Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание мышиной модели почечного фиброза с помощью односторонней ишемии-реперфузионной травмы и отложенной контралатеральной нефрэктомии

384 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70598

⸱

22 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Guangzhou Chest Hospital, Institute of Tuberculosis, Guangzhou Medical University, 2Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 3Department of Transplantation, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен протокол для установления мышиной модели почечного фиброза с использованием одностороннего ишемии-реперфузионного повреждения с последующей отложенной контралатеральной нефрэктомией. Эта стратегия позволяет проводить лонгитюдные исследования перехода от AKI к CKD и точную оценку остаточной функции почек в конечном этапе.

Аннотация

Ишемия-реперфузионное повреждение почек (ИРП) способствует развитию острого поражения почек (ОПП) и является основным фактором прогрессирования хронической болезни почек (ХБП). Воспроизводимая животная модель необходима для облегчения оценки механизмов неадаптивного ремонта и фиброза. Здесь приведена стандартная модель почечного фиброза у мышей, установленная односторонним ишемией-реперфузионным повреждением (uIRI), а затем контралатеральной нефрэктомией (CNx). Эта стратегия обеспечивает долгосрочное выживание животных во время прогрессирования заболевания, одновременно позволяя точно оценить остаточную почечную функцию повреждённой почки во время сбора забора. Самцы мышей C57BL/6 подвергались тёплой ишемии в течение 28 минут при 37 °C, а CNx проводился за 24 часа до каждого завершения исследования. Мышей жертвовали для гистологических и иммуногистохимических оценок в следующие периоды времени: 2 дня, 5 дней, 1 неделя, 2 недели, 3 недели и 4 недели после ИРС. На 2-й и 5-й день после операции в почках в основном проявлялся трубчатый некроз, особенно в кортикомодулярном соединении, без признаков интерстициального фиброза. Начиная с недели после операции, эти патологические признаки были заменены инфильтрацией воспалительных клеток и ранней атрофией труб; Также проявился интерстициальный фиброз и достиг пика тяжести уже на второй неделе. В течение третьей и четвёртой недель после операции почки проявили широкую атрофию труб, соответствующую атрофии неиспользования. Примечательно, что интерстициальный фиброз был снижен по сравнению со второй неделей, что указывает на прогрессирование в покойную, гипоцеллюлярную рубцовую фазу. Эта модель эффективно воспроизводит клинические сценарии перехода от ОПП к ХБП и предоставляет надёжную платформу для изучения фиброзных механизмов и скрининга терапевтических вмешательств.

Введение

Ишемия-реперфузионное повреждение почек (ИРТ) является одним из критических факторов, приводящих к острому повреждению почек (ОПП) в клиническихусловиях. 1. Распространённые этиологии включают трансплантацию почек (с участием холодной и тёплой ишемии с последующей реперфузией донорской почки), сердечно-сосудистые или почечные операции, требующие временной сосудистой окклюзии, а также системные состояния гиперфузии, вызванные тяжёлой травмой, крупным кровоизлиянием илисепсисом 2.

Патофизиология ИРИ включает сложный бифазный процесс. Изначально, в ишемической фазе, прерывание подача кислорода и питательных веществ приводит к нарушению метаболизма, истощению АТФ и нарушениям цитоскелета в трубчастых эпителиальных клетках почек (ТЭК)3. Впоследствии восстановление кровотока во время реперфузии, хотя и необходимо для спасения ишемической ткани, вызывает более сложный «вторичный ущерб». 4 Эта фаза повреждения вызвана цепочкой событий, включая окислительный стресс из-за всплеска реактивных кислородных форм (ROS), дисфункцию эндотелия, массовую инфильтрацию воспалительных клеток (таких как нейтрофилы и макрофаги) и активацию системыкомплемента 3. Эти сложные каскады вместе усугубляют апоптоз и некроз ТЭК, образуя первичную патологическую проявленность ОПП.

Стоит отметить, что ИРИ не ограничивается острым, обратимым повреждением. Значительные данные указывают на то, что неполное или неадаптивное восстановление после ИРС почек является основным механизмом, способствующим переходу к долгосрочной хронической патологии. При физиологических условиях почка запускает программу восстановления после ОПП, которая эффективно очищает повреждённые клетки и способствует пролиферации и дифференцировке оставшихся ТЭК для восстановления структуры и функций повреждённых канальцев. Однако после сильного или повторяющегося повреждения ИРС этот процесс восстановления может нарушиться, что в конечном итоге приводит к атрофии труб, почечному интерстициальному фиброзу и ускорению развития и прогрессирования хронической болезни почек (ХБП)5,6.

Поэтому разъяснение механизмов перехода от ОПП к ХБП и разработка терапевтических вмешательств являются неотложными потребностями. Модели грызунов, особенно мышиные, стали необходимыми и незаменимыми инструментами in vivo для изучения пост-ИРИ фиброза благодаря их чётко очерченному генетическому фону и сходству с прогрессированием человеческих заболеваний. Однако в современных методологиях ИРТ (например, продолжительность ишемии, контроль температуры, одностороннее и двустороннее повреждение) наблюдается значительная гетерогенность, что приводит к низкой воспроизводимости и ограниченной сопоставимости междуисследованиями 7.

Для решения этих проблем в настоящем исследовании рассматривается стандартизированный протокол для модифицированной односторонней модели ишемии-реперфузионной травмы (uIRI). Кроме того, этот протокол включает контралатеральную нефрэктомию (CNx), выполняемую за 24 часа до окончания исследования. Эта стратегия преодолевает высокую смертность, связанную с двусторонней ишемией, одновременно позволяя точно оценить остаточную функцию почек и фиброзное прогрессирование повреждённой почки. Эта модель точно повторяет динамический переход от ОПП к ХБП, предоставляя надёжную платформу in vivo. для механистического исследования и терапевтического скрининга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Правилами управления делами, касающимися экспериментальных животных. Экспериментальный протокол был утверждён Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) компании Guangzhou Jennio Biotech Co., Ltd. (Одобрение No JENNIO-IACUC-2025-A053). Все процедуры выполнялись строго в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и институциональными рекомендациями, полностью соблюдая принципы 3R. Хронология исследования, включая точки жертвоприношения и сбор образцов, изложена на рисунке 1.

1. Подготовка животных и инструментов

  1. Для исследования используйте самцов мышей C57BL/6 (8 недель, весом 20–25 г), содержащихся в специализированных помещениях, свободных от патогенов (SPF).
  2. Разделите мышей случайным образом на группу uIRI и фиктивную группу. Для каждой из шести определённых временных точек (2 дня, 5 дней, 1 неделя, 2 недели, 3 недели и 4 недели) выделяйте n = 4 мыши на группу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши содержались в цикле 12 часов света и 12 часов темноты с свободным доступом к еде и воде. Их акклиматизировали к лабораторной среде как минимум на неделю перед экспериментами.
  3. Стерилизуйте все хирургические инструменты с помощью .Автоклавирование при высоком давлении паром перед использованием.
  4. Поддерживайте температуру тела строго на уровне 37,0 °C ± 0,5 °C с помощью гомеотермической системы мониторинга, оснащённой ректальным зондом для непрерывного мониторинга температуры. Введите смазанный зонд в прямую кишку сразу после введения анестезии и держите его на месте на протяжении всей процедуры.
  5. Анестезия мышей с помощью газовой анестезии мелких животных с изофлураном (5% для индукции, 1,5% для поддержания, с расходом кислорода 1,0 л/мин через калиброванный испаритель).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите глубокую анестезию по отсутствию отмены педалей. Все хирургические процедуры должны проводиться только после того, как мышь достигнет состояния глубокой анестезии.
  6. Побрийте шерсть на левом спинном боке.

2. Хирургическое вмешательство

  1. Модель uIRI (День 0)
    1. Расположите мышь в правый боковой декубитус, чтобы открыть левый бок.
    2. Сделайте продольный разрез кожи на левой спине длиной от 1 см до 1,5 см, затем разрез мышцы для входа в ретробрюшинное пространство.
    3. Аккуратно выдавите левую почку стерильным ватным тампоном, увлажнённым физиологическим раствором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Почку следует двигать только с помощью перипочечной жировой подушечки или стерильных ватных палочков. Щипцы никогда не должны касаться поверхности почки.
    4. Тщательно вскрыть педикул почки с помощью тонких щипцов, чтобы изолировать артерию и вену почки от окружающей соединительной ткани.
    5. Зажать левый педикул почки с помощью нетравматического сосудистого микроклипа для вызова ишемии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диссекция педикула почки должна быть выполнена чисто и полно. Процедура должна явно исключать мочеточник из применения зажима. Непреднамеренное зажим мочеточного зажима может вызвать гибридную травму ИРИ и одностороннюю обструкцию мочеточной непроходимости (UUO), что потенциально может привести к появлению постоянного обструктивного компонента.
    6. Запускайте таймер сразу после зажима. Длительность ишемии установлена строго на 28 минут.
    7. Проверьте ишемию визуально: цвет почки должен измениться с ярко-красного на тёмно-фиолетовый за считанные секунды.
    8. Накройте почки стерильной марлей, пропитанной тёплым физиологическим раствором.
    9. Через 28 минут снимите зажим, чтобы начать реперфузию.
    10. Подтвердите реперфузию визуально: цвет почки должен вернуться к розовому/красному через несколько минут.
    11. Аккуратно верните почку в брюшную полость.
    12. Закройте мышечный слой 5-0 впитываемых швов, а кожный разрез — 5-0 нейлоновых швов.
  2. Фиктивная операция (День 0)
    1. Выполните те же этапы анестезии, разреза и экстерьеризации почек, как описано в шаге 2.1.
    2. Вскрытие почечного педикула, но не зажимайте сосуды.
    3. Оставьте почку внешне в течение того же времени (28 минут), прежде чем вернуть её в брюшную полость и закрыть разрез.
  3. Операция CNx
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите CNx за 24 часа до запланированной конечной точки сбора образца для каждой конкретной группы, чтобы оценить остаточную функцию повреждённой почки.
    Для двухдневной группы: Проведите CNx в первый день после IRI.
    Для пятидневной группы: выполните CNx на 4-й день после IRI.
    Для группы на 1 неделю: выполните CNx на 6-й день после IRI.
    Для двухнедельной группы: выполните CNx на 13-й день после IRI.
    Для трёхнедельной группы: выполните CNx на 20-й день после IRI.
    Для группы на 4 недели: выполните CNx на 27-й день после IRI.
    1. Анестезиируйте мышь, как описано в шаге 1.5. Затем побрийте и продезинфицируйте правый спинной бок.
    2. Сделайте небольшой боковой разрез справа, чтобы обнажить правую почку.
    3. Экстерьерно выделяйте правую почку и аккуратно вскрывайте педикулу почки.
    4. Плотно перевязывайте педикулу почки (артерию, вену и мочеточник) с помощью шва из 4-0 неразасывающегося шелка.
    5. Отрезать правую почку дистально от лигатуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что из пня нет активного кровотечения.
    6. Вернуть педикул в брюшную полость и закрыть разрез, как описано в шаге 2.1.12.
    7. Дайте мыши восстановиться на грелке.

3. Послеоперационный уход и мониторинг

  1. Держите мышей на грелке, пока они полностью не восстановятся в сознании и не придут подвижности.
  2. Верните мышей в чистые клетки с легкодоступной едой и водой.
  3. Ежедневно следите за состоянием здоровья мышей.
    1. Проверяйте смертность ежедневно.
    2. Следите за изменениями в уходе, признаками дискомфорта или боли, а также на осанке.
    3. Осмотрите разрезы на наличие признаков инфекции, воспаления или распада.

4. Послеоперационные обследования

  1. Сбор образцов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей приносили в жертву в определённые временные моменты: 2 дня, 5 дней, 1 неделя, 2 недели, 3 недели и 4 недели после IRI для оценки прогрессирования травмы и фиброза.
    1. Обезболить мышей 3% изофлураном.
    2. Берите образцы крови для биохимического анализа сыворотки (если потребуется).
    3. Усыпить мышей путем вывиха шейки матки.
    4. Быстро удалять левую (повреждённую) почки.
    5. Разрезать ткань почек: зафиксировать одну порцию в коммерческом 4% параформальдегиде для гистологического анализа, а оставшуюся ткань быстро заморозить в жидком азоте и хранить при -80 °C для молекулярного анализа.
  2. Обработка и сечение тканей
    1. Обезвоживайте, очищайте и встраивайте фиксированные ткани в парафиновый воск, строго следуя протоколу обработки тканей, описанному Фельдманом иВулфом 8.
    2. Разрезать парафиновые блоки толщиной 4 мкм с помощью вращающегося микротома.
    3. Закрепите тканевые секции на стеклянные стекла и запекайте их при 60 °C в течение 2 часов, чтобы обеспечить прилипывание тканей.
  3. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)
    1. Депарафинизируйте тканевые слайды в ксилоле и регидратируйте их через нисходящую серию этанола до дистиллированной воды.
    2. Проведите окрашивание по H&E для оценки морфологических повреждений. Выполните этапы окрашивания и промывания точно так, как описано в стандартизированном протоколе Фельдмана иВольфа 8.
    3. Обезвоживайте, прочистите и накройте окрашенные стекли смолястой монтажной средой.
  4. Трихромное окрашивание Массона
    1. Депарафинизируйте и увлажняйте ткани в дистиллированную воду.
    2. Последовательно применяйте мордантные, ядерные, цитоплазматические и коллагеновые красители для оценки отложения коллагена и почечного фиброза. Следуйте точным временам инкубации реагентов и шагам промывания, описанным в Исламе иКумаре 9.
    3. Промыть, обезвожить, очистить и накрыть стекли для микроскопической оценки.
  5. Иммуногистохимия (IHC)
    1. Депарафинизируйте и увлажняйте тканевые участки.
    2. Проведите термоиндуцированное извлечение эпитопа с использованием буфера цитрата натрия объемом 10 мм, содержащего 0,05% Tween-20 (pH 6,0), как описано Магаки и др. 10.
    3. Блокировать активность эндогенной пероксидазы путём инкубации срезов в 3% перекиси водорода.
    4. Блокируйте неспецифические участки связывания с помощью 5% сывороточного альбумина в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
    5. Инкубировать участки с первичным антителом антиальфа-гладкомышечного актина (α-SMA) (разбавление 1:400) ночью при 4 °C.
    6. Промой стекли и инкубируй их с вторичным антителом в течение 1 часа при комнатной температуре.
    7. Визуализировать целевой антиген с помощью DAB и контрокрашиваться гематоксилином, соблюдая процедурные шаги, предложенные Магаки и др. 10.
    8. Обезвоживайте, прочистите и накройте стекли для финальной съёмки.

5. Статистический анализ

  1. Представить все количественные данные как среднее ± стандартное отклонение (SD).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Статистический анализ и генерация графов проводились с помощью программного обеспечения GraphPad Prism версии 10.0. Различия между несколькими группами по сравнению с одной контрольной группой (Sham) анализировались с помощью обычного одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), после чего последовал тест множественных сравнений Даннетта. P-значение < 0,05 считалось статистически значимым (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P. < 0,0001). NS не указывает на значимую разницу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На протяжении всего экспериментального периода общий уровень выживаемости составлял 100% как для группы Sham, так и для группы uIRI (n = 4 на момент времени). Ни при первоначальной операции uIRI, ни при последующей отложенной процедуре CNx, смертности не наблюдалось. Этот результат подтверждает высокий профиль безопасности и надёжность этого двухэтапного протокола по сравнению с двусторонними моделями ишемии, которые обычно страдают от значительной смертности, вызванной уремией.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящем исследовании описывается стандартизированный протокол для установления мышиной модели почечного интерстициального фиброза с использованием uIRI, после чего CNx проводит за 24 часа до окончания исследования. Динамический гистопатологический скрининг выявил отдельные патологические фазы: острый трубчатый некроз, характеризующийся пиком заболеваемости в течение 2–5 дней, за которым следуют активный фиброгенез и активация миофибробласта с пиком на 1–2 неделе, а к 3–4 неделям ткан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (82373042), Совместной инновационной командой клинических и фундаментальных исследований (202409) и Фондом естественных наук провинции Шаньдун (ZR2022QH291, ZR2025MS1199).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анти-альфа;-СМА-антителаProteintech14395-1-APПервичные антитела, используемые в IHC для обнаружения экспрессии α-SMA и оценки активации миофибробласта
Набора для анализа крови мочевины и азота (BUN)Нанкинский Цзяньчэнский институт биотехнологических исследований Co., Ltd.C013-2-1Используется для количественной оценки уровня BUN в сыворотке с целью оценки остаточной функции почек
Набор для анализа креатинина (CRE)Нанкинский Цзяньчэнский институт биотехнологических исследований Co., Ltd.C011-2-1Используется для количественной оценки уровня креатинина в сыворотке с целью оценки остаточной функции почек
Система газовой анестезииNanjing Calvin Biotechnology Co., Ltd.KW-MZJ-4Оснащён изофлураном для общей анестезии
Программное обеспечение GraphPad PrismGraphPad Software, Inc.Н/ДИспользуется для статистического анализа и графического представления данных (https://www.graphpad.com)
Система мониторинга гомеотермииНаука о проведенииCS-HS-0001Оснащён ректальным зондом для замкнутого контура, непрерывного мониторинга и регулирования температуры тела тела
ImageJ SoftwareНациональные институты здравоохраненияН/ДПрограммное обеспечение с открытым исходным кодом, используемое для морфометрической количественной оценки фиброзных областей и сигнала IHC
ИзофлуранRWD Life Science Co., Ltd R510-22Ингаляционный анестетик, используемый во время хирургических процедур
Массон s Trichrome Staining KitBeyotimeC0189MДля количественной оценки отложения коллагена
Нетравматический сосудистый микроклипРОРОЗ ХИРУРГИЧЕСКИЙ ИНСТРУМЕНТ КО.RS-5481TИспользовал для зажима педикул почек на 28 минут
Параформальдегид (4%)Beyotime Biotech IncP0099-100 млИспользуется для быстрой фиксации взятых образцов ткани почек
Буфер цитратного натрия (10 мМ, pH 6,0)Thermo Fisher Scientific Inc. 005000Используется для теплового извлечения эпитопов перед иммуногистохимическим окрашиванием
Стереотаксичный хирургический микроскопПекинская Zhongtian Guangzheng Technology Co., Ltd.TS-39NKИспользуется для проведения операций на ИРИ

Ссылки

  1. Lameire, N. H., et al. Acute kidney injury: An increasing global concern. Lancet. 382 (9887), 170-179 (2013).
  2. Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat Rev Nephrol. 7 (4), 189-200 (2011).
  3. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  4. Bonventre, J. V., Yang, L. J. T. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin Invest. 121 (11), 4210-4221 (2011).
  5. Venkatachalam, M. A., Weinberg, J. M., Kriz, W., Bidani, A. K. Failed tubule recovery, AKI-CKD transition, and kidney disease progression. J Am Soc Nephrol. 26 (8), 1765-1776 (2015).
  6. Ferenbach, D. A., Bonventre, J. V. J. N. R. N. Mechanisms of maladaptive repair after AKI leading to accelerated kidney ageing and CKD. Nat Rev Nephrol. 11 (5), 264-276 (2015).
  7. Wei, Q., Dong, Z. J. Mouse model of ischemic acute kidney injury: Technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1487-F1494 (2012).
  8. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  9. Islam, M. A., Kumar, S. Masson's trichrome staining technique to evaluate tissue fibrosis. Methods Mol Biol. 2983, 91-100 (2026).
  10. Magaki, S., Hojat, S. A., Wei, B., So, A., Yong, W. H. An introduction to the performance of immunohistochemistry. Methods Mol Biol. 1897, 289-298 (2019).
  11. Marschner, J. A., Schäfer, H., Holderied, A., Anders, H. J. Optimizing mouse surgery with online rectal temperature monitoring and preoperative heat supply: Effects on post-ischemic acute kidney injury. Plos One. 11 (2), e0149489(2016).
  12. Lu, X., et al. C57BL/6 and 129/Sv mice: genetic difference to renal ischemia-reperfusion. J Nephrol. 25 (5), 738-743 (2012).
  13. Wei, Q., Wang, M. H., Dong, Z. J. Differential gender differences in ischemic and nephrotoxic acute renal failure. Am J Nephrol. 25 (5), 491-499 (2005).
  14. Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. (78), e50495(2013).
  15. Chou, Y. H., et al. Methylation in pericytes after acute injury promotes chronic kidney disease. J Clin Invest. 130 (9), 4845-4857 (2020).
  16. La Russa, A., et al. Kidney fibrosis and matrix metalloproteinases (MMPs). Front Biosci (Landmark Ed). 29 (5), 192(2024).
  17. Fu, Y., et al. Rodent models of AKI-CKD transition. Am J Physiol Renal Physiol. 315 (4), F1098-F1106 (2018).
  18. Soranno, D. E., et al. Matching human unilateral AKI, a reverse translational approach to investigate kidney recovery after ischemia. J Am Soc Nephrol. 30 (6), 990-1005 (2019).
  19. Lourenço, B. N., et al. Development of a model of tubulointerstitial fibrosis using transient unilateral renal ischemia and delayed contralateral nephrectomy in domesticated cats. Comp Med. 74 (4), 274-283 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Острое повреждение почекхроническая болезнь почектубулярная атрофияинтерстициальный фиброзгистологическая оценкаиммуногистохимическая оценка
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.