Методическая статья

Стандартизированный протокол для индуцирования преждевременного старения, вызванного стрессом, в первичных меланоцитах человека с использованием трет-бутилгидропероксида

DOI:

10.3791/70595

⸱

29 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Biomedical Aging Research, Universität Innsbruck, 2Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI), 3European Innovation Center, Proya Europe

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стандартизированный протокол для индуцирования преждевременного старения в ГНМ с использованием tBHP, стандартизированных протоколов анализа ключевых маркеров старения, включая остановку роста, активность SA-β-галактозидазы и факторы SASP.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стрессоры окружающей среды, включая ультрафиолетовое излучение, загрязнение воздуха или сигаретный дым, способствуют внешнему старению кожи. Воздействие этих внешних факторов старения способствует накоплению стареющих клеток, что способствует формированию морщин и нарушений пигментации. Меланоциты, обеспечивающие первичную защиту от ультрафиолета, с возрастом проявляют сниженную активность. Стареющие меланоциты накапливаются в старой коже и способствуют её стареющему облику; Однако существует мало моделей для изучения старения меланоцитов, и эта работа направлена на разработку воспроизводимой модели для дальнейших исследований. В этом исследовании мы представляем модель старения меланоцитов человека (HNM) с использованием трет-бутилгидропероксида (tBHP), хорошо охарактеризованного индуктора окислительного стресса. tBHP нарушает окислительно-окислительный гомеостаз, истощая клеточную антиоксидантную защиту и способствуя избыточному производству радикалов, что приводит к повреждению ДНК и белков. Мы характеризуем фенотип старения меланоцитов, обработанных тБХП, с помощью анализа установленных маркеров старения, включая ограниченный потенциал роста, морфологические изменения и активность SA-β-галактозидазы. Эта модель предоставляет ценный инструмент для изучения преждевременного старения, вызванного стрессом, у меланоцитов, давая представление об их роли в нарушениях старения и пигментации внешней кожи.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Старение кожи состоит из двух различных факторов: внутреннего и внешнегостарения 1,2. Внутреннее старение вызвано естественными хронологическими процессами и генетическими факторами, тогда как внешнее старение происходит из-за кумулятивного воздействия стрессовых факторов окружающей среды, преимущественно ультрафиолетового излучения, а также загрязнения воздуха, сигаретного дыма и химических веществ, которые ускоряют процесс старения сверх нормальнойхронологической скорости 3,4. Воздействие окружающей среды вызывает окислительный стресс, который подавляет клеточную антиантиоксидантную защиту, что приводит к повреждению ДНК, окислению белков и пероксидации липид. Эти молекулярные изменения запускают стойкие реакции на повреждение ДНК и клеточную дисфункцию, что в конечном итоге способствует преждевременномустарению 5,6. Это старение, вызванное стрессом, способствует клиническим признакам стареющей кожи, включая морщины, неравномерную пигментацию, снижение эластичности и нарушение барьернойфункции 7.

Меланоциты находятся в базальной эпидермисе и служат основной защитой кожи от повреждений, вызванных ультрафиолетом, синтезируя меланин и перенося его в окружающие кератиноциты. Парадоксально, но эта защитная роль делает их особенно уязвимыми к окислительному стрессу и преждевременному старению во время внешнего старения 8,9. Сам процесс меланогенеза образует значительные реактивные виды кислорода в качестве побочных продуктов реакций, катализированных тирозиназой, создавая внутреннюю окислительную нагрузку, которая дополнительно усиливается воздействием окружающей среды, таким как ультрафиолетовое излучение изагрязнение 10,11. В результате хронический стресс окружающей среды может вызывать окислительное повреждение, дисфункцию митохондрий и, в конечном итоге, клеточноестарение 12. Несмотря на их важность, остаются ключевые вопросы о молекулярных путях, управляющих старением меланоцитов, и о том, как окислительный стресс инициирует этот процесс. Кроме того, влияние стареющих меланоцитов на окружающую кожную микросреду как фактора возрастных изменений кожи, особенно за счёт высвобождения факторов SASP, остаётся недостаточноизученным 13,14.

Хотя меланоциты особенно подвержены старению, вызванному окислительным стрессом, экспериментальные модели для изучения этого процесса остаютсяограниченными 15,16. Большинство исследований старения по-прежнему опираются на репликативные или стресс-индуцированные модели старения у фибробластов, но эти подходы не отражают отдельную биологию меланоцитов или их потенциал влиять на старение кожи через перекрёстные взаимодействия с соседними клетками и их собственным профилемSASP 17. Этот разрыв подчёркивает необходимость моделей старения, специфичных для меланоцитов, которые более точно отражают их физиологические реакции на стрессоры окружающейсреды (18,19) и их вклад в старение кожи человека.

Несмотря на наличие подходов к старению, вызванной стрессом, их внедрение в первичных меланоцитах человека остаётся технически сложным и часто связано с значительной вариабельностью. Меланоциты особенно чувствительны к окислительному стрессу, что приводит к узкому экспериментальному окну между эффективной индукцией старения и чрезмерной цитотоксичностью. Кроме того, зависимые от донора различия в препаратах первичных клеток дополнительно способствуют несогласованности результатов между исследованиями. Эти проблемы часто недооцениваются, а протоколы часто недостаточно стандартизированы, что ограничивает воспроизводимость. Настоящий протокол устраняет этот пробел, предоставляя оптимизированный и воспроизводимый режим лечения, определённый график дозировки и стандартизированные показания для надёжной индукции и оценки старения в первичных меланоцитах человека.

Третбутилгидропероксид (tBHP) — хорошо охарактеризованный индуктор окислительного стресса, способствующий старению путём образования реактивных кислородных форм и истощения клеточных антиоксидантных защитных средств. Он широко применяется для индуцирования старения в дермальных фибробластах, где активирует маркеры старения характерных знаков при сохранении жизнеспособностиклетки 20,21. Поскольку tBHP создаёт устойчивое окислительное напряжение через определённые биохимические пути, он предлагает воспроизводимую и доступную систему для изучения старения, вызванного окислительным стрессом, и изучения молекулярных механизмов, связывающих окислительное повреждение с процессамистарения 22,23. В отличие от моделей на базе ультрафиолета, tBHP особенно полезен, когда требуется контролируемое, воспроизводимое индукирование окислительного напряжения, независимо от параметров облучения и без необходимости специализированного оборудования.

HNM предоставляет соответствующую модель для изучения внешних механизмовстарения 24. Будучи первичными клетками, происходящими из крайней плоти, они сохраняют нетронутые пути стресс-реакции и избегают артефактов, связанных с генетической модификацией или увековечением25. Неонатальные меланоциты предоставляют оптимальную экспериментальную модель, поскольку они демонстрируют минимальные исходные повреждения, что позволяет чётко оценить пути старения, вызванные стрессорамиокружающей среды 26,27.

В этом исследовании используется окислительный стресс, вызванный tBHP, в первичных неонатальных меланоцитах человека, преодолевая ограничения немеланоцитарных и бессмертных клеточных моделей, которые часто используются в исследованиях старения. Он предоставляет стандартизированную платформу для изучения механизмов старения, специфичных для меланоцитов, и характеристики стареющего фенотипа с помощью установленных маркеров. В целом, этот протокол предоставляет воспроизводимую физиологически значимую модель для изучения старения, вызванного окислительным стрессом, в меланоцитах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был оптимизирован для исследований первичных меланоцитов человека (ГНМ) с целью изучения механизмов стресс-индуцированного преждевременного старения, вызванного tBHP (рисунок 1). Меланоциты были получены из неонатальной кавказской крайней плоти (фототип светлой пигментации) и получены из коммерческого источника. Согласно документации поставщика, человеческие ткани собираются у доноров, которые полностью информированы и дали согласие, в соответствии с установленными этическими и правовыми нормами, включая Хельсинкскую декларацию и применимые нормативы по защите данных. Ячейки предоставлялись в деидентификационной форме. Для их использования в этом исследовании не требовалось дополнительное этическое одобрение. Все эксперименты проводились с использованием одной и той же линии меланоцитов для обеспечения стабильности. Обратите внимание, что при использовании различных первичных клеточных линий условия культуры, а также концентрации и процедуры обработки могут потребовать дополнительной корректировки.

1. Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Для начала лечения tBHP меланоциты должны быть разморажены не менее чем за три дня до заранее, чтобы обеспечить достаточное восстановление и слияние. Фаза обработки длится 4 дня, при этом день посева обозначается как День 0. Подробности обо всех материалах, использованных в этом исследовании, приведены в Таблице материалов.

  1. Для подготовки культурной среды объединяют базальную среду меланоцита с соответствующими факторами роста. Зажжите крышку каждого флакона перед добавлением содержимого в среду, чтобы минимизировать загрязнение. Добавьте 1% (v/v) PenStrep в подготовленную среду и храните при 4 °C до использования.
  2. Перед посевом приготовьте раствор ингибитора трипсина, разбавляя ингибитор трипсина сои в DPBS. Фильтруйте раствор через мембрану диаметром 0,22 мкм, аликвот, и храните при −20 °C. После размораивания его можно использовать до 10 дней.

2. Оттаивание клеток (день -3)

ВНИМАНИЕ: Все материалы, контактирующие с человеческими клетками, должны считаться биологически загрязнёнными и утилизироваться в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности. Для оценки старения мы используем дополнительные анализы, оценивающие остановку роста, активность SA-β-gal и дополнительные молекулярные маркеры. Здесь мы представляем протоколы для этих тестов и ожидаемые результаты при работе с этими индикаторами старения.

  1. Пипетта 20 мл соленого раствора Phosphate Buffer от Dulbecco (сорт клеточной культуры) в коническую трубку объемом 50 мл при комнатной температуре. Сохраняйте флакон с клетками на льду до размораивания.
  2. Перед открытием флакона с ячейками поджигайте крышку, открутите и снова поджёгите бока, чтобы предотвратить возможное загрязнение.
  3. Перенесите 500 мкл DPBS в флакон с клетками. Аккуратно размораживайте клетки, пипетируя вверх и вниз, затем перенесите всё содержимое в трубку.
  4. Центрифугу при 100 × г в течение 5 минут при комнатной температуре. Полученная гранула должна быть бежевой или коричневой (или темнее, в зависимости от этнической принадлежности донора).
  5. Приготовьте термос T75 с 14 мл меланоцитарной среды.
  6. Зажгите стеклянную пипетку Пастера (пламя каждый раз при работе с меланоцитами), аккуратно аспирируйте DPBS и снова подвесьте гранулу в 1 мл среды.
  7. Переложите в заранее подготовленную колбу.
  8. Инкубировать при 37 °C при 5% CO₂ и ежедневно наблюдать под микроскопом. Меняйте среду минимум каждые 48 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый криоконсервированный флакон содержит примерно 1 × 106 первичных меланоцитов человека. Все эксперименты проводились с использованием клеток в проходе 9.

3. Посев клеток (День 0)

  1. Обеспечить слияние 80–90% клеток в день посева.
  2. Аспирируйте среду из колбы и дважды промывайте DPBS.
  3. Отсоединять клетки путем добавления 2 мл раствора трипсина-ЭДТА и инкубации в течение 5 минут при 37 °C, 5% CO₂.
  4. Аккуратно постучите по колбе и наблюдайте под микроскопом, чтобы подтвердить полное отслоение клеток (при необходимости инкубировать дольше).
  5. Остановите реакцию, добавив в 1,5 раза больше объёма ингибитора трипсина.
  6. Перенесите суспензию ячейки в коническую трубку объёмом 15 мл и разбавьте с помощью DPBS до конечного объёма 10 мл.
  7. Центрифугуйте суспензию ячейки при 100 × г в течение 5 минут.
  8. Аспирируйте супернатант и подвесьте до нужного объёма в среде.
  9. Для тарелок, обработанных tBHP, семя 6 × 105 клеток на тарелку диаметром 10 см. Для контрольных пластин семя 4 × 105 ячеек на каждую пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для пластин, обработанных tBHP, засевайте более плотную клетку, чтобы обеспечить достаточное количество клеток для экспериментов, так как их скорость роста будет постепенно снижаться во время обработки. Если вы засеиваете клетки на покрытия для микроскопических экспериментов, накладные слики должны быть покрыты 0,1 мг/мл поли-D-лизином и полностью высушены перед посевом клеток.
  10. Инкубировать на ночь при 37 °C с 5% CO₂. Меняйте среду каждые 48 часов для контрольных пластин.

4. Лечение tBHP (день 1–4)

  1. Приготовьте рабочий раствор объемом 10 мМ из tBHP (разбавленного в DPBS или среде).
    ПРИМЕЧАНИЕ: tBHP чувствительна к свету: накрывайте контейнер при работе с ним. Рабочий раствор можно использовать до одной недели при правильном хранении при 4 °C. График обработки: Первый день (день после посева) знаменует начало воздействия tBHP. Меланоциты лечат дважды в день с интервалом не менее 4 часов между применениями. Этот режим повторяется с первого по четвертый день, всего лечение длится 4 дня. Выбранные концентрации tBHP и график обработки были адаптированы из предыдущих работ по дермальных фибробластам, где более низкие концентрации были достаточны для индуцирования старения. Однако в первичных меланоцитах для достижения устойчивой индукции старения требовались более высокие концентрации, и 100 мкм tBHP было определено как оптимальное на основе титровых экспериментов, балансирующих индукцию старения и жизнеспособность клеток
  2. Добавьте 100 мкм тЛС в клетки на 1 час за обработку (для запуска добавьте соответствующий объем рабочего раствора, гарантируя пипетку в жидкую среду).
  3. Двигайте пластину взад-вперёд и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить tBHP по среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте круговых движений, так как это может привести к неравномерному распределению tBHP по среде.
  4. Инкубировать ровно 1 час при 37 °C при 5% CO₂.
  5. Чтобы прекратить лечение tBHP, аспирируйте среду.
  6. Промывайте пластины дважды с предварительно нагретым DPBS (37 °C).
  7. Добавьте в тарелки соответствующее количество свежего материала.
  8. Дайте клеткам восстановиться в инкубаторе не менее 4 часов перед началом последующего лечения.
  9. Повторите эту процедуру в тот же день во второй процедуре и продолжайте в оставшиеся дни. Сохраняйте клетки в культуре после завершения обработки до 9-го дня, чтобы оценить маркеры старения.
  10. Контролировать управляющие пластины и проходы, если они совпадают.

5. Анализ кривой роста

  1. Подсчитайте клетки, обработанные tBHP, и контроли по протоколу посева.
  2. Пересеяйте ту же начальную плотность или все ячейки на случай, если вы считаете меньше, чем 6 × 105 ячеек для пластин с tBHP.
  3. Проводите подсчёт клеток на 4, 9 и 15 днях посева.
  4. Вычислите кривую роста по следующей формуле:
    lg (count) - log (seed) / 0.301 + c PDL
    Количество: количество ячеек, полученных в конце прохода.
    Семя: количество ячеек, изначально покрытых в начале прохода.
    cPDL: уровень кумулятивного удвоения населения, перенесённый из предыдущих отрывков.

6. Активность SA-β-галактозидазы

  1. На 9-й день промывайте клетки дважды в PBS, прежде чем фиксировать 2% формальдегида и 0,4% глутаральдегида.
  2. Промывайте клетки дважды с помощью PBS.
  3. Инкубировать фиксированные клетки раствором для окрашивания с pH 6,0 (150 мМ NaCl, 2 мМ МгКл, 5 мМ феррицанида калия, 5 мМ ферроцианида калия, 40 мМ лимонной кислоты, 12 мМ фосфата натрия и 1 мг/мл 5-бром-4-хлоро-3-индолил-β-D-галактозид (X-гал).
  4. После 18 часов инкубации при 37 °C при отсутствии CO₂ промывайте клетки дважды PBS.
  5. Изображение с помощью световой микроскопии.
  6. Количественно определите количество клеток, окрашенных в синий цвет под микроскопом, посчитав их и деля их на общее количество клеток в поле (SIM). Выражайте результаты в процентах положительных клеток.

7. Иммунофлуоресцентное окрашивание

ВНИМАНИЕ: Отходы, содержащие формальдегиды, глутаральдегид и параформальдегид, должны использоваться как опасные химические отходы и утилизироваться в соответствии с институциональными нормами безопасности.

  1. Используйте клетки, культивируемые на покрытиях, предварительно покрытых 0,1 мг/мл поли-D-лизина.
  2. На 9-й день промывайте клетки дважды, затем фиксируйте 4% параформальдегида на 15 минут.
  3. Промывайте клетки дважды с помощью PBS.
  4. Пермеабилизация с использованием 0,3% тритон-X и 0,1% натрия цитра в PBS.
  5. Блокируйте 1% BSA в PBS-T в течение 30 минут при комнатной температуре.
  6. Инкубировать клетки первичным антителом γH2AX для обнаружения постоянного ответа на повреждение ДНК за ночь при 4 °C в увлажнённой камере.
  7. На следующий день постирайте дважды с PBS.
  8. Примените вторичное антитело на 1 час при комнатной температуре.
  9. Если нужно, окрашивайте ядра DAPI.
  10. Дважды промывать с PBS-T, затем два раза с PBS и дважды сddH 20.
  11. Установите накладки и дайте им полностью высохнуть перед фотографированием.
  12. Анализируйте среднюю интенсивность флуоресценции и/или фокусы γH2AX с помощью программного обеспечения ImageJ.

8. Изоляция РНК и RT-qPCR

ВНИМАНИЕ: β-меркаптоэтанол очень токсичен и должен использоваться в выхлопной жидкости. Отходы, содержащие β-меркаптоэтанол, следует утилизировать как опасные химические отходы.

  1. На 9-й день трипсинизуйте клетки с помощью 2 мл трипсина-ЭДТА.
  2. Остановите реакцию, нанеся в 1,5 раза больше ингибитора трипсина.
  3. Перенесите подвеску ячейки в коническую трубку объёмом 15 мл и центрифугу при 100 x g на 5 минут.
  4. Аккуратно аспирируйте супернатант.
  5. Гранулы лизных клеток путем ресуспензии в буфере RLT объемом 350 мкл, содержащем 1% β-меркаптоэтанола.
  6. Изолировать РНК с помощью набора для очистки РНК на основе колонок.
  7. Определите концентрацию РНК с помощью спектрофотометра (260 нм).
  8. Для синтеза кДНК используйте 1 мкг РНК для обратной транскрипции при общем объёме реакции 10 мкл с использованием стандартной смеси обратной транскрипции (включая RT-буфер, dNTP, случайные праймеры, обратную транскриптазу и ингибитор РНаз), после чего следуют условия термического цикла согласно инструкциям производителя.
  9. Выполнить RT-qPCR для факторов SASP
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранные факторы SASP (IL-8, IL-6 и MMP-1) представляют собой хорошо известные компоненты секреторного фенотипа, связанного с старением, и были выбраны на основе их значимости для биологии кожи, включая воспалительные сигналы и ремоделирование внеклеточного матрикса
    IL-6 (Передний привод: 5' AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA 3' Rev: 5' TGTCCTGCAGCCACTGGTTC 3')
    IL-8 (Передний привод: 5' ACCGGAAGGAACCATCTCAC 3' Rev: 5' AAACTGCACCTTCACACAGAG 3')
    MMP-1 (Передний привод: 5' CATCGTTGGCAGCTCATGA 3' оборот: 5' ATGGGCTGGACAGATTTTG 3')
    GAPDH (Вперед: 5' GAGTCAACGGATTTGGTTGT 3' Оборот: 5' GATCTCGCTCCTGGAAGATG 3')
  10. Анализировать относительную экспрессию мРНК с помощью метода ΔΔCt с нормализацией к гену GAPDH.

9. Изоляция белков и западный блот

  1. На 9-й день собирайте белковые лизаты.
  2. Аспирируйте среду и промывайте пластины дважды с холодным DPBS.
  3. Лизируйте клетки механически с помощью скребка после добавления буфера RIPA 150 мкл (50 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS и 2 мМ ЭДТА), дополненных ингибиторами протеаз, и переносят в трубку объемом 1,5 мл.
  4. Проведите три цикла заморозки и оттаивания, затем 30-минутную инкубацию на льду.
  5. Центрифугу при 9600 x g при 4 °C в течение 10 минут.
  6. Определите концентрацию белка супернатанта с помощью анализа BCA.
  7. Разделить равные количества (20 мкг) белка на полиакриламидные гели и перенести в активированные мембраны PVDF.
  8. Блокировка мембран в 5% обезжиренном молоке в TBS-T.
  9. Инкубировать с первичными антителами pRB и LaminB1 ночью при 4 °C.
  10. На следующий день промой оболочки 3 раза в TBS-T.
  11. Инкубировать соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с HRP, в течение 1 часа при комнатной температуре.
  12. Обнаружить белки с помощью хемилюминесценции и провести денситометрический анализ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лечение tBHP вызывает остановку роста у неонатальных меланоцитов человека.
Лечение tBHP подавляет пролиферацию меланоцитов по сравнению с нелечёнными контролями (n = 3) (рисунок 2A). К 9-му дню обработанные клетки достигают всего 1,4 cPDL, тогда как контрольные группы достигают 3,1 cPDL. Это дивергенция увеличивается со временем: обработанные меланоциты приближаются к плато 1,9 cPDL к 15-му дню, в то время как контрольные группы продолжаю...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол устанавливает стандартизированный подход к индуцированию стресс-индуцированного преждевременного старения (SIPS) у неонатальных меланоцитов человека с использованием tBHP, предлагая надёжную модель для изучения старения именно в этом типе клеток. Постоянные изменения в пролиферации, морфологии, активности SA-β-гал, маркерах повреждения ДНК и компонентах SASP поддерживают индуцированный фенотип. Сосредотачиваясь на меланоцитах — клетках, которые остаются недостаточно изученн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конкурирующих финансовых интересах. Lieve Declercq аффилирована с Proya Europe; однако компания не повлияла на дизайн исследования, сбор данных, анализ, интерпретацию или решение о публикации. Авторы также утверждают, что инструменты искусственного интеллекта (ИИ) использовались исключительно для помощи в редактировании языка и уточнении текста. Весь научный контент, экспериментальный дизайн и интерпретация данных были разработаны и проверены авторами.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана финансированием Tiroler Wissenschaftsfonds (ZAP746010, F.33287/10- 2021, F.50279/7-2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0.22 µm membrane filterMerck SLGVR33RS
1 M citric acid Merck K91567844приготовить в аква. dest.
1 M MgCl2MerckA649033приготовить в аква. dest.
1 M Na2HPO4MerckK56036736приготовить в аква. dest.
10 M NaOHLab Honeywell30620приготовить в аква. dest.
37% formaldehydeSigma252549
4% paraformaldehydeCarlRoth0335.3
5 M Sodium Chloride SigmaS3014приготовить в аква. dest.
50% glutaraldehydeSigmaG6403
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)SigmaB9146
Alexa Fluor-conjugated secondary antibody 2 mg/mLInvitrogenA11008
BSA (bovine serum albumin)SigmaA7030
Chemiluminescent substrateSigmaWBKLS0500
Costar CellLifter Corning3008
Coverslips for cell culture/microscopyEprediaCB00200RA120MNZ0
DermaLife Basal MediumCellSystemsLM-0004
DermaLife M Melanocyte Kit CellSystemsLS-1041
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline SigmaD8537
Human neonatal melanocytesCellSystemsFC-0023
LaminB1 antibody (rabbit)AbcamAB16048Разбавление 1:1000 в 5% BSA
Mounting medium containing DAPIAbcamAB104139
Penicillin-Streptomycin solution SigmaP4333
Polyacrylamide gradient gelsBio-Rad456-8095
Poly-D-Lysine, 0.1 mg/mL GibcoA38904-01
Potassium ferricyanideSigmaP8131
Potassium ferrocyanideSigmaP-9387
pRB antibody (rabbit)CellSignalling93085Разбавление 1:1000 в 5% BSA
Protease inhibitor cocktailself preparedN/A500 mM NaF; 2 µg/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM activated Na-Orthovanadate
RIPA buffer self preparedN/Aсодержащий: 50 мМ Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholate; 0.1% SDS; 150 мМ NaCl; 2 мМ EDTA
RLT bufferQiagen1015762Входит в RNeasy Mini Kit 
RNeasy Mini KitQiagen74106
Skim milk powder (for 5% milk in TBS-T)Sigma70166
Sodium citrate (for 0.1% solution)SigmaS4641
Soybean trypsin inhibitor, 0.5 mg/mL Thermofisher17075-029
tert-Butyl hydroperoxide (tBHP)Sigma458139
Triton X-100 (for 0.3% solution)SigmaT9284
Trypsin-EDTA solutionSigmaT3924
β-mercaptoethanolCarlRoth4227.3
γH2AX antibody (rabbit)CellSignalling2577SРазбавление 1:200 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hussein, R. S., Bin Dayel, S., Abahussein, O., et al. Influences on skin and intrinsic aging: biological, environmental, and therapeutic insight. J Cosmet Dermatol. 24, e16688 (2025).
  2. Dorf, N., Maciejczyk, M. Skin senescence-from basic research to clinical practice. Front Med (Lausanne). 11, 1484345 (2024).
  3. Grenier, A., Morissette, M. C., Rochette, P. J., et al. The combination of cigarette smoke and solar rays causes effects similar to skin aging in a bilayer skin model. Sci Rep. 13, 17969 (2023).
  4. Varani, J., Dame, M. K., Rittie, L., et al. Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation. Am J Pathol. 168, 1861-1868 (2006).
  5. Zhang, S., Duan, E. Fighting against skin aging: the way from bench to bedside. Cell Transplant. 27, 729-738 (2018).
  6. Hussen, N. H. a., Abdulla, S. K., Ali, N. M., et al. Role of antioxidants in skin aging and the molecular mechanism of ROS: a comprehensive review. Aspects Mol Med. 5, 100063 (2025).
  7. Addor, F. A. S. Beyond photoaging: additional factors involved in the process of skin aging. Clin Cosmet Investig Dermatol. 11, 437-443 (2018).
  8. Mucha, M., Skrzydlewska, E., Gęgotek, A. Natural protection against oxidative stress in human skin melanocytes. Commun Biol. 8, 1283 (2025).
  9. Hughes, B. K., Bishop, C. L. Current understanding of the role of senescent melanocytes in skin ageing. Biomedicines. 10, 3111 (2022).
  10. Kamiński, K., Kazimierczak, U., Kolenda, T. Oxidative stress in melanogenesis and melanoma development. Contemp Oncol (Pozn). 26, 1-7 (2022).
  11. Jiménez-Cervantes, C., Martínez-Esparza, M., Pérez, C., et al. Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress: transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor. J Cell Sci. 114, 2335-2344 (2001).
  12. Dańczak-Pazdrowska, A., Gornowicz-Porowska, J., Polańska, A., et al. Cellular senescence in skin-related research: targeted signaling pathways and naturally occurring therapeutic agents. Aging Cell. 22, e13845 (2023).
  13. Green, K. J., Pokorny, J., Jarrell, B. Dangerous liaisons: loss of keratinocyte control over melanocytes in melanomagenesis. Bioessays. 46, e2400135 (2024).
  14. Ali, L., Al Niaimi, F. Pathogenesis of melasma explained. Int J Dermatol. 64, 1201-1212 (2025).
  15. Low, E., Alimohammadiha, G., Smith, L. A., et al. How good is the evidence that cellular senescence causes skin ageing. Ageing Res Rev. 71, 101456 (2021).
  16. Chin, T., Lee, X. E., Ng, P. Y., et al. The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies. Front Physiol. 14, 1297637 (2023).
  17. Gerasymchuk, M., Robinson, G. I., Kovalchuk, O., et al. Modeling of the senescence-associated phenotype in human skin fibroblasts. Int J Mol Sci. 23, 7124 (2022).
  18. Zimmermann, T., Pommer, M., Kluge, V., et al. Detection of cellular senescence in human primary melanocytes and malignant melanoma cells in vitro. Cells. 11, 1489 (2022).
  19. Tang, J., Li, Q., Cheng, B., et al. Primary culture of human face skin melanocytes for the study of hyperpigmentation. Cytotechnology. 66, 891-898 (2014).
  20. Kučera, O., Endlicher, R., Roušar, T., et al. The effect of tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative stress on lean and steatotic rat hepatocytes in vitro. Oxid Med Cell Longev. 2014, 752506 (2014).
  21. Wedel, S., Martic, I., Hrapovic, N., et al. tBHP treatment as a model for cellular senescence and pollution-induced skin aging. Mech Ageing Dev. 190, 111318 (2020).
  22. Rabin, D. M., Rabin, R. L., Blenkinsop, T. A., et al. Chronic oxidative stress upregulates drusen-related protein expression in adult human RPE stem cell-derived RPE cells: a novel culture model for dry AMD. Aging (Albany NY). 5, 51-66 (2013).
  23. Shakel, Z., Costa Lima, S. A., Reis, S. Strategies to make human skin models based on cellular senescence for ageing research. Ageing Res Rev. 100, 102430 (2024).
  24. Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142, 620-632 (2015).
  25. Goff, P. S., Castle, J. T., Kohli, J. S., et al. Isolation, culture, and transfection of melanocytes. Curr Protoc. 3, e774 (2023).
  26. Martic, I., Wedel, S., Jansen-Dürr, P., et al. A new model to investigate UVB-induced cellular senescence and pigmentation in melanocytes. Mech Ageing Dev. 190, 111322 (2020).
  27. Victorelli, S., Lagnado, A., Halim, J., et al. Senescent human melanocytes drive skin ageing via paracrine telomere dysfunction. EMBO J. 38, e101982 (2019).
  28. Zhang, H., Davies, K. J. A., Forman, H. J. Oxidative stress response and Nrf2 signaling in aging. Free Radic Biol Med. 88, 314-336 (2015).
  29. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34, 1565-1576 (2020).
  30. Kang, H. Y., Ortonne, J. P. What should be considered in treatment of melasma. Ann Dermatol. 22, 373-378 (2010).
  31. Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., et al. ROS, cell senescence, and novel molecular mechanisms in aging and age-related diseases. Oxid Med Cell Longev. 2016, 3565127 (2016).
  32. Almeida, F. V., Douglass, S. M., Fane, M. E., et al. Bad company: microenvironmentally mediated resistance to targeted therapy in melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 32, 237-247 (2019).
  33. Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochem Photobiol. 84, 539-549 (2008).
  34. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., et al. The hallmarks of aging. Cell. 153, 1194-1217 (2013).
  35. Videira, I. F., Moura, D. F., Magina, S. Mechanisms regulating melanogenesis. An Bras Dermatol. 88, 76-83 (2013).
  36. Ratz-Łyko, A., Arct, J. Resveratrol as an active ingredient for cosmetic and dermatological applications: a review. J Cosmet Laser Ther. 21, 84-90 (2019).
  37. Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J. N., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nat Med. 24, 1246-1256 (2018).
  38. Ogrodnik, M., Evans, S. A., Fielder, E., et al. Whole-body senescent cell clearance alleviates age-related brain inflammation and cognitive impairment in mice. Aging Cell. 20, e13296 (2021).
  39. Hernandez-Segura, A., de Jong, T. V., Melov, S., et al. Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells. Curr Biol. 27, 2652-2660.e4 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SA

Похожие статьи