Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация активации зиготного генома в отдельных клетках ранних эмбрионов

397 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70592

⸱

3 апреля 2026 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем методы визуализации зарождающейся транскрипции во время активации зиготного генома в отдельных клетках на раннем этапе эмбриогенеза.

Аннотация

Ранний эмбриогенез требует перехода от матери к зиготному (MZT), который требует активации зиготного генома (ZGA). Во время ZGA транскрибируются сотни, а то и тысячи генов, что необходимо для различных процессов раннего развития эмбриона, включая поддержание выживаемости эмбриона, спецификацию судьбы клеток и формирование зародышевой слоя. Одной из главных задач в изучении ZGA стало прямое визуализирование ZGA в отдельных клетках ранних эмбрионов. Здесь мы описываем метод прямой визуализации ZGA в отдельных клетках ранних эмбрионов посредством метаболической маркировки зарождающихся транскриптов с помощью 5-этинилуридина (5-EU), затем конъюгации зарождающихся EU-РНК флуорофорами с помощью щелк-химии и визуализации их в эмбрионах с цельным монтажом с помощью конфокальной микроскопии, используя Xenopus laevis в качестве модели. Этот метод позволил нам отслеживать одноклеточную ZGA в эмбрионах с целым монтажом и выявить гетерогенное начало ZGA во времени и пространстве в раннем эмбриогенезе. Он может использоваться в других эмбриональных системах или тканях для изучения транскрипции генов и регуляции генома на уровне отдельных клеток.

Введение

На раннем этапе развития эмбрион проходит переход от матери к зиготному (MZT), который постепенно меняет контроль развития с материнских факторов на зиготные гены. MZT требует активации изначально спящего зиготного генома — процесса, называемого активацией зиготного генома (ZGA); гены, экспрессируемые во время ZGA, необходимы для ранней спецификации судьбы клеток, гаструляции и формированияосей 1,2. Важно, что ZGA сохраняется во всех метазоях, а время появления ZGA строго контролируется, хотя оно варьируется у разныхвидов 3,4. Дисрегуляция ZGA может привести к серьёзным последствиям — от дефектов развития до эмбриональной гибели, например, выкидыша. Поэтому изучение механизмов ZGA важно не только для понимания основ регуляции генов, но и имеет значительные клинические последствия.

Одной из главных задач при изучении ZGA стало прямое визуализация крупномасштабного ZGA в ранних эмбрионах и изучение его механизмов на уровне одной клетки. Мы преодолели эту задачу, разработав метод, использующий метаболическую маркировку зарождающихся транскриптов во время ZGA с помощью 5-этинилуридина (5-EU), затем конъюгации зарождающихся EU-РНК с флуорофорами с помощью щелк-химии и визуализации в эмбрионах целого монтажа с помощью конфокальной микроскопии, используя Xenopus laevis в качестве модели. Крупный эмбрион Xenopus (диаметром ~1,2 мм) имеет градиент размером с клетку, а крупномасштабный ZGA встречается примерно на средних стадиях бластулы (с началом около 7-й стадии и пиком около 9-й), что делает его идеальной моделью для изучения узоровZGA-5. Используя маркировку 5-EU в ранних эмбрионах Xenopus, мы смогли напрямую визуализировать и количественно оценить крупномасштабную ZGA в отдельных клетках целостных ранних эмбрионов, что привело к открытию нового пространственно-временного паттерна ZGA, в основном регулируемого размеромклеток 5,6.

Здесь мы описываем детали этого подхода, адаптированного из предыдущих работ соптимизацией 5,7, включая фиксацию эмбрионов после метаболической маркировки зарождающихся транскриптов с помощью 5-EU, конъюгирование зарождающихся EU-РНК с флуорофором с помощью щелчковойреакции 8, а также иммунное окрашивание субклеточных маркеров, затем очищение эмбрионов для конфокальной визуализации. Этот метод может применяться к другим эмбриональным системам, включая данио-рерио 9,10, или применяться в секвенировании для профилирования зарождающегосятранскриптома 11, поддерживая его общее и широкое применение в различных типах образцов и анализов. В целом этот метод открывает новый важный способ изучения механизмов регулирования генома в отдельных клетках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Описанные здесь работы с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Южной Каролины.

1. Подготовка перед началом протокола

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом протокола подготовьте следующие растворы с использованием воды без РНаз.

  1. Приготовьте 1× трисбуферный физиологический раствор (TBS), pH 7,6: 50 мМ Tris-HCl и 150 мМ NaCl. Отрегулируйте pH до 7.6. Храните при комнатной температуре. Используйте буфер в течение двух месяцев.
  2. Приготовьте 1× трисбуферный физиологический раствор с Tween 20 (TBST), pH 7,6: добавьте Triton X-100 в конечной концентрации 0,1% (объем/объем) до 1× ст. л. (pH 7,6), приготовленную в воде без РНаз. Храните при комнатной температуре. Используйте буфер в течение месяца.
  3. Приготовьте 4% параформальдегид (PFA)/1× MEM: смешайте 1 флакон (10 мл) 16% PFA и 4 мл 10× MEM (1000 mM, 3- (N-морфолино)пропансульфоновая кислота [MOPS] pH 7,4, 20 mM EGTA и 10 mMMgSO 4). Добавьте воду без РНазы до 40 мл. Аликвот и храните при -20 °C. Используйте раствор в течение 6 месяцев.
  4. Приготовьте 70%, 50% и 25% метанола в 0,5× SSC: смешайте метанол и 0,5× SSC в 3:1, 1:1 и 1:3 соответственно. Используйте раствор в течение шести месяцев.
  5. Приготовьте отбеливающий раствор: Смешайте до конечной концентрации 2% (об/вол) H2O2, 5% формамида и 0,5× SSC в воде без РНаз. Приготовьте этот раствор непосредственно перед использованием.
  6. Приготовьте раствор для блокировки: добавьте финальную концентрацию 10% (об/вол) козьей сыворотки и 0,2% (масса/об) BSA в 1× TBST. Храните при -20 °C. Используйте раствор в течение 6 месяцев.
  7. Приготовьте клиринговый реагент BABB: смешайте 1 часть бензил-спирта (BA) и 2 части бензилбензоата (BB). Храните при комнатной температуре. Используйте раствор в течение 6 месяцев.

2. Фиксация эмбрионов, введённых в 5-ЕС микроинъекции

  1. Для микроинъекции 5-этинилуридина (5-EU) в 1-клеточные эмбрионы следует процедурам, описаннымранее 11. Позвольте эмбрионам развиваться до желаемых стадий ZGA, например, стадии 9, когда ZGA активно присутствует в большинстве клеток эмбриона.
  2. Для фиксации эмбрионов, введённых в 5-EU, сначала добавьте около 1,8 мл 4% PFA/1× MEM в сцинтилляционный стеклянный флакон объемом 2 мл. Затем с помощью пластиковой трансферной пипетки переместите ~20 эмбрионов в стеклянный флакон. Минимизируйте количество культурного материала, добавляемого в стеклянный флакон.
  3. Наполните стеклянный флакон до верха дополнительным 4% PFA/1× MEM. Закройте флакон крышкой; Не должны оставаться пузырьки воздуха.
  4. Поставьте стеклянный флакон на вращатель и вращайте эмбрион на низкой скорости (например, 10 об/мин) не менее 2 часа при комнатной температуре.
  5. Используйте пипетку, чтобы аккуратно удалить фиксатор. Наполните стеклянный флакон 100% метанолом. Поставьте стеклянный флакон на вращатель и вращайте эмбрионы на низкой скорости в течение 5 минут.
  6. Аккуратно удалите метанол и добавьте новый. Повторите ротацию и обезвоживание как минимум дважды, чтобы эмбрионы полностью обезвожились.
  7. Храните эмбрионы в метаноле при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Позвольте эмбрионам оставаться в метаноле не менее 2 дней, прежде чем приступить к следующим шагам. Эмбрионы можно использовать в течение 2 месяцев.

3. Конъюгирование зарождающихся РНК с флуорофором посредством щелчковой реакции

  1. Для восстановления воды эмбрионов сначала удалите метанол из стеклянного флакона, затем добавьте 2 мл 75% метанола в 0,5× SSC и закройте флакон крышкой. Поставьте стеклянный флакон на вращатель и вращайте эмбрионы на низкой скорости в течение 5 минут.
  2. После вращения удалите жидкость из стеклянного флакона. Повторите вышеуказанный шаг последовательно: 50% метанола в 0,5× SSC, 25% метанола в 0,5× SSC и 0,5× SSC. Чтобы полностью увлажнить эмбрионы, повторите финальную промывку с 0,5× SSC не менее двух раз.
  3. Добавьте 2 мл свежеприготовленного отбеливающего раствора (2% H2O2 и 5% формамида в 0,5× SSC) в стеклянный флакон. Поставьте стеклянный флакон на кусок алюминиевой фольги, а затем поставьте под светодиодный свет на таком расстоянии, чтобы образцы не перегрелись.
  4. Отбелите эмбрионы под светом, пока все пигменты не станут белыми, что обычно занимает 5–6 часов. Обратите внимание, что из-за расщепленияH2O2 на O2 образуются мелкие воздушные пузырьки, которые могут заставлять эмбрионы плавать в воздухе. Периодически проверяйте эмбрионы (например, каждые 30 минут) и аккуратно поворачивайте стеклянный флакон, чтобы эмбрионы оселились в растворе отбеливателя.
  5. Аккуратно уберите буфер для отбеливателя. Добавьте 2 мл 0,5× SSC, чтобы быстро промыть эмбрионы. При необходимости повторите быстрое промывка.
  6. Добавьте 2 мл 1× TBST в стеклянный флакон. Поставьте стеклянный флакон на вращатель и вращайте эмбрионы на низкой скорости в течение 1 часа. После вращения удалите жидкость из стеклянного флакона.
  7. Повторите этот шаг не менее 5 раз. Обратите внимание, что тщательная промывка эмбрионов крайне важна для следующих этапов.
  8. Добавьте 2 мл по 1× ст. л. в стеклянную ампулу. Поставьте стеклянный флакон на вращатель и вращайте эмбрионы на низкой скорости в течение 5 минут. После вращения удалите жидкость из стеклянного флакона.
  9. Повторите этот шаг ещё раз.
  10. Подготовьте смесь для щелкающей реакции в микроцентрифугной трубке объемом 1,5 мл, добавив следующие реагенты для достижения конечной концентрации 100 мМ Tris-HCl (pH 8,5), 1 мМCuSO 4, 25 мкм тетраметилродамина (TAMRA)-азида и 100 мМ аскорбиновой кислоты. Добавьте аскорбиновую кислоту последним в реакцию. Пипетки вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать.
  11. Добавьте реакционную смесь 200 мкл в эмбрионы в стеклянном флаконе. Убедитесь, что объём смеси реакции достаточен для погружения всех эмбрионов в флакон. Инкубировать 12 часов при комнатной температуре в темноте.
  12. Аккуратно уберите смесь для реакции щелчков. Обратите внимание, что на эмбрионах наблюдается неспецифическая флуоресценция. Быстро промывайте эмбрионы дважды с помощью 1× TBST, затем промывайте их с 1× TBST минимум 5 раз, меняя раствор каждые 1 час, как описано выше.
  13. Продолжайте промывать эмбрионы, меняя 1× TBST каждые 2 часа и оставляйте их на ночь при 4 °C на ротаторе. Прекратите стирку, когда неспецифическая флуоресценция почти не видна. Обратите внимание, что поскольку остатки от щелчковой реакции могут быть вредны для иммунного окрашивания, убедитесь, что эмбрионы тщательно вымыты в течение 1–2 дней перед переходом к следующим шагам.

4. Иммунная окрашивание эмбрионов с субклетовыми маркерами (опционально)

  1. Для блокировки эмбрионов удалите 1× TBST из стеклянного флакона на последнем этапе промывания выше и добавьте 200 мкл блокирующего раствора (10% козья сыворотка/0,2% BSA/1× TBST). Оберните стеклянный флакон кусочком алюминиевой фольги, чтобы защитить эмбрионы от света. Поставьте стеклянный флакон на нутатор и аккуратно встряхните эмбрионы не менее 1 часа при комнатной температуре (или на ночь при 4 °C).
  2. Разбавить первичное антитело (например, анти-H3) в соотношении 1:1 000 в 200 мкл 10% козьей сыворотки/1× TBST. Добавьте разбавленные антитела в стеклянный флакон и завернуте его в алюминиевую фольгу. Инкубировать эмбрионы ночью при 4 °C на нутаторе на низкой скорости.
  3. Аккуратно удалите антитела из стеклянного флакона. Быстро промывайте эмбрионы дважды, добавив 2 мл 1× TBST в стеклянный флакон и вынув его.
  4. Добавьте 2 мл 1× TBST в стеклянный флакон, затем оберните его алюминиевой фольгой. Поставьте стеклянный флакон на вращатель и вращайте эмбрионы на низкой скорости в течение 1 часа. После вращения удалите жидкость из стеклянного флакона.
  5. Повторите этот шаг не менее 5 раз.
  6. Разбавить вторичное антитело (например, антитело к кролику Alex Fluor 488) в соотношении 1:1 000 в 200 мкл 10% козьей сыворотки/1× TBST. Если требуется окрашивание ДНК, разведите краситель ДНК (например, TO-PRO-3) вместе с вторичным антителом.
  7. Добавьте разбавленные антитела в стеклянный флакон и оберните его алюминиевой фольгой. Инкубировать эмбрионы ночью при 4 °C на нутаторе на низкой скорости.
  8. Аккуратно удалите антитела из стеклянного флакона. Быстро промывайте эмбрионы дважды, добавив 2 мл 1× TBST в стеклянный флакон и вынув его.
  9. Добавьте 2 мл 1× TBST в стеклянный флакон, затем оберните его алюминиевой фольгой. Поставьте стеклянный флакон на вращатель и вращайте эмбрионы на низкой скорости в течение 1 часа.
  10. Повторите этот шаг не менее 5 раз.

5. Очищение эмбрионов до конфокальной визуализации

  1. Для обезвоживания эмбрионов аккуратно удалите буфер из стеклянного флакона после окончательной промывки и добавьте 2 мл 100% метанола. Оберните стеклянный флакон в алюминиевую фольгу, положите его на вращатель и дайте эмбрионам вращаться на низкой скорости в течение 5 минут. После вращения удалите жидкость из стеклянного флакона.
  2. Повторите этот шаг не менее 5 раз.
  3. Для полного обезвоживания эмбрионов повторите вышеуказанный шаг не менее 5 раз, используя 2 мл 100% безводного метанола.
  4. Аккуратно удалите как можно больше метанола из стеклянного флакона.
  5. Используйте стеклянную пипетку, чтобы медленно добавить 500 мкл очищающего реагента BABB в стеклянный флакон. Эмбрионы будут плавать в BABB и ждать 10 минут, пока все эмбрионы не оседнут на дно стеклянного флакона. Обратите внимание, что эмбрионы станут почти невидимыми, и аккуратно удаляйте BABB, не повредив эмбрионы.
  6. Повторите вышеуказанный шаг как минимум ещё 2 раза, или пока не останутся шлирен-линии. Чтобы полностью очистить эмбрионы, храните их в BABB 1–2 дня перед визуализацией.
  7. Создайте камеры для визуализации, отрезав небольшой квадрат (например, ~5 мм × 5 мм) от ленты VHB толщиной ~ 1,1–1,2 мм (аналогично размеру эмбриона) и размером ~10 мм × 10 мм, затем приклеив его к крышному стеклу диаметром 24 мм × 40 мм.
  8. Аккуратно перенесите очищенные эмбрионы в камеру, затем накройте их другим стеклом. Эмбрионы будут находиться внутри бутерброда из стеклов, чтобы можно было сфотографировать обе стороны.
  9. Проводите визуализацию под конфокальным микроскопом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эмбрионы Xenopus laevis на стадии 1 клетки микроинъекционировали 5-EU, а эмбрионы на 9-й стадии фиксировались, когда крупномасштабная ZGA происходила по всему эмбриону. Эмбрионы были обработаны согласно описанному выше протоколу. Зарождающиеся РНК в эмбрионах были маркированы TAMRA-азидом с помощью щелк-реакции, гистон H3 — с помощью антигистонного антитела H3, а ДНК — TO-PRO-3. Эмбрионы снимались под конфокальным микроскопом с помощью объектива 10×. Как показано

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

ZGA представляет собой один из самых критических переходов на самых ранних этапах развитияэмбриона 2,3. Здесь мы описали подробные процедуры подготовки образцов для непосредственной визуализации ZGA в целостных ранних эмбрионах Xenopus, включая фиксацию эмбрионов, введённых 5-EU, конъюгирование зарождающихся РНК с флуорофором посредством щелчковой реакции, иммунокрашивание субклеточных маркеров после щелчковой реакции и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор заявляет, что нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим лабораторию Мэттью Гуда в Университете Пенсильвании за обучение. Эта работа частично поддерживалась Национальным институтом здоровья детей и развития человека имени Юнис Кеннеди Шрайвер (R03HD105802).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16% параформальдегид (PFA)EMS15710-СЗа создание фиксирующего раствора
20 с лишним раз; SSCMediatechMT46-020-CMДля изготовления раствора для отбеливания
3D нутационный миксерVWR76595-802Для нутирования эмбрионов
Флаконы с винтовой резьбой 9 мм (2 мл)VWR46610-722Для обработки эмбрионов
Анти-гистоновое антитело H3AbcamAB1791Для иммунного окрашивания
Аскорбиновая кислотаСигма-ОлдричA7506За создание кликовой реакции
Бензиловый спиртСигма-Олдрич305197Для очистки эмбрионов
БензилбензоатACROS Organics105860010Для очистки эмбрионов
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Сигма-ОлдричA3059За создание решения для блокировки
Крышки для флаконов с винтовой резьбой 9 мм (2 мл)VWR46610-712Для обработки эмбрионов
Крышное стекло (24 мм и раз; 40 мм)VWR48393-060Для создания камеры визуализации
CuSO4Сигма-Олдрич61230За создание кликовой реакции
Этиленебис (оксиэтиленитрило)тетрауксусная кислота (EGTA)Термо Фишер СайентификAC409915000За создание фиксирующего раствора
Fiji ImageJNIHДля обработки визуализации
ФормамидТермо Фишер СайентификAC181090010Для изготовления раствора для отбеливания
Стеклянные пипетки PasteurVWR14673-010Для передачи BABB
Вторичный антител против коз Alex Fluor 488Термо Фишер СайентификA27034Для иммунного окрашивания
Козья сывороткаAbcamab7481За создание решения для блокировки
Перекись водородаСигма-ОлдричH1009Для изготовления раствора для отбеливания
Сульфат магния (MgSO4)Термо Фишер СайентификM65-500За создание фиксирующего раствора
МетанолТермо Фишер СайентификA4524Для обезвоживания эмбрионов
Метанол, безводныйСигма-Олдрич322415Для обезвоживания эмбрионов
MOPSТермо Фишер СайентификAC172631000За создание фиксирующего раствора
Многомодовый нутатинговый миксерVWR76595-812Для нутирования эмбрионов
Пластиковая трансферная пипеткаТермо Фишер Сайентифик13-711-9AMДля переноса эмбрионов
Лезвие бритвыТермо Фишер Сайентифик18-100-970Для резки лент
Вода без РНазыТермо Фишер СайентификBP561-1Для создания растворов без рназы
Roto-Mini PLUS (ротатор)VWR470313-912Для ротирующих эмбрионов
Тетраметилродамин (TAMRA)-азидAbcamab146486За создание кликовой реакции
TO-PRO-3Термо Фишер СайентификT3605Для окрашивания ДНК
Triton X-100Сигма-Олдрич10789704001Для изготовления буфера для стирки
База Тризма (база Трис)Сигма-ОлдричT1503Для создания буфера Tris
VHB 3M GPH-110GF ленты (45 мил.)VWR76524-608Для создания камеры визуализации
Конфокальный микроскоп Zeiss LSM 700ZeissДля конфокальной визуализации

Ссылки

  1. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  2. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), dev161471(2019).
  3. Jukam, D., Shariati, S. A. M., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  4. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
  5. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  6. Chen, H., Good, M. C. Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis. Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).
  7. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in whole-mount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  8. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  9. Chan, S. H., et al. Brd4 and P300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation. Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).
  10. Adar-Levor, S., et al. Cytokinetic abscission is part of the midblastula transition in early zebrafish embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (15), e2021210118(2021).
  11. Chen, H. Quantifying nascent transcription in early embryogenesis. Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).
  12. Harland, R. M. In situ hybridization: An improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Анализ единичных клетокранний эмбриогенезматеринско-зиготический переходмаркирование новосинтезированных транскриптов5-этинилуридинклик-химияконфокальная микроскопияэмбрионы Xenopus laevisрегуляция генома
Визуализация активации зиготного генома в отдельных клетках ранних эмбрионов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.