Протокол стэкинга фокуса для съёмки насекомых в высоком разрешении

Summary

Цель состоит в том, чтобы предложить доступный, стандартизированный метод фокусного стека для фотографии насекомых, используя доступное оборудование для создания чётких, высококачественных изображений для таксономии, исследований биоразнообразия, экологических исследований и общественного взаимодействия.

Abstract

Здесь мы представляем протокол получения высококачественных изображений с расширенной глубиной резкости насекомых посредством фотофокусного стека с использованием модульной цифровой системы съёмки. Метод обеспечивает стандартизированный рабочий процесс, связывающий сборку, калибровку, получение изображений и постобработку оборудования. Используя полноформатную беззеркальную камеру (61 МП) в сочетании с микроскопическими объективами и синхронизированным стробоскопом, протокол достигает масштабов пикселей от 0,76 м до 0,19 м и создает композиты без артефактов за счёт субмикронного прироста фокуса (0,2 м). Процедура позволяет захватывать и обрабатывать примерно 20 финальных изображений в неделю в рутинных лабораторных условиях. По сравнению с существующими решениями для стекирования, эта недорогая гибридная система (< 30% стоимости коммерческих систем) обеспечивает максимальную доступность при сохранении дифракционного ограничения качества изображения. Репрезентативные применения включают изготовление цветокалиброванных идентификационных пластин для таксономии, оцифровку биоразнообразия и информативную деятельность. Стандартизированная структура протокола обеспечивает воспроизводимость в лабораториях и полевых станциях, поддерживая масштабные кампании по визуализации насекомых как в условиях ограниченных ресурсов, так и в институциональных условиях.

Introduction

Насекомые представляют собой самую разнообразную группу организмов на Земле и играют ключевую роль в функционировании^{экосистем. 1}. Тем не менее, глобальные оценки показывают тревожное снижение их численности и разнообразия во всём^{мире 2,3}. Точная визуализация морфологии насекомых крайне важна для таксономии, экологического мониторинга и охраны природы, особенно в тропических регионах, богатых биоразнообразием, где многие таксоны остаются^{неописанными 4}. Однако традиционная макрофотография остаётся ограниченной глубиной резкости, что не позволяет единому изображению охватить полностью чёткие трёхмерные структуры, такие как антенны или^{крылья 5}.

Попытки фотографировать насекомых для научных целей насчитывают более века, при этом ранние методологические описания подчёркивали врождённые трудности фиксации мелких морфологических^{деталей 6}. Традиционная макрофотография, хотя и широко используемая, по-прежнему ограничена малой глубиной резкости, достижимой при высоком^{увеличении 7,8}. Это ограничение затрудняет документирование трёхмерных структур, таких как антенны, ноги или крылья, что приводит к изображениям с недостаточной разрешением, необходимой для точной идентификации или морфологического анализа.

Достижения в цифровой фотографии и обработке изображений обеспечили значительный прогресс. Фокусное стекирование, при котором несколько изображений, сделанных в разных фокальных плоскостях, объединяются для получения полностью чёткого композита, стало особенно эффективным^{подходом 9}. Её ценность для энтомологии, сравнивая коммерческие установки с недорогими полуавтоматическими решениями, подчёркивает потенциал для масштабной оцифровки типового^{подхода 9}. Последующие исследования исследовали использование компактных, доступных камер с функциями фокусного стека, показывая, что этот подход можно расширить за пределы хорошо финансируемых учреждений для поддержки более широких проектов^{цифровизации 10}.

Фокусное стекирование — сочетание последовательных изображений, сделанных на разных фокальных плоскостях, для создания одного композита с расширенным фокусом — стало практическим^{решением 6}. Ранние сравнительные^{исследования 7}показали, что даже недорогие полуавтоматические системы могут приблизиться к производительности коммерческих микроскопов, но стандартизированный, воспроизводимый протокол, подходящий для ограниченных ресурсами лабораторий, всё ещё отсутствует. Альтернативные методы 3D-визуализации, такие как^{DISC3D 8} , предоставляют точные модели, но требуют специализированного оборудования и сложного программного обеспечения для реконструкции, что ограничивает их доступность.

Здесь мы представляем протокол, оптимизированный для образцов насекомых, который балансирует качество изображения, стоимость и портативность. Система интегрирует широко доступные оптические и механические компоненты с строгой калибровкой цвета и этапами послеобработки. Её пригодность распространяется от музейной цифровизации до полупостоянных полевых станций, позволяя исследователям создавать воспроизводимые изображения без использования собственного оборудования или дорогих автоматизированных микроскопов. Вот это
Study заполняет методологический пробел, предлагая проверенный, открытый рабочий процесс
в соответствии с акцентом на прозрачность и воспроизводимость.

Protocol

1. Настройка оборудования

1. Спроектировать модульную систему визуализации, интегрирующую высококлассные оптические компоненты с доступным и широко доступным оборудованием (Дополнительный файл 1)
2. Сочетайте точную механику, контролируемое освещение и продвинутую оптику для достижения высокоразрешённого фокусного стека, сохраняя гибкость для различных размеров и морфологий насекомых.
3. Используйте следующие основные компоненты.
   1. Камера
      1. Используйте полноформатную цифровую камеру высокого разрешения с сильным динамическим диапазоном, чтобы детально запечатлеть тонкие морфологические структуры.
      2. Установите камеру на высокоспециализированную планку фокусировки (Дополнительный файл 1)
   2. Оптика
      1. Используйте объективы микроскопа с коррекцией бесконечности и увеличения, такие как 5X, 7.5X, 10X и 20X (дополнительный файл 1), установленные на трубочной системе.
      2. Дополните установку объектива ультрамакрообъективом для крупных образцов.
      3. Включать трубки объективов с разными уровнями увеличения по мере необходимости (Дополнительный файл 1)
   3. Освещение
      1. Установите две студийные вспышки в вертикальном положении сзади, чтобы обеспечить равномерное и мощное освещение.
      2. Расположите два высокоскоростных вспышки спереди под углом, чтобы обеспечить короткую продолжительность вспышки и быстрое время переработки.
      3. Установите фонари на регулируемые подставки для обеспечения равномерного освещения без теней (Дополнительный файл 1).
      4. Поставьте диффузор перед объективом, чтобы смягчить свет и уменьшить резкие тени (дополнительный файл 1).
   4. Система поддержки
      1. Настройте антивибрационную таблицу, чтобы минимизировать вибрацию при захвате изображений.
      2. Используйте опору для штатива и чёрный неотражающий фон, чтобы уменьшить вибрации и отражения.
      3. Добавьте специализированную макрорейку для стабилизации камеры в системе стекирования (Дополнительный файл 1).
      4. Используйте трёхосное вращающеесое устройство для позиционирования (Дополнительный файл 1), чтобы точно выравнивать и позиционировать объект.
      5. Используйте точную микрометрическую регулировку для мелких макрокорректировок по масштабу миллиметра.
   5. Система фокусировки
      1. Управляйте фокусировочной стойкой с управлением шаговым мотором через отдельный блок управления и сетевой кабель.
      2. Регулируйте шаги движения с точностью до 0,2 мкм, чтобы обеспечить точное отбор глубины для фокусного стека.
      3. Используйте цилиндрический чёрный туннель для управления направлением света и уменьшения отражений при съёмке очень мелких объектов (Дополнительный файл 1).
      4. Используйте спусковой крючок для точной синхронизации выстрела вспышки с затвором камеры (Дополнительный файл 1).
   6. Вычислительные технологии и аксессуары
      1. Используйте высокопроизводительный ноутбук с не менее 128 ГБ оперативной памяти для обработки изображений.
      2. Используйте быстрый считыватель карт памяти, графический планшет и высокоточную мышь для ускорения постобработки.
      3. Иметь при себе две карты памяти большой ёмкости для обеспечения достаточного хранения для полевых операций.
4. Соберите систему из компонентов, закупаемых у разных производителей, чтобы создать индивидуальную гибридную установку, оптимизированную для съёмки насекомых.

2. Калибровка цвета

1. Уменьшайте случайный свет и неточности цвета, окружая камеру чёрными стенами.
2. Используйте стандартизированный дневной светильник при 6500 К, чтобы имитировать дневной свет и поддерживать стабильные условия съёмки.
3. Проведите калибровку камеры.
   1. Калибруйте камеру с помощью стандартизированной цветовой таблицы.
   2. Сфотографируйте цветную справочную таблицу при том же дневном освещении, что и для образцов насекомых.
   3. Сгенерируйте индивидуальный цветовой профиль с помощью программного обеспечения для калибровки цвета.
   4. Применяйте пользовательский цветовой профиль во время постобработки для коррекции изменений объектива и освещения.
4. Проведите калибровку монитора.
   1. Калибруйте монитор с помощью устройства управления цветом.
   2. Откалибруйте монитор монтажа с помощью колориметра и программного обеспечения для профилирования.
   3. Установите калибровку монитора на gamma 2.2 и белую точку D65, чтобы соответствовать условиям изображения.
5. Поддерживайте этот двойной калибровочный процесс, чтобы сохранить точность цвета от захвата до конечного вывода.

3. Стекинг

1. Устанавливайте каждый образец на регулируемые опоры для стабильного положения.
2. Получайте изображения с помощью моторизованной фокусировочной стойки.
3. Корректируйте размеры шагов от 0,2 до 2 мкм в зависимости от размера образца и необходимой глубины резкости.
4. Сделайте от 50 до 2000 изображений в фокусном диапазоне для каждого образца.
5. Синхронизируйте освещение с экспозицией камеры, чтобы минимизировать размытие движения.
6. Храните необработанные изображения на картах памяти и сразу после получения их переносите на обработочный компьютер.

4. Программное обеспечение

1. Перенесите сырые файлы в программное обеспечение для управления изображениями для первоначальной организации.
2. Выберите все изображения и примените цветовой профиль, специфичный для камеры, чтобы сохранить точность цвета.
3. Экспортировать изображения в формате высокого разрешения TIFF.
4. Обрабатывайте TIFF-файлы в программном обеспечении для стека фокусов.
5. Проверьте доступные методы укладки в зависимости от сложности образца.
   1. Используйте метод усреднения на основе контраста при работе с простыми, однородными объектами.
   2. Используйте метод на основе карты глубины, когда нужен лучший баланс резкости и уменьшения артефактов (Дополнительный файл 1).
   3. Используйте пирамидальный метод, когда нужно фиксировать мелкие детали и сложные края, одновременно отслеживая наличие артефактов в гало.
6. Применяйте гибридный рабочий процесс.
   1. Сначала обработайте оригинальный стек изображений с помощью метода depth-map, чтобы создать промежуточный композит с высокой общей резкостью и точностью цвета.
   2. Сохраните первый промежуточный выход.
   3. Переработайте исходный стек с помощью пирамидального метода, чтобы создать второй композит с акцентом на детали краёв.
   4. Сохраните второй промежуточный выход.
   5. Загрузите оба промежуточных выхода как новый стек в программное обеспечение для стека фокуса.
   6. Примените метод на основе карты глубины, чтобы объединить их в финальный композит, который объединяет сильные стороны обоих методов при минимизации артефактов.
7. Доработайте стекированное изображение в программном обеспечении для редактирования изображений.
   1. Удалите фон, исправьте артефакты и проверьте калибровку цвета.
   2. Внесите тонкие корректировки контраста и яркости для улучшения морфологической видимости.
   3. Фиксируйте каждый этап постобработки для обеспечения воспроизводимости.
   4. Используйте графический планшет для повышения точности при продвинутом монтаже.
8. Используйте следующие инструменты при расширенном редактировании.
   1. Используйте инструмент свободного выбора, чтобы выбрать нерегулярные области для целенаправленных правок.
   2. Используйте инструмент для затемнения, чтобы избирательно уменьшить переосвещённые или неровные участки.
   3. Используйте навигационный инструмент, чтобы перемещать и перемещать изображение во время детального редактирования.
   4. Используйте кисть для заживления или коррекции, чтобы удалить пятна, пыль и незначительные дефекты.
9. Создавать полностью чёткое изображение качественного публикации, сохраняя при этом эффективность в условиях ограниченных ресурсов.
   (Разместить дополнительный файл 1 здесь)

5. Подготовка и установка

1. Сборка рабочей станции для визуализации
   1. Поставьте стол для демпфирования вибраций на устойчивую поверхность.
   2. Разместите монтажную планку камеры в центре стола.
   3. Закрепите корпус цифровой камеры на рельсе с помощью жёсткого пластинчатого адаптера.
   4. Подключите выбранный микроскопический объектив (5×–20×) или макрообъектив через соответствующий адаптер для трубки.
   5. Установите два задних и два фронтальных источника света, оснащённые диффузорами для создания равномерного освещения.
   6. Установите опору объекта (XYZ stage или поворотный держатель) прямо под осью объектива.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ТОЧКА ПАУЗЫ: Вся фурнитура может оставаться собранной бесконечно, если покрыта для защиты от пыли.
2. Проверка выравнивания системы
   1. Убедитесь, что оптическая ось перпендикулярна плоскости образца.
   2. Регулируйте горизонтальные и вертикальные уровни с помощью микрометров уровня, пока отражения не станут симметричными.
   3. Убедитесь, что освещение однородно по всему полю; Переставляйте диффузоры по необходимости.

6. Калибровка цвета

1. Настройка освещения и окружения.
   1. Используйте рассеянный свет при ~6500 K (эквивалент дневного света).
      1. Минимизируйте окружающие отражения, окружая конструкцию тёмными, матовыми поверхностями.
   2. Калибровка цвета
      1. Сфотографируйте 24-пятную цветную эталонную таблицу под светом изображения.
      2. Сгенерируйте профиль камеры с помощью сопутствующего программного обеспечения калибровки.
      3. Применяйте этот профиль ко всем последующим RAW-изображениям во время конвертации.
      4. Откалибруйте монитор дисплея на γ = 2.2 и белую точку D65, чтобы обеспечить единообразную отображение цвета на протяжении всего рабочего процесса.

7. Монтаж и фокусировка образцов

1. Подготовка образцов.
   1. Закрепите высушенных или сохраненных на этаноле насекомых на мягком крепежном основании, например, на моделировочную глину.
   2. Ориентируйте экземпляр по желаемому виду (дорсальное, латеральное, вентральное или фронтальное).
   3. Разместить опору по центру под оптической осью.
2. Регулировка расстояния между фокус-стеком
   1. Определите начало и конец фокусного диапазона с помощью ближайших и самых дальних чётких плоскостей.
   2. Запрограммируйте инкрементальное движение от 0,2 мкм до 2 мкм в зависимости от увеличения.
   3. Синхронизируйте триггер захвата так, чтобы освещение срабатывало одновременно с каждой экспозицией изображения.
   4. Захват последовательностей из 50–2000 изображений в зависимости от размера образца и глубины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ТОЧКА ПАУЗЫ: Захват можно безопасно приостановить между последовательностями.

8. Обработка изображений

1. Конвертируйте и организуйте RAW-изображения.
   1. Перенесите файлы на локальный компьютер сразу после получения.
   2. Сгруппируйте каждый стек в уникальную папку с помощью инкрементальной нумерации.
   3. Применяйте профили объектива и цветокоррекции, затем экспортируйте изображения в 16-битные TIFF-файлы.
   4. Стек изображений
   5. Откройте стек TIFF в программном обеспечении для стека фокусов.
   6. Выберите алгоритм карты глубины (эквивалентный «Методу B») для первого композита.
   7. Опционально можно переналожить с помощью алгоритма усиления краёв («Метод C») и объединить оба выхода для максимизации резкости при уменьшении ореол.
   8. Сохраните финальный композит в формате без потерь.
2. Постобработка изображений
   1. Откройте композит в программе для редактирования изображений.
   2. Удалите фоновые артефакты и пыль с помощью инструментов селекции и исцеления.
   3. Отрегулируйте общую яркость и контраст для улучшения видимости морфологических признаков.
   4. Документируйте каждую корректировку для обеспечения отслеживаемости.
      Примечание: ТОЧКА ПАУЗЫ: Этап очистки можно возобновить позже без потери данных.

9. Контроль качества и хранение

1. Осмотрите итоговое изображение при 100% увеличении, чтобы убедиться, что не осталось никаких несогласований или смещений цвета.
2. Запишите все параметры изображения (увеличение, размер шага, экспозицию, версии программного обеспечения) в мета-листе.
3. Храните необработанные, промежуточные и финальные файлы на резервных дисках; Ведите цифровой журнал.

Results

Проверка качества и разрешения изображения

Система фокусного стека обеспечивала полностью чёткие, высококонтрастные композиты с увеличением от 5× до 20×. Рассчитанные масштабы пикселей варьировались от 0,76 мкм (5×) до 0,19 мкм (20×) в объектном пространстве, что подтверждает адекватный отбор образцов для субмикронных структурных деталей кутикулы и придатков насекомых. Репрезентативные стеки из 800–2000 кадров демонстрировали стабильную резкос...

Discussion

Оптимальная работа процедуры фокусного стека зависит от (i) полной изоляции установки от вибраций, (ii) точной калибровки фокус-рейка на субмикронных интервалах и (iii) согласованной калибровки цвета. Любое отклонение от этих параметров значительно увеличивает формирование гало и смещение^{цвета 9}. Сочетание механической устойчивости и стандартизированного освещения является самым важным фактором качества изображения.

Устранение неполадок...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Таблица поддержки	Предпочтительно 3 группы	Стабильная база для всей системы	150
Таблица антивибраций	Обычай	Минимизирует вибрации при захвате изображения	3,200
Цилиндрический чёрный тоннель	Обычай	Управление направлением света	350
Уменьшает отражения для небольших объектов
Фокусирующая стойка Novoflex CASTEL-MICRO (макрорейка)	Шаговый мотор и приборная панель; управляемый блок, сетевой кабель, адаптер Euro AC	Точное фокусирование субмикрон (0,2 и микро; m шагов);	3,000
автоматизирует движение камеры
XYZ роторный	Регулируемое крепление	Тщательное выравнивание и позиционирование объектов	500
Камера	Sony Alpha 7R IV (61 МП полный кадр)	Захват изображений в высоком разрешении	3,000
Освещение	2 раза; Годокс SK300II	Равномерное, безтенное освещение;	400
Освещение	2 раза; Годокс QT600II	Высокая скорость с коротким временем вспышки	1400
Флеш-стенды	3 регулируемых стенда	Гибкое положение освещения	100
Модификатор света	Диффузор	Смягчает свет и уменьшает резкие тени	50
Предыстория	“ Чёрная дыра» Бархат	Устраняет отражения, обеспечивает равномерный фон	200
Объективы микроскопа	План Mitutoyo Apo Infinity исправлено: 5 и раз;	Высококачественное увеличение микроструктур	1,000
План Митутойо Апо Инфинити исправлено: 7,5 раз;	2,000
План Митутойо Апо Бесконечность Исправлено: 10 раз;	1,400
План Митутойо Апо Бесконечность Исправлено: 20 и больше раз;	5,000
Система объективной трубки	Прямое использование объективов Mitutoyo M-Plan (2x, 5x, 7.5x, 10x, 20x)	Соединение микроскопических объективов с камерой	400
Адаптер	Универсальный байонет Sony E-mount на NOVOFLEX	Механическое соединение камеры и оптической системы	300
Макрообъектив	Venus Optics Laowa 100 мм f/2.8 2 и 2 раза; Ultra Macro APO (Sony E-mount)	Съёмка крупных образцов при большом увеличении	550
Триггер	Вспышка триггера	Синхронизирует вспышку с затвором камеры	50
Компьютер	ASUS или ноутбук Alienware, ≥ 128 ГБ оперативной памяти, высокопроизводительный процессор	Обработка и хранение изображений	3,000
Носители хранения	2 раза; SD 256 ГБ, быстрый считыватель SD-карт	Безопасное хранение и передача изображений в больших объемах	200
Аксессуары	Игровая мышь	Точность при редактировании и навигации	50
Аксессуары	Wacom One (графический планшет)	Тонкое управление при очистке и редактировании изображения	500
<Сильный>Общая стоимость			<>26 800< человек>