD 600 в мутантных культурах и контролях были нормализованы до 0,8 до вакцинации.
  4. Для вторичного скрининга инокуляйте 5 мкл каждого кандидата на свежие ломтики картофеля (6 штаммов на ломтик, равные расстояния). Подготовьте три биологических реплики для каждого сорта. Инкубировать при 28 °C в течение 7–8 часов и фиксировать размеры поражений для подтверждения затухания.
  5. Изолируйте штаммы, демонстрирующие стабильное снижение вирулентности, путём нанесения их на пластины LB + кан. Инкубировать пластины при 28 °C ночью и хранить валидированные мутанты с пониженной вирулентностью при 4 °C для дальнейшего анализа.
  6. Для валидации на целом растении инокуляйте стебли картофеля с 150 мкл бактериальных суспензией, нормализуйте до 1 x 108 CFU/mL. Введите суспензии в базальную область стебля с помощью стерильного шприца. Наблюдайте развитие болезни через 48 часов. Проведите биологические репликации на трёх отдельных растениях.
  7. Оценивайте тяжесть заболевания с помощью шкалы оценки болезни Blackleg («6-балльная ординальная шкала: 0, 1, 3, 5, 7, 9») и рассчитывайте индекс болезни как:
    1. Степень 0: Нет симптомов болезни на всём растении.
    2. Степень 1: Поражения стебля покрывают не более 1/3 окружности стебля, и/или отдельные листья увядают.
    3. Степень 3: Поражения стебля покрывают не более половины окружности стебля, и/или менее половины листьев имеют лёгкое увядение, и/или на нескольких нижних листьях есть поражения.
    4. Степень 5: Поражения стеблей покрывают более половины окружности стебля, и/или более половины листьев имеют лёгкое увядение.
    5. Степень 7: Поражения стебля охватывают всю окружность стебля, и/или более 2/3 листьев увядают.
    6. 9-й степень: Все листья растения увяли или погибли.
      Уравнение 1
  8. Подготовьте запасы для длительного хранения подтверждённых атенуированных мутантов, смешивая культуры с равным объёмом стерильного 50% глицерина до конечной концентрации 25%, и храните при -80 °C.

5. Идентификация мест введения Tn5 методом спасения плазмид

  1. Вырастить интересующего мутанта Tn5 и извлечь геномную ДНК с помощью набора для экстракции бактериального генома. Количественно измерить концентрацию ДНК, чтобы обеспечить достаточный вход для дальнейшего переваривания.
  2. Расщепить 1–2 мкг геномной ДНК с EcoRI в реакции 100 мкл, содержащей буфер реакции 10× и 5 мкл фермента, и инкубировать смесь при 37 °C минимум 3 часа. Проверьте завершенность пищеварения с помощью агарозного геля.
  3. Осадьте переваренную ДНК, добавив 1/10 объёма 3 млн ацетата натрия и 3 объёма абсолютного этанола. Тщательно перемешайте и инкубуйте при -20 °C в течение 1 часа.
  4. Центрифугуйте при 13 500 г в течение 5 минут и последовательно промывайте гранулы 75% этанола и абсолютного этанола. Высушите пеллеты на воздухе и повторно взвешайте в 17 мкл стерильной воды.
  5. Самолигировать переваренные фрагменты ДНК путём добавления 2 мкл буфера 10× T4 ДНК-лигазы и 1 мкл T4 ДНК-лигазы. Включите отрицательный контроль (без лигазы) для проверки фоновых трансформаций. Инкубировать реакцию связывания при 4 °C ночью для стимулирования циркуляризации рестрикционных фрагментов.
  6. Преобразовать 10 мкл лигационной смеси в химически компетентный E. coli S17-1 λpir с помощью теплового шокового преобразования, как описано ранее. Восстанавливайте клетки в LB в течение 1 часа и наносите на LB агар, содержащий канамицин (LB + kan), чтобы выбрать плазмиды с кассетой Tn5.
  7. Выберите пять случайных колоний, устойчивых к канамицину, и извлеките ДНК плазмиды с помощью стандартного минипреп-набора для плазмид. Проверьте структуру плазмиды, переварив 500 нг каждой плазмиды с помощью HindIII и инкубировав при 37 °C в течение 5 часов. Анализировать паттерны пищеварения с помощью агарозного гелевого электрофореза.
  8. Если размеры плазмидных полос совпадают с ожидаемыми фрагментами, выполните секвенирование Сэнгера с использованием 5' ME праймера, расположенного в концах Tn5.
  9. Определите точное место вставки Tn5, выравнив фланкирующую последовательность 50-100 б.п. ниже по течению от области Tn5 5'-ME с геномом SM P. brasiliense с помощью программного обеспечения BLAST или геномного анализа.
  10. Подтвердите, что все пять независимых реакций секвенирования для каждого мутанта отображаются на одну и ту же геномную координату (> 98% идентичности последовательностей).
  11. Если любая из пяти реакций секвенирования соответствует другой геномной координате, это указывает на наличие нескольких сайтов вставки Tn5 в этом мутанте. В таких случаях проанализируйте дополнительные колонии, чтобы определить все позиции вставки. В качестве альтернативы выполните южное блотирование или секвенирование целого генома, чтобы получить более точное картирование места вставки.
  12. Обозначить мутанты с единым, стабильным сайтом вставки во всех реакциях секвенирования как подлинные мутанты Tn5 с одной, подходящие для последующих фенотипических или генетических анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для преодоления нестабильности, вызванной мутацией sucB у P. brasiliense, в качестве контр-отбора использовался токсин vmi480 из плазмиды pLP12, а модифицированный самоубийственный вектор pKV2 (рисунок 1A) был создан путём замены кассеты с резистентностью к антибиотикам и корректировки конфигурации сайта клонирования. Для генерации мутантного делеции без маркеров recA было клонировано в pKV2 с помощью ~800 гомологичных ветвей гена recA в pKV2, после чего п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стратегия генетической манипуляции, разработанная в этом исследовании, предоставляет возможность функциональной геномики у P. brasiliense, основного патогена мягкой гниликартофеля 9,10. Интегрировав систему противоотбора на основе токсинов в основу плазмиды самоубийства, был создан мутант ΔrecA без маркеров. Этот подход обладает значительными преимуществами по сравнению с традиционными системами на базе sacB...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32472504 и 32561143029 к X.Z., 32201914 J.W.), Фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований Гуандуна (2024A1515012708 по X.Z), Фондом естественных наук Внутренней Монголии (2024QN03044 до U.H.) и Программой талантов Pearl River (2021QN02N151 по X.Z.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для извлечения геномной ДНК бактерийИзвлечение геномной ДНК бактерийTiangenDP302-02
Диаминопимеловая кислота0,3 мМ в 1 л средыMacklinD836611-5g
Набор для ассемблежа ДНКАссемблеж ДНКVazymeC116-02
Набор для очистки ДНКОчистка ДНКTiangenDP214-02
Канамицин50 мг/млAladdinK103025-25g
Глюкоза0,2% (w/v)AladdinG116305-250mg
Триптон10% в 1 л средыOXOIDLP0042B
Экстракт дрожжей5% в 1 л средыOXOIDLP0021B
NaCl10% в 1 л средыBiofroxx1249KG001
Агар15% в 1 л средыBiofroxx8211GR500
L-арабиноза0,3% (w/v)AladdinA106196-25g
Набор для мини-препаративной изоляции плазмидИзвлечение плазмидTiangenDP103-02
EcoRIРестриктазаYugong BiotechEG15536
NheIРестриктазаYugong BiotechEG15552
HindIIIРестриктазаYugong BiotechEG15539
T4 ДНК-лигазаЛинейная самоциркуляция ДНКYugong BiotechEG15205
ЦентрифугаRWDM1324R
ПЦР-аппаратBIO-GENERGET3XG
Цифровая камераSONYILCE-7M4
Электрофорезный аппаратLYDYY-6C
Водяная баняJOANLABWB100-1F
Система документации гелейThermo Fisher ScientificiBright CL750
АвтоклавYamatoSQ510C
Инкубатор с вращаниемZHICHUZQZY-AR8
Инкубатор с постоянной температуройZQDHP-9272
NanoDropThermo Fisher ScientificLite Plus
УФ-Вис спектрофотометрHITACHIU-3900
ЭлектропораторBIO-RADMicroPulser
Штаммы и плазмиды
P. brasiliense SMПатогенные бактерии картофеляКоллекция лабораторных штаммов
E. coli S17-1 λpirКомпетентные клетки E. coliWEIDIDL2010S
E. coli WM3064Компетентные клетки E. coliBIO SCI BIOC1039
E. coli RHO3Компетентные клетки E. coliКоллекция лабораторных штаммов
pKV2Модифицирванная самоубийственная плазмида Создана в рамках данного исследования
pLP12самоубийственная плазмидаКоллекция лабораторных штаммов
pMCS2-LLtnpОбеспечить фрагмент, несущий Tn5Коллекция лабораторных штаммов
pKV2-LLtnpМодифицирванная плазмида, несущая фрагмент Tn5.Создана в рамках данного исследования
Примеры
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)На заказ
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)На заказ
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)На заказ
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)На заказ
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)На заказ
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)На заказ
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)На заказ
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)На заказ
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)На заказ
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)На заказ
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)На заказ

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martínez-Prada, M. D. M., Curtin, S. J., Gutiérrez-González, J. J. Potato improvement through genetic engineering. GM Crops Food. 12 (1), 479-496 (2021).
  2. Wang, N., Reidsma, P., Pronk, A. A., de Wit, A. J. W., van Ittersum, M. K. Can potato add to China’s food self-sufficiency? The scope for increasing potato production in China. Eur J Agron. 101, 20-29 (2018).
  3. Sun, Y., et al. Comparative genomic and transcriptome analyses of two Pectobacterium brasiliense strains revealed distinct virulence determinants and phenotypic features. Front Microbiol. 15, (2024).
  4. Liu, Y., Filiatrault, M. J. Complete genome sequence of the necrotrophic plant-pathogenic bacterium Pectobacterium brasiliense 1692. Microbiol Resour Announc. 9 (12), e00037-20(2020).
  5. Moleleki, L. N., Pretorius, R. G., Tanui, C. K., Mosina, G., Theron, J. A quorum sensing-defective mutant of Pectobacterium carotovorum ssp. brasiliense 1692 is attenuated in virulence and unable to occlude xylem tissue of susceptible potato plant stems. Mol Plant Pathol. 18 (1), 32-44 (2017).
  6. Polyudova, T., Eroshenko, D., Korobov, V. The effect of sucrose-induced osmotic stress on the sensitivity of Escherichia coli to bacteriocins. Can J Microbiol. 65 (12), 895-903 (2019).
  7. Luo, P., He, X., Liu, Q., Hu, C. Developing universal genetic tools for rapid and efficient deletion mutation in Vibrio species based on suicide T-vectors carrying a novel counterselectable marker, vmi480. PLoS One. 10 (12), e0144465(2015).
  8. Lv, W., et al. Essential gene dynamics across distinct growth conditions in Xanthomonas citri. Hortic Res. 12 (9), uhaf160(2025).
  9. Toth, I. K., Bell, K. S., Holeva, M. C., Birch, P. R. J. Soft rot erwiniae: from genes to genomes. Mol Plant Pathol. 4 (1), 17-30 (2003).
  10. Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 13 (6), 614(2012).
  11. Pineau, C., et al. Structure-function analysis of pectate lyase Pel3 reveals essential facets of protein recognition by the bacterial type II secretion system. J Biol Chem. 296, 100305(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

recAII
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи