Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Система in vitro для применения растягивающей силы на скелетные стволовые клетки с использованием циклической системы напряжения клеток

47 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70570

⸱

12 июня 2026 г.

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Emergency and Trauma of Ministry of Education, Hainan Academy of Medical Sciences, Hainan Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Стволовые стволовые клетки скелета (SSC) у мышей были выделены методом FACS и культивированы in vitro. Была создана контролируемая экспериментальная система для применения циклической растягивающей механической стимуляции к SSC, что привело к снижению экспрессии генов, связанных с клеточным старением, в частности p16 и p21.

Аннотация

Кость — это важный механочувствительный орган, который постоянно реагирует на физические сигналы в организме. Хотя механическая стимуляция играет важную роль в развитии скелета, гомеостазе и восстановлении травм, специфические ответы скелетных стволовых клеток (SSC) на механический стресс остаются неполностью изученными. Чтобы ответить на этот вопрос, мы создали модель in vitro для выделения периостальных SSC мышей и применения механической стимуляции. Клетки периостальной клетки мышей впервые были получены ферментативным расщеплением, а SSC впоследствии были выделены с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) на основе установленных поверхностных маркеров. После прикрепления к культуре SSC подвергались растягивающей механической стимуляции с использованием циклической системы натяжения-напряжения клеток. Эта система позволяет воспроизводимо применять растягивающую силу к культивируемым клеткам и предоставляет платформу для анализа ответов SSC на механический вход. Используя этот подход, мы обнаружили, что экспрессия генов, связанных с клеточным старением , p16 и p21 , значительно снижалась в SSC после механической стимуляции. Эти результаты свидетельствуют о том, что растягивающая стимуляция может влиять на изменения, связанные с старением, в SSC при условиях in vitro . В целом, этот протокол предоставляет полезную и подходящую платформу для изучения поведения SSC под механической стимуляцией и для изучения того, как механические сигналы влияют на функцию SSC.

Введение

Будучи самым крупным и важным поддерживающим органом в человеческом теле, скелетная система не только обеспечивает места прикрепления и защиту других органов, но и служит основой для моторной функции. Поэтому скелетная система постоянно подвергается воздействию различных механических стимулов как внутренних, так и внешних сред. Сигналы механической стимуляции не менее важны для развития костей и поддержания её функциональности. Ещё в 1893 году было предложено предположить, что существует определённая положительная корреляция между плотностью костей и механической силой, которую они испытывают, что соответствует законуВольфа 1. В последние годы некоторые исследования показали значимость того, что скелетная система, несущая механические силы, для нормального развития костей 2,3,4,5. Реакция скелетной системы на механическую силу частично зависит от клеточных компонентовкости 6. Остеоциты составляют от 85% до 90% клеточных компонентов скелетной системы. Благодаря широкому распространению и уникальной морфологии дендритных клеток, остеоциты в настоящее время являются самым тщательно изученным типом скелетных клеток с точки зрения механическогоответа 7,8. Помимо широко признанной способности остеоцитов реагировать на механическую силу, скелетные предшественники также играют в этом незаменимую роль. Было установлено, что реакция периостальных предшественников на механические сигналы регулирует их преобразование судьбы, тем самым влияя на восстановление повреждениятканей 9.

Скелетные стволовые клетки (SSC) — это тип тканеспецифических стволовых клеток с способностью к самообновлению, которые могут дифференцироваться в зрелые типы костных клеток, необходимые для роста, поддержания и восстановления костей. В 2015 годубыло выявлено 10 генов поверхностных маркеров для мышиных SSC. Впоследствии многочисленные исследования также показали, что SSC играют очень важную роль в различных аспектах, таких как развитие костей, поддержание гомеостаза и восстановление костныхповреждений 11,12. Из-за характеристик скелетной системы, реагирующей на механические силы, можно рассматривать механические силовые сигналы как незаменимый фактор для регулирования функции скелетных стволовых клеток. Для изучения поведенческих изменений SSC при механической стимуляции необходимо создать подходящую экспериментальную систему для применения механической силы in vitro.

Основные методы механической стимуляции в in vitro для клеток включают сдвиговое напряжение жидкости, сжимающее напряжение, силу растяжения, гидростатическое давление, жесткость матрицы и топологиюматрицы 6,13. Основываясь на поверхностных маркерных генах мышиных SSC, мы получили периостальные SSC мышей методом сортировки потоковой цитометрии, поскольку SSC, участвующие в восстановлении переломов, в основном происходят изнадкоста 14. Впоследствии соответствующая сила растяжения была приложена к периостальных SSC через циклическую систему напряжения ячеек. После стимуляции растягивающей силы можно получить образцы клеток и провести мультиомические анализы, включая секвенирование транскриптомов, протеомное секвенирование и ATAC-seq. Таким образом, создание этого протокола даёт прочную основу для изучения реакций SSC на механическую стимуляцию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты на мышях в этом протоколе были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию Шанхайского института биохимии и клеточной биологии Китайской академии наук (SIBCB-S350-2312-41).

1. Выделение периостальных клеток у мышей

  1. Поместите мышей от 4 до 6 недель в коробку для эвтаназии CO₂ и подвергайте их воздействию CO₂ непрерывно в течение 3 минут, пока дыхание не прекратится.
  2. Дезинфицируйте поверхность тела мышей 75% спирта. Используйте офтальмологические ножницы, чтобы разделить задние конечности. Затем используйте острые щипцы и офтальмологические ножницы, чтобы удалить скелетные мышцы задних конечностей, обеспечивая целостность суставных областей бедренной кости и большеберцовой кости.
  3. Сохраняйте изолированные кости в охлаждённом PBS, а затем покрывайте оба конца костей низкоплавящей агарозой (5-10% в буфере TAE).
  4. Переварить бедренные кости и большеберцевые кости в минимально существенной среде альфа (α-MEM), содержащем 1 мг/мл коллагеназы, 2 мг/мл диспазы II и 0,1 мг/мл ДНКазу I при 37°C и 0,3 × г в течение 30 минут дважды. Соберите переваренные клетки в культурную среду (α-MEM + 10% плодовая бычья сыворотка (FBS)).
  5. Фильтруйте суспензию ячейки через сито с размером 40 мкм, а затем центрифугуйте при давлении 500 × г в течение 5 минут, чтобы удалить супернатант.
  6. Ресуспензировать осадок клетки с буфером лизиса эритроцитов на 2 минуты и прекратить реакцию буфером проточной цитометрии (PBS + 2% FBS).
  7. Центрифугуйте клетки при 500 × г в течение 5 минут и выбросьте супернатант. Суспензируйте клетки с буфером потоковой цитометрии на 1 ×10 7 клеток/мл для сортировки клеток.

2. Сортировка клеток, активируемая флуоресценцией,

  1. Окрашить суспензию клетки следующими антителами: PerCP/Cy5.5-конъюгированный антимышиный CD45, PerCP/Cy5.5-конъюгированный антимышиный CD31, PerCP/Cy5.5-конъюгированный антимышиный Ter119, FITC-конъюгированный антимышиный 6C3/Ly-51, Brilliant Violet 605-конъюгированный антимышиный антимышиный CD90.2, PE/Cy7-конъюгированный антимышиный антимышиный CD105, APC-конъюгированный антимышиный CD200.
  2. Разведите вышеуказанные антитела в соотношении 1:500 и инкубуйте их на льду в течение 30 минут, защищённых от света.
  3. Промыйте клетки буфером проточной цитометрии и проведите сортировку клеток с помощью флуоресцентно-активного сортера для получения SSC CD45-CD31-Ter119-CD90.2-6C3-CD105-CD200+ SSC. Соберите отсортированные SSC с помощью культурной среды. Анализируйте полученные данные с помощью программного обеспечения FlowJo версии 10.8.1.
  4. Разверните отсортированные SSC в культиваторных контейнерах с расширительным средой в инкубаторе с 5%CO2 ячейками. Один пассаж можно было выполнить до механической стимуляции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно 1 ×10 5 периостальных SSC можно получить от каждой пары 6-недельных мышей.

3. Механическая стимуляция SSC

  1. Разведите коллаген типа I хвоста крысы в стерилизированной уксусной кислоте 0,02 млн до конечной концентрации 0,15 мг/мл. Этот раствор можно использовать три раза и поддерживать при 4 °C.
  2. Добавьте 1,5 мл разбавлённого коллагена типа I Rat tail в каждую скважину 6-колодной гибкой культивной пластины. После покрытия пластин в течение 1 часа при комнатной температуре аспирируете излишки коллагена и один раз промывайте пластины PBS для последующего использования.
  3. ПРИМЕЧАНИЕ: Для немедленного использования пластину следует промыть PBS, чтобы удалить остатки кислоты. Перед хранением при 4 °C тарелку следует полностью высушить с крышкой.
  4. Переварить культурированные периостальные SSC мышей, центрифугировать при 500 × г в течение 5 минут, вновь суспензировать осадок клетки в культурной среде для достижения плотности 1 ×10 5 клеток/мл, добавить по 2 мл клеточной суспензии в каждую яме 6-колодной гибкой и гибкой формы и поместить её в клеточный инкубатор.
  5. Через 24 часа после засева в клетки поместите гибкую культивационную пластину в растянутую базовую пластину и оставьте ещё одну клетку с гибким дном в качестве контрольной группы без механической стимуляции.
  6. Установите параметры в программном обеспечении FX-6000 версии 1.0 следующим образом: сила растяжения 8%, частота 0,1 Гц, форма волны в виде квадратной волны, рабочий цикл 80% и длительность растяжения на 12 час.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На растянутой основной пластине есть четыре позиции для размещения 6-луночной гибкой и гибкой дной культуры. Если для эксперимента требуется меньше 4 ячеек, пустые позиции должны быть заполнены новыми пластинами для культуры с 6 лунками и гибким дном. После применения соответствующей механической стимуляции SSC могут пройти функциональные тесты, такие как дифференцировка или пролиферация клеток, либо образцы могут быть извлечены для мультиомического секвенирования.

4. Количественная ПЦР в реальном времени (RT-qPCR)

  1. После завершения механической стимуляции клеток выбросьте культурную среду, промыйте клетки PBS, извлеките полную РНК реагентом TRIzol и выполните обратную транскрипцию РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения извлечения РНК её можно хранить при -80 °C. cДНК, полученная при обратной транскрипции, также может храниться при -20 °C для последующего тестирования.
  2. Проведите RT-qPCR с помощью системы ПЦР в реальном времени. Использовавшиеся наборы грунтов были следующими:
    HPRT: впереди 5'-GTTAAGCAGTACAGCCCCAAA-3',
    HPRT: обратная сторона 5'-AGGGCATATCCAACAAAACTT-3',
    p16: вперёд 5'-GGTCACACGACTGGGCGATT-3',
    стр. 16: обратная сторона 5'-GCACCGTAGTTGAGCAGAGAG-3',
    стр. 21: вперёд 5'-GCCTGGTTCCTTCCCCCCACTTCTT-3',
    p21: реверс 5'-ATTACGGTTGAGTCCTAACTGCCATC-3'.

5. Влияние краткосрочного лечения механических напряжений

  1. Параметры в программном обеспечении FX-6000 версии 1.0 установите следующим образом: сила растяжения 8%, частота 0,1 Гц, форма сигнала в виде квадратной волны, рабочий цикл 80%. Клетки лизируются с помощью буфера лизиса RIPA I (с коктейлем ингибитора фосфатазы и ингибитора протеазы) через 10 минут 60 минут после механической стимуляции напряжения.
  2. Проведите вестерн-блот с помощью Эрка и антитела p-Erk.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После внедрения этого протокола растягивающая сила была успешно применена к периостальных SSC мышей. Во-первых, SSC были получены из надкостника мышей с помощью потоковой цитометрии. Результаты проточной цитометрии показали, что доля SSC в надкостности составляет почти 30% от Lin- (CD45-, CD31-, Ter119-) CD90.2-6C3- (Рисунок 1), что значительно выше, чем в костном мозге. Учитывая значительную роль периостальных SSC...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В последние годы непрерывно открываются гены маркеров скелетных стволовых клеток из разных частейкостей 11,12,17. Тем не менее, исследования прямой регуляции функций SSC всё ещё требуют углубления, особенно в области механической силовой стимуляции. До сих пор исследования механических регуляторных эффектов скелетных стволовых клеток/прекурсорных клеток в основном основывались на построении нока...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Мы благодарим основное учреждение по проточной цитометрии и центр для животных Шанхайского института биохимии и клеточной биологии Китайской академии наук. Работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32471190, 82502903) и Программой иностранных экспертов провинции Хайнань (506068033010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

```html
Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
α-MEMCorning10-022-CVИзоляция периостеальных клеток
APC anti-mouse CD200BioLegend123809Сортировка SSC
BioFlex 6-Well Culture Plate FlexcellBF-3001AКультура клеток
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD90.2BioLegend140317Сортировка SSC
CollagenaseSigmaC0130Изоляция периостеальных клеток
Dispase IISigmaD4693Изоляция периостеальных клеток
DNase ISigmaDN25Изоляция периостеальных клеток
Fetal Bovine SerumGibcoA5356701Сортировка SSC
FITC anti-mouse 6C3/Ly-51BioLegend108305Сортировка SSC
 Flexcell Tension System FlexcellFlexercell FX-6000 Натяжение клеток
Flow Cytometry SorterBDBD FACSAria FusionСортировка SSC
MesenCult Expansion Kit (Mouse)Stem cell05513Культура клеток
PE/Cy7 anti-mouse CD105BioLegend120409Сортировка SSC
PerCP/Cy5.5 anti-CD31BioLegend102522Сортировка SSC
PerCP/Cy5.5 anti-CD45BioLegend103132Сортировка SSC
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TER-119BioLegend116228Сортировка SSC
 PrimeScript RT Reagent KitTaKaRaRR037ART-qPCR
Rat tail type I collagenCorning354236Культура клеток
real-time PCR systemThermo Fisher ScientificQuantStudio 1 PlusRT-qPCR
 red blood cell lysis buffer Beyotime C3702Изоляция периостеальных клеток
TRIzolSigmaT9424RT-qPCR
Phosphatase Inhibitor Cocktail IIMCEHY-K0022WesterBlot
 RIPA Lysis Buffer ISangon BiotechNO. C500005WesterBlot
Protease Inhibitor Cocktail MCEHY-K0010WesterBlot
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody Cell Signaling Technology9102WesterBlot
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology4370WesterBlot
```

Ссылки

  1. Wolff, J. Das Gesetz der Transformation der Knochen. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 19, 1222-1224 (1893).
  2. Li, X., et al. Stimulation of Piezo1 by mechanical signals promotes bone anabolism. eLife. 8, 49631(2019).
  3. Sun, W., et al. The mechanosensitive Piezo1 channel is required for bone formation. eLife. 8, 47454(2019).
  4. Wang, L., et al. Mechanical sensing protein PIEZO1 regulates bone homeostasis via osteoblast-osteoclast crosstalk. Nat Commun. 11, 282(2020).
  5. Zhou, T., et al. Piezo1/2 mediate mechanotransduction essential for bone formation through concerted activation of NFAT-YAP1-ß-catenin. eLife. 9, 52779(2020).
  6. Wang, L., et al. Mechanical regulation of bone remodeling. Bone Res. 10, 16(2022).
  7. Qin, L., Liu, W., Cao, H., Xiao, G. Molecular mechanosensors in osteocytes. Bone Res. 8, 23(2020).
  8. Uda, Y., et al. Osteocyte Mechanobiology. Curr Osteoporos Rep. 15, 318-325 (2017).
  9. Wang, L., et al. Piezo1 balances the osteogenic-tenogenic plasticity of periosteal progenitor cells through the YAP pathway. Cell Rep. 44, 115630(2025).
  10. Chan, C. K., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160, 285-298 (2015).
  11. Feng, H., et al. Skeletal stem cells: origins, definitions, and functions in bone development and disease. Life Med. 1, 276-293 (2022).
  12. Yuan, G., et al. Skeletal stem cells in bone development, homeostasis, and disease. Protein Cell. 15, 559-574 (2024).
  13. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. J Cell Mol Med. 17, 823-832 (2013).
  14. Jeffery, E. C., et al. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells make distinct contributions to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29, 1547-1561 (2022).
  15. Liu, Y. L., et al. Fibrous periosteum repairs bone fractures and maintains the healed bone throughout mouse adulthood. Dev Cell. 59, 1192-1209 (2024).
  16. Hu, H., et al. ZKSCAN3 counteracts cellular senescence by stabilizing heterochromatin. Nucleic Acids Res. 48, 6001-6018 (2020).
  17. Li, Q., Xu, R., Lei, K., Yuan, Q. Insights into skeletal stem cells. Bone Res. 10, 61(2022).
  18. Shen, B., et al. A mechanosensitive peri-arteriolar niche for osteogenesis and lymphopoiesis. Nature. 591, 438-444 (2021).
  19. Yu, H. S., et al. Impact of mechanical stretch on the cell behaviors of bone and surrounding tissues. J Tissue Eng. 7, 2041731415618342(2016).
  20. Chang, X., Xu, S., Zhang, H. Regulation of bone health through physical exercise: Mechanisms and types. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1029475(2022).
  21. Ma, Q., et al. Significance of mechanical loading in bone fracture healing, bone regeneration, and vascularization. J Tissue Eng. 14, 20417314231172573(2023).
  22. Sakurai, M., Ishitsuka, K., Becker, H. J., Yamazaki, S. Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells and clinical applications. Cancer Sci. 115, 698-705 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vitro
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.