Изготовление и хирургическое применение обогащённых фотосшитых гидрогелей желатин–рибофлавин для восстановления роговицы у кроликов

Краткое содержание

Представлен воспроизводимый протокол для приготовления, обогащения и нанесения in situ гидрогеля на основе желатин-рибофлавин для восстановления стромальных ран роговицы у кроликов, включая процедурные этапы хирургического вмешательства, частичную тарсоррафию и послеоперационный уход.

Аннотация

В этой статье представлен пошаговый протокол изготовления, дополнения и хирургического применения in situ желатинового гидрогеля с синим светом и перекрёстным сшиванием для восстановления стромальных ран роговицы у кроликов. Прекурсор гидрогеля состоит из желатина в концентрации 5% (w/v) и рибофлавиновфосфата в 0,01% (w/v), подготовленных в стерильных и светозащищённых условиях, стерильно фильтруемых и нагреваемых перед использованием для достижения инъекционной вязкости. Подробно описано дополнительное включение экстракта человеческой амниотической мембраны или аутологичной сыворотки кролика. Желирование по требованию запускается на поверхности глаз с помощью синего света при λ = 420–480 нм в общей сложности 2 минуты. Метод in vivo включает воспроизводимую переднюю стромальную кератэктомию (диаметр трефина 6,5 мм; глубина примерно 187 мкм), затем гидрогельное заполнение, световую активацию и частичную латеральную тарсорафию для стабилизации лечения, улучшения заживления ран и стандартизации послеоперационного ухода. Репрезентативные результаты in vitro свидетельствуют о гелеобразном вязкоэластичном поведении с истончением сдвига и быстрым восстановлением, а также высокой оптической пропускаемостью (> 90%) свыше 500 нм, что указывает на пригодность для использования роговицы. In vivo методы на основе гидрогеля поддерживают прогрессивное закрытие эпителия, хорошую глазную толерантность (низкие показатели Draize через 3 и 7 дней) и временно-зависимую потерю видимого гидрогеля, характерную для биодеградации и замены тканей. Выделены критические шаги и точки паузы для обеспечения воспроизводимости, включая контроль температуры при растворении и фильтрации, защиту от света и позиционирование лампы при перекрёстном сшивании. Протокол обеспечивает стабилизацию гидрогеля без швов, точно расположенную и активируемую светом, совместимую с добавлением нескольких биоактивных добавок. Он предоставляет практическую платформу для доклинической оценки биоматериалов следующего поколения офтальмологических материалов и облегчает трансляцию гидрогелевых терапий с фотосшиванием для восстановления раны роговицы.

Введение

Роговица представляет собой прозрачную, аваскулярную структуру, которая обеспечивает примерно две трети преломления глаза, что делает её структурную и функциональную целостность необходимой для^{зрения 1}. Из-за прямого воздействия внешней среды роговица высоковосприимчива к травмам, инфекциям, химическим повреждениям и послеоперационным^{осложнениям 2,3}. Неспособность быстро и эффективно восстановить целостность эпителия может привести к стойким эпителиальным дефектам (ПЭД) и хроническим язвам роговицы, что в конечном итоге приводит к плавлению стромы, перфорации, рубцовой появлению и необратимой потере зрения ^4,5. Традиционные методы лечения — включая смазки, антибиотикопрофилактику и аутологичные капли для глаз в сыворотке — часто приносят лишь частичный эффект и недостаточно способствуют восстановлению стромы при умеренных и тяжёлых^{дефектах 6,7,8}.

Для устранения этих ограничений биоматериальные терапии стали перспективными альтернативами благодаря их способности защищать рану, поддерживать восстановление эпителия и восстанавливать стромальные^ткани 9,10,11,12,13,14. Гидрогели особенно привлекательны своей биосовместимостью, оптической прозрачностью, регулируемым механическим поведением и способностью включать терапевтические агенты. Как натуральные, так и синтетические гидрогели, включая желатин 15,16,17,^{коллаген 18,19},^{хитозан 20,21}, полиэтиленгликоль (PEG^)22,23 и гиалуроновую^{кислоту 18,24}, продемонстрировали потенциал для стимулирования заживления ран роговицы. Среди них гидрогели на основе желатина особенно ценны благодаря своему составу, полученному из коллагена, и вроде клеточно-адгезионных мотивов.

Гидрогели с фотосшижением дают дополнительное преимущество, позволяя по требованию затвердеть непосредственно на поверхности глаза, обеспечивая точное размещение и улучшая механическую стабильность без швов. Рибофлавин-опосредованное сшивание, изначально разработанное для лечения кератоконуса, недавно было адаптировано для фотополимеризации гидрогеля благодаря своей отличной биосовместимости, офтальмологической безопасности и способности генерировать реактивные кислородные формы, вызывающие перекрёстное сшивание под видимым или ультрафиолетовым^{светом 25,26}. Синий свет (≈445 нм) особенно полезен для применения в роговице, обеспечивая эффективное перекрёстное сшивание при избегании рисков, связанных с^{УФ-излучением 27,28,29.}

В этой статье представлены процессы изготовления, обогащения и хирургического применения гидрогеля, состоящего из 5% желатина (w/v) и 0,01% (w/v) рибофлавинфосфата (RFP). Подробный протокол для подготовки гидрогеля in vitro предусмотрен, включая необязательное включение экстракта человеческой амниотической мембраны (HAMe) или аутологичной сыворотки (AS), а также применение in vivo в модели стромальной кератэктомии у кроликов. Известно, что HAMe оказывает противовоспалительные, противофиброзные и прорегенеративные эффекты на поверхность^глаза 30,31,32,33,34,35, тогда как аутологичная сыворотка обеспечивает слезоподобные концентрации витамина A, EGF, фибронектина и других факторов роста, необходимых для регенерации ^{эпителия 36,37,38}. Вместе эти элементы поддерживают повторную эпителизацию, снижают воспаление и потенциально предотвращают стромальную^{деградацию 39,40}.

Хотя описанный подход обеспечивает контролируемую фотополимеризацию и настраиваемую биоактивность, его применимость в настоящее время ограничивается поверхностными и среднестромальными дефектами и требует прямого воздействия синего света, который может ограничивать использование в непрозрачных или глубоко инфильтрированных тканях. Интегрируя подготовку и обогащение гидрогеля, офтальмологическую обработку и послеоперационный уход, включая частичное латеральное тарсоррафии, данная статья предлагает воспроизводимый подход, поддерживающий восстановление роговицы, способствующий переносу светоактивируемых гидрогелевых технологий в клиническую практику и способствующий разработке стандартизированных платформ для регенеративных исследований роговицы.

Протокол

Человеческие плаценты были получены от доноров с информированного согласия, в соответствии с Хельсинкской декларацией и с одобрения Этического комитета Университетской больницы Крусес (номер одобрения CEIC E15/03). Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике исследований животных Университета Страны Басков (UPV/EHU) (номер одобрения CEEA M20/2023/038) и соответствовали Заявлению ARVO по использованию животных в офтальмологических и зрительных исследованиях. Все процедуры проводились на ветеринарном комплексе UPV/EHU (SGIker), сохраняя стерильную технику на всех этапах (шкаф биобезопасности класса II при обращении с биологическими препаратами).

1. Синтез гидрогеля

1. Растворы прекурсора желатин-рибофлавин (5% и 10% w/v)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте при тусклом освещении или используйте янтарные бутылки или бутылки, завернутые в алюминиевую фольгу, чтобы защитить раствор от воздействия света. Выполняйте все действия в стерильных условиях в ламинарной вытяжке, если гидрогель предназначен для биологического использования.
   1. Взвесьте необходимое количество желатина и рибофлавинового фосфата (RFP): для 10 мл 5% (w/v) + 0,01% (w/v) RFP-прекурсора, взвесьте 500 мг желатина и 1 мг RFP. Для 30 мл 10% (w/v) + 0,02% (w/v) RFP взвесьте 3 г желатина и 6 мг RFP.
   2. Добавьте желатин и RFP к соответствующему объёму деионизированной воды (≈90% от конечного объёма). Аккуратно перемешивайте, пока порошок полностью не рассеется.
   3. Отрегулируйте pH до 7.0 с помощью 1 M NaOH, добавляя основание по дроп-по-дроп-у, одновременно контролируя pH. Запишите использованный объём NaOH и окончательный скорректированный объём. После корректировки pH доведите растворы до конечного объёма с помощью деионизированной воды.
   4. Растворить и гомогенизировать раствор при 80 °C при магнитном помешивании при 200 об/мин в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте горячие растворы (>70–80 °C) в термостойких перчатках.
   5. Дайте растворам остыть до 30–40 °C и профильтруйте их через гидрофильные мембранные фильтры с полиэфирсульфоном (PES) 0,22 мкм в стерильные янтарные бутылки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости прогревайте вязкие растворы аккуратно (≈ 40–50 °C) перед фильтрацией; избегайте перегрева.
   6. Маркируйте бутылки составом, датой и инициалами оператора. Храните фильтрованные растворы гидрогеля при 4 °C до использования, при этом срок хранения не превышает 2 недели с момента приготовления.
2. Добавлены желатиновые гидрогели (конечный объём: 10 мл)
   1. Приготовьте аутологичную сыворотку (AS) или экстракт амниотической мембраны человека (HAMe) согласно процедурам, описанным в разделах 4 и 5. Храните экстракты стерильными и охлаждёнными до использования.
   2. Для каждых 10 мл обогащённого гидрогеля смешайте 5 мл 10% желатина + 0,02% (w/v) запаса RFP и 5 мл соответствующего биологического экстракта (AS или HAMe).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости прогревайте вязкие растворы аккуратно (≈ 40–50 °C) перед фильтрацией; избегайте перегрева.
   3. Фильтруйте тёплый раствор через гидрофильный мембранный фильтр PES толщиной 0,22 мкм в стерильные янтарные бутылки.
   4. Маркируйте и храните гидрогели при 4 °C до применения. Убедитесь, что срок хранения не превышает 2 недель с момента приготовления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизировать все отходы в соответствии с институциональными нормами биобезопасности.

2. Применение гидрогеля in vitro

1. Подготовьте составы гидрогеля, как описано в разделе 1, и поддерживайте их при 32 °C перед нанесением для поддержания достаточной вязкости.
2. Используя стерильную технику, пипетить необходимый объём гидрогеля в целевую яму, форму, чашу или субстрат (рисунок 1A).
3. Разместите лампу отверждения Led-C на 2 см над поверхностью гидрогеля. Инициируйте in situ перекрёстное соединение, подвергая гидрогель воздействию синего света (λ = 420–480 нм) и световой выход 850–1000 мВт/^{см² 2} на общую длительность 2 минуты. Подсветка подаётся шестью импульсами по 20 с, вставляя между импульсами 5–10 секунд пауз для предотвращения локального нагрева (рисунок 1B).
4. Подтвердите полную желацию визуально и аккуратно касаясь поверхности стерильным инструментом, чтобы обеспечить образование твёрдого, управляемого гидрогеля (рисунок 1C,D).
5. Используйте сшитый гидрогель немедленно или храните при 4 °C в стерильных условиях, подходящих для последующего применения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте асептическую технику на протяжении всей процедуры. Избегайте прямого воздействия синего света на кожу или глаза.

3. Закупка человеческой амниотической мембраны (HAM)

ПРИМЕЧАНИЕ: Плаценты используйте только от сероотрицательных доноров, которые предоставили информированное согласие и соответствуют институциональным и этическим требованиям.

1. Право на донорство и согласие
   1. Подтвердите, что каждый донор прошёл скрининг и получил отрицательный тест на ВИЧ типа 1 и 2, гепатиты B и C, а также сифилис.
   2. Получите письменное информированное согласие каждого донора перед операцией.
   3. Получите человеческую плаценту сразу после плановых кесаревых сечений здоровых доноров.
2. Сбор и первичная обработка
   1. Собирайте каждую плаценту в стерильный контейнер из нержавеющей стали сразу после родов.
   2. В операционной тщательно промывайте плаценту стерильным физиологическим раствором для удаления тромбов. Определите амнион — самую внутреннюю прозрачную мембрану, выстилающую амниотическую полость — и аккуратно отделите его от хориона, аккуратно отшелушивая к краю плаценты с помощью стерильных щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно обращайтесь с мембранами, чтобы избежать разрыва.
   3. После полного разделения прикрепите стерильные нитроцеллюлозные фильтрующие элементы к поверхности стромы HAM для облегчения манипуляций и стандартизации её деления. Разделите HAM на три очерчённых области (рисунок 2A,B): дистальный амнион: разрез шириной 10 см, медиальный амнион шириной 10 см, проксимальный амнион: срез, простирающийся к краю плаценты.
3. Транспорт
   1. Поместите каждый фрагмент HAM в стерильную бутылку, погружая его в Modified Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco, дополненный 1,25 мкг/мл амфотерицина B, 50 мкг/мл пенициллин-стрептомицина и 50 мкг/мл неомицина.
   2. Чётко маркируйте каждую бутылку кодом донора, датой и регионом происхождения (дистальное, медиальное или проксимальное).
   3. Немедленно транспортируйте образцы в лабораторию в чистых и асептических охлаждённых условиях (4 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Транспортировать мембраны в герметичной, тройной упаковке, соответствующей UN 3373 (Биологическое вещество, категория B), в соответствии с институциональными нормами биобезопасности, регулирующими человеческие ткани.
4. Лабораторная обработка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все последующие этапы в биологическом шкафу класса II в стерильных условиях.
   1. Разрежьте каждый дистальный, медиальный и проксимальный фрагмент HAM на квадраты размером 4,0–4,5 × 4,0–4,5 см стерильными ножницами.
   2. Погрузите фрагменты в уже упомянутый антибиотиком DMEM и аккуратно прочистите стерильными зажимами, чтобы удалить остатки крови. Промыть в DMEM с содержанием 50 мкг/мл пенициллин-стрептомицина в течение 2 x 5 минут.
   3. Мойте в DMEM без антибиотиков 2 x 5 минут.
   4. Промывайте эти отобранные фрагменты в стерильном фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
   5. Переместите каждый фрагмент в стерильную трубку объёмом 5 мл без какого-либо посевного материала. Образцы заморозите непосредственно при -80 °C до дальнейшего использования.

4. Подготовка экстракта человеческой амниотической мембраны (HAMe)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы в асептических и холодных условиях, чтобы минимизировать разрушение и загрязнение белка.

1. Извлечь трубки с фрагментами человеческой амниотической мембраны (HAM), хранящимися при −80 °C. Погрузить трубки в жидкий азот на 5 минут, чтобы ткань затвердела.
2. Переложите каждый замороженный фрагмент в предварительно охлаждённую ступку (−80 °C) и тщательно измельчите его пестиком до получения мягкого, однородного порошка.
3. Немедленно взвесьте образец в порошке на балансировочной пластине, чтобы минимизировать размораживание. Переложите взвешенный порошок в пробирку объёмом 5 мл и снова суспензуйте его в 3 мл PBS с добавлением коктейля с ингибиторами протеазы 5 мкл/мг.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время обработки держите все трубки на льду, чтобы сохранить целостность белка.
4. Соникуйте каждый образец в течение 20 минут с амплитудой 90% с помощью соникатора и зонда диаметром 1,5 мм, применяя циклы 15 с включения / 15 секунд выключения для предотвращения перегрева.
5. Центрифугуйте лизаты при 3 000 × г в течение 10 минут при 4 °C. Аккуратно собирайте супернатант, не нарушая гранулу.
6. Фильтруйте супернатант через гидрофильный мембранный фильтр PES диаметром 0,22 мкм с использованием стерильных условий. Аликвот фильтруете HAMe в микротрубки объемом 0,2 мл. Аликвоты храните при −80 °C до дальнейшего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что срок хранения не превышает 6 месяцев с момента подготовки.

5. Извлечение кровяной аутологичной сыворотки из кроликов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнять все процедуры для in vivo анализов белых кроликов Новой Зеландии (≈2 кг) по одобрению Комитета по этике исследований животных соответствующего учреждения и в соответствии с институциональными рекомендациями.

1. Локально анестезируйте кролика лидокаином (местным или подкожным) в месте венипункции.
2. Соберите кровь из центральной ушной артерии в трубки объёмом 4,5 мл с полимерным гелевым сепаратором (рисунок 3A,B). Дайте крови свернуться в течение 2 часов при RT без перемешивания (рисунок 3C).
3. Центрифугуйте образцы при 1 000 × г в течение 15 минут при RT. Соберите супернатант (сыворотку), который составляет автологичную сыворотку для кроликов (AS) (рисунок 3D).
4. Фильтруйте сыворотку через гидрофильный мембранный фильтр PES с объемом 0,22 мкм. Аликвовать в стерильные трубки объёмом 0,2 мл и хранить при −80 °C до использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что срок хранения не превышает 6 месяцев с момента подготовки.

6. Операция in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнять все экспериментальные процедуры в соответствии с Этическим комитетом по исследованиям животных соответствующего учреждения и соблюдать положения Хельсинкской декларации и Заявление ARVO о применении животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.

1. Предоперационная подготовка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте новозеландских белых кроликов (≈2 кг) в качестве животной модели.
   1. Перед операцией введите общий наркоз с помощью внутримышечной инъекции в бедро животных с применением: кетамина 1 мл/кг (50 мг/мл) и ксилазина в 0,3 мл/кг (20 мг/мл). Перед процедурой подтвердите отсутствие роговицы и рефлекса стопы.
   2. Поместите животное в положение бокового декубита на стерильной хирургической платформе и продезинфицируйте периокулярную область раствором повидона-йода. Разместите спекулум века на операционном глазу, чтобы поддерживать непрерывную экспозицию поверхности глаз во время процедуры.
2. Передняя стромальная кератэктомия
   1. Центрируйте вакуумный трефин диаметром 6,5 мм на роговице кролика (рисунок 4A). Примените всасывание для стабилизации устройства и покрутите трефин на три четверти, достигая приблизительной глубины стромы 187 мкм.
   2. Проведите переднюю стромальную кератэктомию в трефинированной области с помощью полукруглого лезвия, удаляя эпителиальный и передний стромальный слои до получения гладкого ранового ложа (рисунок 4B).
3. Применение гидрогеля in vivo
   1. Заполните дефект роговицы 50 мкл соответствующей гидрогелевой формулы, предварительно нагретой до 32 °C для обеспечения оптимальной вязкости (рисунок 4C).
   2. Инициировать in situ перекрёстное сшивание, освещая поверхность роговицы синим светом (λ= 420–480 нм) в течение 2 минут. Подать шесть импульсов по 20 с с паузами между импульсами по 5–10 с для ограничения локального нагрева (рисунок 4D).
4. Латеральная частичная тарсоррафия
   1. Определите одну треть верхнего и нижнего краёв века для медиальной экспозиции для наблюдения и лечения.
   2. Наложите первый шов (используйте 1–2 шва в зависимости от длины века и необходимой устойчивости) (рисунок 4E).
      1. Захватите латеральный край верхнего века щипцем. Проведите иглою через серую линию / край века от кожи к конъюнктивальной стороне, сделав полный укус, но по возможности избегая глубокого проникновения в тарзальную пластину.
      2. Проведите иглою через соответствующую точку нижнего края века от конъюнктивальной стороны к коже, чтобы создать расположение краёв века.
      3. Завяжите шов надёжным хирургическим узлом и двумя квадратными узлами, оставляя узел на поверхности кожи немного расположенным с внешней стороны края века, а не прямо над ним.
      4. Если требуется дополнительная устойчивость, наложите второй шов примерно на 3–4 мм медиально от первого, используя тот же шов полной толщины U-образной формы или простой прерванный шов.
      5. Обрежьте хвосты шва до 3–4 мм для уменьшения раздражения, оставив длину достаточно для последующего удаления.
      6. Убедитесь, что расположение века защищает обработанную роговицу, обеспечивая доступ к медиальной и височной конъюнктиве/роговице для осмотра и лечения глазными каплями. Убедитесь, что тарсоррафия не слишком напряжённая и что веки животного не ишемические (рисунок 4F).
5. Послеоперационный мониторинг и уход
   1. Вводите бупренорфин в дозе 0,05 мг/кг подкожной инъекцией перед кератэктомией и каждые 12 часа в течение 72 часов для обезболивания.
   2. Вводите глазные капли 3 мг/мл Тобрамицина два раза в день до полного закрытия раны, чтобы предотвратить инфекцию.
   3. Наносите одну каплю искусственных слёз с гиалуроновой кислотой (HA) на все глаза, включая контрольные, четыре раза в день, чтобы поддерживать увлажнение роговицы.
   4. Осматривайте тарсоррафию не реже двух раз в день на наличие признаков ослабления швов, инфекции, локального некроза тканей или чрезмерного напряжения. Следите за животным на предмет нормального поведения, кормления и признаков дискомфорта в глазах.
   5. Через 72 часа после процедуры разрежьте шовный узел и аккуратно вытяните каждый шов щипцем, стараясь не перетаскивать загрязнения по конъюнктивальной поверхности.
   6. Осмотреть края века для правильного заживления и поверхность роговицы на целостность эпителия. Продолжать лечение глаз по мере необходимости до полного закрытия эпителия.
   7. Мониторинг и запись заживления глаз и клинических признаков с 3 по 7-й день, оценивая закрытие эпителия, непрозрачность и неоваскуларизацию с помощью микроскопии щелевой лампы и окрашивания флуоресцеином.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если появятся признаки ишемии, отслоения раны или сильного раздражения, немедленно снимите шов(ы) и обработайте их соответствующим образом.
6. Оценка острого раздражения глаза по методу Draize
   1. Аккуратно удержите кролика полотенцем/одеялом. Сначала осмотрите радужку и конъюнктиву при белом свете.
   2. Оценка конъюнктивального покраснения, хемоза (отёка) и выделений по шкале Дрейза (см. таблицу 1 и 2).
   3. Запишите все шесть параметров Draize в технический лист. Вычислите индекс раздражения глаз (OII) как сумму баллов компонентов; OII варьируется от 0 до 110, при этом более высокие значения указывают на более сильное раздражение.
   4. Классифицировать каждый глаз по категориям Кея–Каландры на основе OII; зафиксировать категорию в наборе данных.
7. Фотографическая документация заживления ран
   1. Введите раствор флуоресцеина (5 мкл) в нижний конъюнктивальный мешок.
   2. Осветить глаз синим светом и оценить непрозрачность роговицы (плотность и площадь), а также степень окрашивания флуоресцеина.
   3. Установите камеру с ручной регулировкой баланса белого, отключённым оптическим зумом и расстановитесь примерно на расстоянии 3 см от глаза, чтобы запечатлеть все изображения с одинаковыми параметрами на протяжении сеансов. Снимайте изображения после инстилляции флуоресцеином с подсветкой синего света и без него, чтобы выявить дефекты эпителия. Снимайте на 0-й день (до тарсоррафии) и ежедневно с третьего дня (после удаления тарсоррафии) до полного закрытия эпителия.
   4. Проанализируйте изображения с помощью программного обеспечения ImageJ и количественно определите площадь областей, окрашенных флуоресцеином.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фотографическая документация на 1 и 2 дни обычно невозможна из-за частичной тарсоррафии. Укажите, что изображения с первого и второго дней отсутствуют в наборе данных, и сообщите о возможных нежелательных событиях (например, случайном стирании роговицы).
8. Эвтаназия и сбор тканей
   1. На 21-й день (после периода обследования обоих глаз) глубоко анестезируйте животных с помощью кетамина (2 мл/кг) и ксилазина (0,6 мл/кг), введённых внутримышечно.
   2. Эвтаназия путём внутривенной инъекции насыщенного хлорида калия (KCl) в маргинальную ушную вену.
   3. Подтвердите смерть по наличию трупного окоченения и отсутствию жизненно важных рефлексов, прежде чем приступать к забору тканей.

Результаты

Синтез и характеристика гидрогеля
Гидрогель был синтезирован и оценен in vitro для определения его реологических и оптических свойств до и после фотосшивания. Для характеристики вязкостастичности, текучести и поведения потока использовалась сдвиговая реология. Частотные сверки показали, что G′ оставался выше G" на всех тестируемых частотах, что указывает на поведение, похожее на твёрдое тело (рисунок 5A). Амплитудные сканки при 1...

Обсуждение

Текущий протокол обеспечивает воспроизводимый рабочий процесс подготовки, загрузки и нанесения фотосшиваемого гидрогеля с рибофлавином для заживления роговицы. Несколько этапов in vitro критически важны для достижения стабильного качества геля и требуют особого внимания, поскольку они являются наиболее частыми источниками вариативности. Во-первых, поддержание раствора прекурсора при температуре 80 °C во время перемешивания обеспечивает полное растворение желатина и рибофлавиновф...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Амфотерицин B	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	15290018	Конечная концентрация: 1,25 μг/мл
Автогенная сыворотка кролика (AS)	Приготовлена в лаборатории	-	Приготовлена из цельной крови; фильтруется через 0,22 μм PES
Синий светодиодный отверждающий ламп	Woodpecker Medical Instrument Co	Модель LED.C	Длина волны: λ=420–480 нм; Расстояние: 1–2 см; Световая мощность: 850-1000 мВт/см2
Бупренорфин (Бупрекар)	Ecuphar	578950	Доза: 0,05 мг/кг, подкожная инъекция каждые 12 ч на протяжении 72 ч
Камера	Panasonic	LUMIX TZ35	Камера оснащена оптикой Leica
Цифровая мешалка с нагревом Cimarec	Thermo Fisher Scientific	SP131320-33	220-240 В, Максимальная температура: 540 °C
Крестообразный микрохирургический скальпель	BVI Medical	373807	-
DMEM (модифицированная среда Дульбекко)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	11966025	-
Эппендорфовы пробирки (0,2 мл)	Merck KGaA	30124707	Хранятся в холоде для приготовления HAMe; разливания
Эппендорфовы пробирки (5 мл)	Merck KGaA	30119606	Хранятся в холоде для приготовления HAMe; разливания
Флюоресцеиновый раствор	Novartis	Colorcusi Fluotest	2% раствор флуоресцеина, 5 µl глазных капель
Gibco Неомицин	Merck KGaA	N1142	Конечная концентрация: 50 μг/мл
Гелатин в порошках	Sigma Aldrich	G1890	Растворяется при 80 °C; pH скорректирован до 7,0
Гиалуроновая кислота в искусственных слезах (0,2%)	Chem.-pharm. Fabrik GmbH	Hylo-Tear	-
Программное обеспечение для обработки изображений ImageJ	Национальный институт психического здоровья	-	Разработано Уэйном Расбандом в отделении исследований
Кетамин (Кетолар)	Pfizer	631028.1
Лидокаин	Vet One	NDC 13985-222-04	Местное или подкожное введение
Пенициллин-стрептомицин	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	15140-122	Конечная концентрация: 50 μг/мл
Фильтры для шприца PES, 0,22 μм0,22μм (Millex)	Merck KGaA	SLGP033RS	-
Фосфатно-буферный раствор (PBS)	Sigma Aldrich	P4417-100TAB	-
Коктейль ингибиторов протеаз	Sigma Aldrich	P8340	Добавляется по 5 μЛ на мг ткани
Растворы повидона-йода	Meda pharma	7167204	Предоперационная дезинфекция
Рибофлавин фосфат (RFP)	Sigma Aldrich	R0630000	Концентрации: 0,01% в/в (окончательная); 0,02% в/в (запасная)
Соникатор	Bandelein electronic	Sonoplus GM mini20	-
Зондирующий зонд соникатора	Bandelein electronic	MS 1.5	Зонд диаметром 1,5 мм, длиной 63 мм.
Шовы для тарзорафии (не абсорбируемые)	Alcon	8065308001	1–2 шва в зависимости от необходимости
Офтальмический раствор тобрамицина (3 мг/мл)	Novartis	Tobrex	Дозировка: дважды в день до закрытия
Трепан Хессбурга-Баррона, диаметр 6,5 мм	Jedmed	21-8265	-
Пробирки для сбора крови Vacutainer с полимерным гелевым сепаратором	BD (Becton, Dickinson and Company)	367704	-
Растворы ксилазина	Laboratorios Calier SA	Xylagesic	Доза: 5 мг/кг внутримышечная инъекция