Методическая статья

Метаболическая маркировка зарождающегося транскриптома в раннем эмбриогенезе Xenopus

DOI:

10.3791/70591

⸱

27 марта 2026 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы предлагаем подробные методы метаболического маркировки и очистки зарождающихся транскриптов для анализа транскриптома у ранних эмбрионов Xenopus с использованием 5-этинилуридина (5-EU).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ранний эмбриогенез требует новой транскрипции зиготных генов из изначально спящего зиготного генома после оплодотворения. Одной из главных задач стало точное обнаружение новых транскриптов и определение времени их экспрессии во время активации зиготного генома (ZGA). Здесь мы предлагаем подробные процедуры метаболической маркировки зарождающихся транскриптов с помощью 5-этинил-уридина (5-EU) в ранних эмбрионах Xenopus laevis . После оплодотворения 5-EU микроинъецируется в эмбрионы 1-клеточной стадии для метаболической маркировки вновь транскрибирированных РНК во время ZGA. Зарождающиеся EU-РНК затем очищаются после биотинилирования с помощью реакций, опосредованных клик-химией, а зарождающийся транскриптом определяется с помощью секвенирования следующего поколения. Важно, что этот метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет характеризуть гены с низким уровнем активации. Таким образом, этот подход предоставляет мощный инструмент для изучения динамики транскрипции генов на ранних этапах развития и может быть обобщён на другие эмбриональные системы или ткани.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После оплодотворения эмбрион находится под контролем материнских факторов, отложенных в яйцеклетке, в то время как зиготический геном некоторое время транскрипционно недоступен; Он активируется для транскрипции сотен и тысяч генов, необходимых для последующего развития, включая специфику судьбы клеток и формирование зародышевыхслоёв 1,2,3,4,5,6. Это явление активации зиготного генома (ZGA) во время материнского перехода к зиготному (MZT) высоко консервативно у всех метазоев, хотя время возникновения ZGA варьируется у разныхвидов 1,2,3,4,5,6. Понимание того, как регулируется ZGA, важно не только для понимания фундаментальных принципов раннего развития, но и открывает потенциал для разработки новых стратегий диагностики и лечения нарушений развития, а также повышения репродуктивного здоровья.

Одной из главных задач при изучении ZGA стало точное обнаружение новых транскриптов и определение времени их появления во время активации зиготического генома (ZGA). Из-за преобладания материнских транскриптов в раннихэмбрионах 7, высокие уровни этих транскриптов могут скрывать обнаружение новых транскриптов во время ZGA, особенно для генов с низкой активацией, используя традиционный объёмный РНК-секвенс. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали метод измерения зарождающегося транскриптома с помощью метаболической маркировки зарождающихся транскриптов 5-этинилуридином (5-EU), затем биотинилирования зарождающихся EU-РНК с помощью щелк-химии и их очистки для секвенирования (EU-RNA-seq)8,9,10. В отличие от других начинающих методов профилирования транскриптов, таких как использование 4-тиуридина (4sU)11,12, маркировка 5-EU очень специфична с помощью щелк-химии, может использоваться как для визуализации, так и для секвенирования, и не требует химического преобразования. Кроме того, зарождающаяся EU-РНК-секвенция очень чувствительна и обнаруживает сотни генов, активация которых не может быть обнаруживана обычным объёмомРНК-seq 8. Этот подход также позволил точно определить начало индивидуальной активации зиготных генов и пропрофилировать отличительные пространственно-временные паттерны ZGA в раннемэмбриогенезе 8.

Здесь мы описываем подробные процедуры подготовки образцов для EU-RNA-seq с целью профилирования зарождающегося транскриптома с использованием ранних эмбрионов Xenopus laevis в качестве модели. Этот протокол адаптирован из предыдущего метода10,13 с незначительными оптимизациями процедур, включая микроинъекцию 5-EU в эмбрионы 1-клеточной стадии, биотинилирование зарождающихся EU-РНК посредством щелчковой реакции и их очистку для секвенирования (см. рисунок 1). Для обеспечения воспроизводимости, в зависимости от стадий ранних эмбрионов с разным количеством зарождающихся транскриптов следует использовать 1–10 мкг общей РНК в качестве входа, хотя всё равно можно использовать меньшее количество. Этот протокол может применяться в других эмбриональных системах, таких как дрозофила14 и данио15, а также в другихтканях 13. Этот метод является мощным инструментом для понимания транскрипции генов и регуляторных механизмов в различных биологических процессах, включая раскрытие новых принципов раннего эмбриогенеза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работы с животными, описанные в этом исследовании, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Южной Каролины. Безопасность лабораторий и утилизация отходов должны соответствовать институциональным нормам.

1. Подготовка реагентов и буферов

  1. 20x MMR (Marc's Modified Ringer) раствор: смешать 100 мМ HEPES, 2 мМ EDTA, 2 млн NaCl, 40 мМ KCl, 20 мМ MgCl2 и 40 мМ CaCl2. Отрегулируйте pH до 7.8 с NaOH. Автоклав и хранение при комнатной температуре.
  2. 3% Ficoll (w/v)/0,5x MMR: Медленно добавляйте 1,5 г Ficoll 400 в 50 мл с 0,5x MMR, аккуратно перемешивая магнитной мешалкой, пока Ficoll полностью не растворится. Используйте автоклав и держите температуру 4 °C до использования.
  3. 5-этинилуридиновый (5-EU) раствор: Для получения 50 мМ стандартного раствора добавьте 372,8 мкл буфера (обратите внимание, что можно использовать любой буфер, совместимый с микроинъекцией, например, 1x TBS, pH 7,6) в флакон по 5 мг. Хорошо перемешайте и сделайте 2 мкл аликвот. Храните при -80 °C.

2. Микроинъекция 5-EU в 1-клеточные эмбрионы

  1. Для получения эмбрионов Xenopus следует стандартным протоколам проведения экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) (например, см. Sive et al., 2007)16. Эмбрион должен быть в 0,1x MMR и готов к использованию.
  2. Добавьте 1 мл 3% Ficoll/0,5x MMR в камеру для микроинъекции из стандартного стеклянного затвора (25 мм x 75 мм). Используйте пластиковую пипетку для переноса 20 (или более, если нужно) эмбрионов в центр камеры микроинъекций.
  3. Используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно обрезать очень тонкий конец стеклянной спицы и прикрепите иглу вертикально (с кончиком вниз) к моделирующей глине на стене стола. Используйте пипетку P2 с наконечником микрозагрузчика, чтобы добавить 0,5 мкл 50 мМ 5-EU с верхней части стеклянной иглы.
  4. Соберите иглу на микроманипуляторе. Используйте пипетку P10, чтобы добавить 10 мкл галоуглеродного масла на сценический микрометр и поместить его под стереомикроскоп.
  5. Для калибровки объёма впрыска сначала используйте ножку, чтобы нажать на площадку на пол, связанный с микроинжектором, и ввести каплю в галоуглеродное масло на микрометре. В зависимости от размера капли отрегулируйте давление и время впрыска на микроинжекторе, чтобы определить объём впрыска в 10 nL, то есть 0,27 мм в диаметре микрометра.
  6. Используйте пинцет в одной руке для удержания эмбриона, другой — для микроманипулятора, и введите 10 nL 50 mM EU в эмбрионы на стадии 1 клетки. Итоговая концентрация 5-EU в эмбрионе составляет ~0,5 мМ.
  7. После микроинъекции используйте пластиковую трансферную пипетку, чтобы переместить эмбрионы из камеры в новую стеклянную чашу, содержащую 3% Ficoll/0,5x MMR. Держать инъекционные эмбрионы в Фиколле ~1 час.
  8. Аккуратно снимите раствор Ficoll и замените среду на 0,1x MMR. Держите эмбрионы в 0,1x MMR до дальнейшего использования. Постоянно следите за развитием эмбрионов и при необходимости удаляйте любые аномальные эмбрионы.
  9. Когда эмбрионы достигнут желаемых стадий развития, используйте пластиковую трансферную пипетку для переноса 10 эмбрионов в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл. Используйте пипетку P200, чтобы аккуратно удалить остатки из пробирки и быстро заморозьте эмбрионы в жидком азоте.
    Примечание: Для обеспечения строгости и воспроизводимости берите только те эмбрионы, которые являются нормальными по внешнему виду по сравнению с контролем. Удалить и исключить любые аномальные эмбрионы из дальнейшего анализа. При необходимости также собирайте такое же количество эмбрионов без микроинъекций, как при отрицательных контролях.
  10. Храните эмбрионы в морозильнике при температуре -80 °C до дальнейшего использования.

3. Общая экстракция и измерение концентрации РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте набор для общей экстракции РНК на основе кремнеземной мембраны для выделения полных РНК из ранних эмбрионов и флуоресцентный набор для количественной оценки высокочувствительной РНК для определения концентраций РНК. Следуйте инструкциям, предоставленным набором, и следующие шаги немного изменяются по сравнению с инструкцией. Все растворы и реагенты, используемые в следующих шагах, должны быть без РНаз.

  1. Положите образцы из морозильника при -80 °C на лёд.
  2. Добавьте 700 мкл буферного RLT из набора для экстракции РНК в каждую трубку. Используйте пипетку P1000 для пипетки вверх и вниз не менее 15 раз или до тех пор, пока все эмбрионы не растворятся.
  3. Держите образцы на льду 20 минут. Аккуратно перемешайте снова, пипетируя вверх и вниз не менее 10 раз, чтобы полностью угомилизационировать эмбрионы.
  4. Добавьте 700 мкл этанола 70% в гомогенизированные эмбрионы. Пипеты вверх и вниз, чтобы хорошо перемешивать, и переложить 700 мкл смеси в спин-колонку.
  5. Центрифугуйте колонку при 10 000 x g на 1 минуту. Отбросьте поток от прохождения. Повторяйте центрифугу, пока остальная смесь не будет готова.
  6. Добавьте 350 мкл буфера RW1 и центрифугуйте колонку при 10 000 x g на 1 минуту. Отбросьте поток.
  7. Аккуратно добавьте 80 мкл ДНКазы I в центр мембраны в колонке. Инкубировать 15 минут при комнатной температуре.
  8. Добавьте 350 мкл Buffer RW1 и центрифугуйте колонку при 10 000 x g в течение 1 минуты. Отбросьте поток.
  9. Добавьте 500 мкл Buffer RPE и центрифугуйте колонку при 10 000 x g на 1 минуту. Отбросьте поток. Повторите стирку ещё раз.
  10. Высушите колонку, снова центрифугая при 10 000 x g в течение 2 минут.
  11. Перенесите колонку в новую трубку без РНаз. Аккуратно добавьте 35 мкл РНаз-свободного H2Oв центр мембраны в колонке.
  12. Центрифугуйте колонку при 10 000 x g на 1 минуту. Соберите элюированную РНК и храните на льду.
  13. Чтобы измерить концентрацию РНК, сначала подготовьте рабочий раствор с помощью комплекта для количественной оценки РНК, разбавляя реагент (краситель) в буфере РНК в 1:200. Рассчитайте общий объём рабочего раствора в зависимости от общего количества стандартов и подготовьте 200 мкл для каждого стандарта или образца.
  14. Установите 8-трубную полосу объемом 0,2 мл. Чтобы разбавить каждый стандарт, добавьте 10 мкл к 190 мкл рабочего раствора. Чтобы разбавить каждый образец, добавьте 1 мкл к 199 мкл рабочего раствора. Хорошо перемешивайте.
  15. Поставьте 8-трубную полосу в люорметр. Выберите РНК-анализ, откалибруйте по стандартам и считайте концентрации образцов.

4. Зарождающаяся биотинилирование и очистка EU-РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для биотинилации и опускания зарождающихся РНК используется набор для захвата зарождающихся EU-РНК на основе щелкающей химии. Следуйте инструкциям, предоставленным набором, и следующие шаги будут немного изменены. РНК из неинъекционных эмбрионов, а также EU-РНК без биотинилирования могут служить фоновыми контролями специфичности для вытяжения.

  1. Биотинилирование и очистка РНК
    1. Для каждого образца смешивайте следующие компоненты в микроцентрифугной трубке объёмом 1,5 мл для получения щелчковой реакции 50 мкл: общая РНК (1–10 мкг), 1x европейский буфер, 2 мМCuSO 4, 0,25 мМ биотинового азида, 10 мМ аддитив 1 и 12 мМ аддитив 2.
    2. Инкубировать реакционную смесь при комнатной температуре в течение 30 минут на нутаторе.
    3. В каждой вышеуказанной реакции добавьте 1 мкл гликогена, 50 мкл 7,5 М аммония ацетата и 700 мкл охлаждённого 100% этанола. Пипетки вверх и вниз 5 раз, чтобы хорошо перемешать.
    4. Поставьте трубку в морозильник при температуре -80 °C и оставьте на ночь.
    5. Центрифугуйте трубку при 13 000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Аккуратно удалите супернатант, не трогая гранулу.
    6. Добавьте 700 мкл этанола 75% и аккуратно перемешайте, чтобы пеллеты снова суспензировали. Центрифугуйте трубку при 13 000 x g на 5 минут при 4 °C. Аккуратно удалите супернатант, не трогая гранулу. Повторите стирку ещё раз.
    7. Сушите пеллет на воздухе 5–10 минут при комнатной температуре. Ресуспензировать гранулу в 10 мкл РНаз-свободной H2O.
  2. Очистка EU-РНК
    1. Для удаления зарождающихся EU-РНК на каждый образец наносите 5 мкл магнитных шариков, покрытых стрептавидином, в новую микроцентрифуговую трубку объёмом 1,5 мл.
    2. Добавьте 9 мкл буфера для мойки 2. Хорошо перемешайте и поставьте трубку на магнитную стойку. Дайте постоять 2 минуты. Удалите супернатант. Повторите стирку ещё два раза. Подвесьте бусины в 5 мкл буфера Wash Buffer 2.
    3. Подготовьте следующую мастер-смесь в новой микроцентрифугной пробирке объёмом 1,5 мл (15 мкл на каждый образец): 12,5 мкл буфера связывания РНК (компонент G), 0,2 мкл разбавлённого РНазного выхода 1:10 и 2,3 мкл РНК-свободногоH 20. Добавьте 15 мкл смеси в каждую пробирку с образцом РНК.
    4. Инкубировать 5 минут на нагревательном блоке при 69 °C. Поставьте трубку на лед.
    5. Добавьте 5 мкл вышеуказанных заранее промытых шариков в каждую пробирку с образцом РНК. Инкубировать 30 минут на нутаторе при комнатной температуре.
    6. Добавьте 50 мкл буфера для мойки 1. Хорошо перемешайте и поставьте трубку на магнитную стойку. Дайте постоять 2 минуты. Удалите супернатант. Повторите стирку ещё 4 раза.
      Примечание: Супернатант после первого промывания, который, предположительно, содержит только материнские транскрипты, может быть собран для измерения материнского транскриптома.
    7. Добавьте 50 мкл буфера для мойки 2. Хорошо перемешайте и поставьте трубку на магнитную стойку. Дайте постоять 2 минуты. Удалите супернатант. Повторите стирку ещё 4 раза.
    8. Подвесьте бусины в 5 мкл буфера Wash Buffer 2. Бусины, содержащие зарождающиеся EU-РНК, готовы к прямому синтезу кДНК и подготовке библиотеки.
      Примечание: Перед переходом к подготовке библиотеки обогащение зарождающихся транскриптов можно оценить, измеряя экспрессию известных отдельных генов с помощью обратной транскрипционно-полимеразной цепной реакции (RT-PCR).

5. Подготовка и секвенирование библиотек РНК

  1. Используйте коммерчески доступные наборы для подготовки библиотек cDNA и следуйте инструкциям, предоставленным набором. Используйте NEBNext Library Quant Kit для Illumina, чтобы количественно оценить библиотеки и объединить их.
  2. Объединяйте библиотеки, следуя инструкциям из широко используемых комплектов секвенирования следующего поколения. Разведите библиотеки до ~1,8 pm перед загрузкой в настольный секвенсор, чтобы добиться оптимальной плотности кластера ~200k/mm 2 во время секвенирования. Секвенируйте библиотеки с использованием распространённой секвенирования следующего поколения. Использовали парное 75-бп секвенирование для ~20 миллионов чтений на выборку.
  3. Количественно определить транскриптомические чтения, выравнивая последовательности с геномом Xenopus laevis build 9.2 с использованиемлосося 17 и проводите дифференциальный анализ экспрессии генов с использованием DESeq218. Чтобы визуализировать пики в браузере генома, сопоставьте последовательности с геномом с помощьюSTAR 19 и отобразите в Integrative Genomics Viewer (IGV)19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбрионы Xenopus laevis (четыре биологических реплики) на стадиях с 5 по 9 часов после оплодотворения (HPF) при 22 °C, охватывающие стадии от 5-й стадии (с небольшим масштабным ZGA) до 9-й стадии (с высоким ZGA), были обработаны согласно протоколу, указанномувыше 8. Для подготовки библиотек использовались общие РНК, очищенные зарождающиеся EU-РНК и проточные РНК. Как показано на рисунке 2, сравнивая зарождающийся транскриптом...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы предоставили подробный протокол метаболической маркировки зарождающегося транскриптома в раннем эмбриогенезе, включая микроинъекцию 5-EU в 1-клеточные эмбрионы, экстракцию всего РНК и измерение их концентрации, а также биотинилирование и очистку зарождающихся EU-РНК для подготовки и секвенирования в библиотеке (EU-RNA-Seq) (Рисунок 1). Благодаря высокой чувствительности и специфичности подхода по сравнению с общей РНК-секвенцией, этот протокол позво...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор заявляет, что нет конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим лабораторию Мэттью Гуда при Университете Пенсильвании за предоставленное обучение. Эта работа частично поддерживалась Национальным институтом здоровья детей и развития человека имени Юнис Кеннеди Шрайвер (R03HD105802).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
& микро; Микроинжектор PUPMWorld Precision InstrumentsUPUMPДля микроинъекции (микроинъекции с давлением)
5-эхтинилуридинТермо Фишер СайентификE10345Для микроинъекции (маркировка зарождающихся тракнскриптов)
Стереомикроскопы ACCU-SCOPE 3075 ZoomVWR470351-130Для микроинъекций (визуализация эмбрионов)
Ацетат аммонияСигма-ОлдричA2706Для осадки РНК
Аскорбиновая кислотаСигма-ОлдричA7506Для клик-реакции
Боросиликатные стеклянные капиллярыWorld Precision InstrumentsTW100-4Для микроинъекций (изготовление стеклянных игл)
ЦентрифугаЭппендорф5425RДля центрифуг
Набор для захвата зарождающейся РНК Click-iTТермо Фишер СайентификC10365Для биотинилирования и очистки зарождающейся РНК
CuSO4Сигма-Олдрич61230Для клик-реакции
DNase IRoche Diagnostics4716728001Для экстракции РНК
Ficoll 400Сигма-ОлдричGE17-0300-10Для микроинъекций (инкубационных эмбрионов)
Чашка Петри Стекла (60 мм)VWR75845-542Для удобрения
ГликогенТермо Фишер СайентификAM9510Для осадки РНК
Halocarbon Oil 27Сигма-ОлдричH8773Для микроинъекции (калибровка объёма инъекции)
L-цистеинСигма-Олдрич168149Для обезжильвания эмбрионов
Насадки микрозагрузчикаCalibre ScientificEPE-5242956003Для микроинъекции (загрузка 5-EU в стеклянную иглу)
Количественный набор библиотеки NEBNext для IlluminaNEBE7630Для количественной оценки библиотеки
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (75 CYS)Illumina20024906Для секвенирования
Флюорметр Qubi FlexТермо Фишер СайентификQ33327Для измерения концентрации РНК
Набор для связывания кубитной РНК HSТермо Фишер СайентификQ32852Для измерения концентрации РНК
Мини-комплект RNeasyЦягэн74104Для экстракции РНК
Ступень микрометраНаука Уорда470175-914Для микроинъекции (калибровка объёма инъекции)
Универсальное РНК-секвенирование с NuQuantNuGEN0364Для подготовки библиотеки

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, M. T., Bonneau, A. R., Giraldez, A. J. Zygotic genome activation during the maternal-to-zygotic transition. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 581-613 (2014).
  2. Jukam, D., Shariati, S. aM., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  3. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), (2019).
  4. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  5. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
  6. Tadros, W., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition: A play in two acts. Development. 136 (18), 3033-3042 (2009).
  7. Schier, A. F. The maternal-zygotic transition: Death and birth of rnas. Science. 316 (5823), 406-407 (2007).
  8. Chen, H., Good, M. C. Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis. Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).
  9. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  10. Chen, H. Quantifying nascent transcription in early embryogenesis. Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).
  11. Heyn, P., et al. The earliest transcribed zygotic genes are short, newly exmaved, and different across species. Cell Rep. 6 (2), 285-292 (2014).
  12. Bhat, P., et al. Slamseq resolves the kinetics of maternal and zygotic gene expression during early zebrafish embryogenesis. Cell Rep. 42 (2), 112070(2023).
  13. Palozola, K. C., Donahue, G., Zaret, K. S. Eu-rna-seq for in vivo labeling and high throughput sequencing of nascent transcripts. STAR Protoc. 2 (3), 100651(2021).
  14. Kwasnieski, J. C., Orr-Weaver, T. L., Bartel, D. P. Early genome activation in drosophila is extensive with an initial tendency for aborted transcripts and retained introns. Genome Res. 29 (7), 1188-1197 (2019).
  15. Chan, S. H., et al. Brd4 and p300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation. Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).
  16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. , (2007).
  17. Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  18. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for rna-seq data with deseq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  19. Dobin, A., et al. Ultrafast universal rna-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  20. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  21. Ma, S., Hong, Y., Chen, J., Xu, J., Shen, X. Single-cell nascent transcription reveals sparse genome usage and plasticity. Cell. 188 (24), 6873-6891.e23 (2025).
  22. Battich, N., et al. Sequencing metabolically labeled transcripts in single cells reveals mrna turnover strategies. Science. 367 (6482), 1151-1156 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Xenopus5

Похожие статьи