Этическое заявление
Все процедуры на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике биологических лабораторий Фуцзянь Амбри, номер одобрения: IACUC FJABR2024031202). Проводите все эксперименты на животных в соответствии с утверждённым институциональным протоколом ухода и использования животных.
СДД и подготовка ибупрофена
SDD состоит из Шисяо Сан (9 г), Сянфу (9 г), Мояо (6 г), Гуйчжи (9 г), Вэйлинсянь (12 г), Шицзяньчуань (20 г), Яньхусуо (12 г), Дангуй (9 г), Люцзину (15 г) и Сяохуэйсян (5 г). Шисяо Сан состоит из Пухуан (4,5 г) и Улинчжи (4,5 г). Все растительные компоненты использовались в виде концентрированных гранул и перечислены в Таблице материалов. Подготовьте SDD, растворив 106 г концентрированных гранул в 200 мл кипяточной воды, чтобы получить конечную концентрацию эквивалента сырого препарата в размере 0,53 г/мл. Тщательно перемешайте до полного растворения гранул, дайте раствору остыть до комнатной температуры и введите его внутрижелудочным вводом при концентрации 2,5 мл/кг за один раз. Подготовьте суспензию ибупрофена в соответствии с необходимой концентрацией для внутрижелудочной вентиляции. Назначайте ибупрофен в дозе 0,02 г/кг в качестве положительного контрольного лечения.
Животные и группировка
Используйте 36 здоровых взрослых самок крыс рода Спраг-Доули специфического степени, свободного от патогена, в возрасте 2–3 месяцев и весом 200 ± 20 г, без истории беременности или спаривания. Поддерживайте крыс в режиме 12 часов на 12 часов свет/тёмный цикл при температуре 22 ± 2 °C и относительной влажности 50%–70%, с свободным доступом к стандартной еде и питьевой воде. После 1 недели акклиматизации случайным образом распределите крыс на шесть групп (n = 6 на группу): пустую, модельную, SDD, TEAP, SDD + TEAP и группы ибупрофена.
Подготовка и администрирование модели QSBSPD
В этом эксперименте была использована широко принятая модель дисменореи, вызванной ОТ. Вкратце, эструозные циклы крыс оценивались с помощью вагинальных мазков. Крысы считались подходящими для включения в исследование, если их эструсный цикл был определен как 4–5 дней.
За исключением пустой группы, крысам в экспериментальных группах ежедневно вводились подкожные инъекции эстрадиол бензоата и эпинефрина гидрохлорида в течение 10 дней. После инъекции гидрохлорида эпинефрина в дозе 0,9 мг/кг в сутки крысы подвергались воздействию различных комбинированных стимуляций (A: Акустическая стимуляция: крысы подвергались воздействию акустических стимулов (90 дБ, 1 кГц) в течение 5 минут в течение 3–4 раза в день, с интервалом в 2 часа между каждым разом. B: Световая стимуляция: крысы подвергались движению мигающих световых стимулов в течение 5 минут в течение 3–4 раза в день, с интервалом в 2 часа между каждым разом. C: Электрическая стимуляция: крыс подвергались электрической стимуляции (бифазным импульсам квадратных волн) при 30–35 В с переменным током в течение 0,3 с каждые 2 секунды. Эта стимуляция проводилась по 5 минут каждые 2 часа 2–4 раза в день. D: Сдерживание: крыс помещали в клетку из колючей проволоки, размером примерно 25 см в длину и 5 см в диаметре. Оказавшись внутри клетки, концы зажимались, чтобы обездвижить крыс и ограничить их движение на 2 часа, один раз в день). Кроме того, на 1-й и 10-й дни крысам подкожно вводили 5,0 мг/кг/день эстрадиол бензоата, а на 2–9 дни — 2,5 мг/кг/день.
Начиная с 5-го дня инъекции эстрадиола бензоата крысы получали внутрижелудочный ввод различных препаратов в течение 7 дней, дважды в день с 10:00 утра и 16:00, за исключением группы ибупрофена, которая принимала один раз в день в 10:00 утра. В группах Blank, Model и TEAP крысам вводили 2,5 мл/кг физиологического раствора. В группах SDD и TEAP+SDD крысы получали 2,5 мл/кг SDD (приготовлено в виде 106 г сырого препарата, растворённого в 200 мл воды, 0,53 г/мл); Эта доза была преобразована из взрослой клинической суточной дозы в 106 г на основе эквивалентности площади тела, что привело к дозе, эквивалентной крысе. В группе ибупрофена крысы получали 0,02 г/кг суспензии ибупрофена. В группах TEAP и TEAP+SDD крысы получали стимуляцию TEAP, начиная с 5-го дня после инъекции эстрадиола бензоата. Прикрепить электроды к двусторонним ушным точкам Цзяогань, Шэньмэнь, Нэйшэнчжици и Нэйфэнми, согласно ранее опубликованному стандарту для локализации акупунктурных точеккрыс 12. Эти точки расположены в двусторонней конхальной полости уха, иннервируемой блуждающим нервом. Электроды подключались к электронному прибору игольной терапии, который подавал непрерывную волну в течение 20 минут (частота: 20 Гц; интенсивность: 1 мА) один раз в день. Крысы группы TEAP+SDD ежедневно проходили TEAP после первого введения SDD. Финальная стимуляция TEAP проводилась перед внутрибрюшной инъекцией ОТ.
Через 24 часа после последней инъекции бензоата эстрадиола, то есть на 11-й день, через 1 час после последнего внутрижелудочного введения, за исключением групп с пустым и TEAP, крысы в других группах получали 2 U ОТ на крысу при инъекции внутрибрюшности. Крысы из группы TEAP прошли внутрибрюшинную инъекцию ОТ с дозой 2 U на крысу после финальной стимуляции TEAP. Крысы в пустой группе не получали инъекции эрготерапии. Этот протокол успешно создал крысиную модель QSBSPD. Общий отбор животных, подготовка моделей, график введения лекарств, параметры стимуляции TEAP и расположение ушных точек приведены на рисунке 1.
Окрашивание Райта-Гимсы
Эстрозный цикл был определен по методу Райта-Гимсы окрашивания вагинальных мазков. Стерильная ватная палочка была увлажнена раствором хлорида натрия 0,9% и аккуратно введена на 0,5–1,0 см в вагинальный канал. Мазок вращали 1–2 раза для сбора вагинальных эксфолированных клеток, и образец равномерно размазывали по чистому стеклянному стеклу в одном направлении. Мазок сушили на воздухе при комнатной температуре. Был добавлен раствор для окрашивания Wright-Ghimsa, чтобы закрыть мазок, и он инкубировался в течение 5 минут. Затем в раствор для окрашивания добавляли равный объём физиологического раствора, буферированного фосфатами, и окрашивание продолжалось ещё 5 минут. Стекло было аккуратно промыто три раза ультрачистой водой, высушено на воздухе и осмотрено под световым микроскопом. Стадия эстрозного цикла определялась по доминирующим типам клеток, включая ядреные эпителиальные клетки, огуженные эпителиальные клетки и лейкоциты.
Сбор образцов
Крыс помещали в индукционную коробку для анестезии с концентрацией изофлурана на уровне 3–5%. После того как крысы потеряли сознание, их перевели на операционный стол и содержали под наркозом с масками. Концентрация снизилась до 1,5–2,5%. Брюшная шерсть крысы подстригалась ножницами и затем дезинфекцировалась с помощью местного применения спирта. Разрез длиной 2–3 см был сделан вдоль срединной линии брюшной полости. Одна сторона матки вместе с её связками была экстериоризована, а жировая ткань, прилипшая к поверхности матки, была удалена. Ткань матки была тщательно выделена. Если крыса жива после отбора проб, усыпьте её с помощью CO₂ асфиксии.
Окрашивание гематоксилином и эозином (HE)
Ткани матки фиксировались, встраивались в парафин и секционировали толщиной 5 мкм. Секции дважды обрабатывали в ксилоле по 10 минут каждая. Затем секции последовательно регидратировались абсолютным этанолом дважды по 5 минут каждая, затем 95%, 90%, 80% и 70% этанола по 5 минут каждая. Секции промывались в ультрачистой воде. Окрашивание гематоксилином проводилось в течение 5 минут, после чего срезы промывали водой, пока не осталось лишнего красителя. Секции погружались в физиологический раствор с фосфатным буфером на 5 минут для посинения. Затем участки покрасили эозином в течение 1 минуты и промывали водой. Впоследствии секции были обезвожены в 95% этаноле в течение 10 минут и абсолютном этаноле в течение 10 минут, затем очищены в ксилоле в течение 10 минут и закреплены нейтральной смолой. Репрезентативные изображения получались с помощью светового микроскопа или цифрового слайд-сканера.
Ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA)
Свежие ткани матки промывались предварительно охлаждённым фосфат-буферным физиологическим раствором для удаления остаточной крови. Каждый образец ткани взвешивали, нарезали на мелкие кусочки и гомогенизировали в предварительно охлажденном фосфатно-буферном физиологическом растворе с соотношением тканей к буферу 1:9. Гомогенат центрифугировали при 5000 × г в течение 5–10 минут при 4 °C, после чего супернатант собирали для последующего анализа. Уровни IL-1β, IL-6, TNF-α, PGF2α и PGE2 измерялись с помощью наборов LISA для крыс согласно инструкциям производителя. Все реагенты и микропластиночные полоски были уравновешены до комнатной температуры перед использованием. В назначенные скважины добавлялись стандарты или образцы (50 мкл). В каждую яму, кроме пустых ямак, добавляли антитела к обнаружению пероксидазой хрена (100 мкл), а пластину герметизировали и инкубировали при 37 °C в течение 60 минут. Жидкость сбрасывалась, и каждую скважину промывали пять раз разбавленной буферной жидкостью. Впоследствии в каждую скважину добавляли 50 мкл субстрата A и 50 мкл субстрата B, после чего следовала инкубация при температуре 37 °C в темноте в течение 15 минут. Затем в каждую скважину добавлялся стоп-раствор (50 мкл), а оптическая плотность измерялась на 450 нм за 15 минут. Концентрации образцов рассчитывались по стандартным кривым.
Количественное ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)
Общая РНК была извлечена из тканей матки с помощью реагента для экстракции полной РНК согласно инструкциям производителя. Кратковременно ткань измельчалась в жидком азоте, и добавляли 1 мл реагента для экстракции РНК. Лизат инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем добавляли хлороформ (200 мкл), и интенсивно взбавливали смесь в течение 15 секунд, инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут и центрифугировали при 12 000 × г в течение 12 минут при 4 °C. Водная фаза была перенесена в новую трубку, аккуратно смешивалась с равным объёмом изопропанола и инкубировала при −20 °C в течение 15 минут. Образцы были центрифугированы при 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C, супернатант был выброшен, а РНК-гранулу промыли 75% этанолом. Гранулы сушили на воздухе и растворяли в воде без РНаз. Концентрация и чистота РНК определялись с помощью микрообъёмного спектрофотометра. Геномная ДНК была удалена, а кДНК синтезирована согласно инструкциям реагента обратной транскрипции. Для удаления геномной ДНК общая РНК инкубировала с реагентом для удаления геномной ДНК при 42 °C в течение 5 минут, после чего помещалась на лёд. Обратная транскрипция проводилась при 50 °C в течение 15 минут, затем при 75 °C в течение 5 минут для завершения реакции.
ПЦР в реальном времени проводилась с использованием микса qPCR на базе SYBR Green. Каждая реакция на 20 мкл содержала 2 мкл кДНК, 0,4 мкл прямого праймера, 0,4 мкл обратного праймера, 10 мкл смеси 2× SYBR qPCR и 7,2 мкл воды без нуклеазы. qPCR проводился по следующей циклической программе: 95 °C в течение 1 минуты; 40 циклов при 95 °C в течение 20 с, 56 °C в 20 с и 72 °C в течение 38 с; затем следует анализ кривой плавления. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля, а относительная экспрессия мРНК рассчитывалась с помощью метода 2−ΔΔCt . Каждый биологический образец измерялся в техническом тройном экземпляре. Среднее значение Ct технических тройных копий использовалось для расчёта экспрессии ΔCt и относительной мРНК для каждой биологической реплики. Последовательности праймеров следующие: PPAR-γ2, прямой 5′-CGGAAGCCCTTTGGTGGTGACTT-3′ и обратный 5′-CTCGGGGCTTCACGTTCA-3′; COX-2, впереди 5′-AACCAGGTGAACTTCGTCTATTAG-3′ и обратно 5′-GGTCGGTTTGATGTCACTTA-3′; GAPDH, впереди 5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′ и обратно 5′-GGTGGTCCAGGGGTTCTTACTC-3′.
Статистический анализ
Данные анализировались с помощью статистического программного обеспечения. Все количественные данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение. Для анализа qRT-PCR технические трипликаты сначала усреднялись для каждой биологической реплики, а статистический анализ проводился с использованием значений биологической реплики. Сравнения между несколькими группами проводились с помощью одностороннего анализа дисперсии, а затем пост-хок тестов Бонферрони, когда данные соответствовали предположениям нормальности и однородности дисперсии. Статистическая значимость была определена как P < 0,05.