Этот экспериментальный протокол был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованием Исследовательского института Абигейл Векснер при Национальной детской больнице (AR24-00184). Все процедуры соответствовали рекомендациям Руководства Национального института здоровья по уходу и использованию лабораторных животных. Это исследование соответствовало рекомендациям ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo . Эксперименты). Беременные овцы Дорсет (65–79 кг, 117–120 дней беременности) содержались в определённой среде, свободной от патогенов, с свободным доступом к еде и воде не менее 1 недели до операции. Оборудование, использованное в этом исследовании, перечислено в Таблице материалов.
Гуманные критерии конечных точек:
Осложнения от технического обслуживания линии.
Катетеры и кабель протока, вводящиеся в плод, наружу проходят через матку и бок овцы и закрепляются снаружи тела. Эти наружные линии могут быть окклюзированы из-за тромбоза или изгиба, либо могут быть смещены из-за движения животных. Возникающие осложнения могут включать инфекцию или сильное кровотечение. Признаки осложнений включают отсутствие возврата кровообращения во время отбора проб, постоянные ошибки в мониторинге, невозможность ввести инъекции через катетер, смещение линии и сильное кровотечение. Заложенные линии могут оставаться на месте, если нет признаков инфекции или кровотечения. В случаях неконтролируемого кровотечения после удаления линии или явных признаков инфекции, связанных с окклюзией, овцу и плоды усыпляют.
Преждевременные роды.
Преждевременные роды могут начаться на любом этапе беременности и чаще происходят после кардиологического вмешательства плода. Ранние признаки включают отёк вульвы и расслабление. Появление амниотического мешка указывает на скорую роду, которая обычно происходит в течение 30 минут после разрыва. Если будут обнаружены признаки преждевременных родов, овцу и плоды усыпляют, чтобы прекратить эксперимент и провести вскрытие.
Смерть плода.
Смерть плода может произойти на любом этапе беременности, особенно после кардиологического вмешательства плода. Хотя смерть плода часто приводит к преждевременным родам, она также может привести к системной инфекции у овцы. Если у овцы явные признаки прогрессирования родов или если плод признан нежизнеспособным, проводится терминальная процедура, а овца и плоды усыпляются.
Аборт с дистоцией после смерти плода.
Если один плод умирает, а близнец выживает, сохранение умершего плода может повысить риск аборта с дистоцией или без неё. Это может проявляться в виде изменений жизненных показателей или возбуждения у овцы. Если возникает дистоция, овцу и плоды усыпляют, чтобы прекратить эксперимент и провести вскрытие.
Массовое материнское кровотечение.
Беременная овца может испытать кровоизлияние как осложнение матки или брюшного разреза. Признаки включают вагинальное кровотечение, вялость и постоянные нарушения жизненно важных показателей. Сильное кровотечение может привести к образованию гематомы или шоку. Если кровопотеря мешает поддержанию физиологического среднего артериального давления или если тахикардия сохраняется несмотря на вмешательство, и наблюдаются признаки надвигающегося сердечно-сосудистого коллапса, будет проведена эвтаназия.
Повреждение или миграция воздушного шара.
Повреждение или смещение баллона может привести к неэффективной окклюзии притока ЛВ. Простая баллонная дефляция из-за повреждения может не вызывать клинических признаков, если гемодинамика плода остаётся стабильной. Если происходит смещение в конфигурации внутри ЛА, может возникнуть внутригрудное кровотечение и гибель плода. В случаях значительного кровотечения, приведшего к гибели плода, овцу и плоды усыпляют.
Отделение хирургического места и/или инфекция раны.
Отслоение места операции обычно происходит через 5–8 дней после операции и может сопровождаться инфекцией, некрозом тканей или грыжей внутренних органов. Рановые инфекции могут возникнуть в течение нескольких недель после операции. Если вмешательство возможно, будет назначено лечение; Если состояние станет опасным для жизни, будет рассматриваться эвтаназия.
1. Приготовление животных
- Возьмите кровь из яремной вены овцы, чтобы подтвердить негативность по лихорадке Q по прибытии.
- Привыкайте овец к стойке для постоянного послеоперационного мониторинга.
- Ветеринарная команда оценивает овец за 1 неделю до операции. Быстрые здоровые животные на ночь перед наркозом.
- Вводите диазепам (0,5 мг/кг) и кетамин (4 мг/кг) через внутреннюю яремную вену для седации.
- Интубировать овцу с помощью однопросветной эндотрахеальной трубки диаметром 8–9 мм и инициировать анестезию изофлураном (1%–5%). Поддерживайте анестезию с помощью изофлурана (1%–5% кислорода) или непрерывной инфузии пропофола (начиная с 30 мг/кг/ч; диапазон: 20–45 мг/кг/ч).
- Вставьте орогастральную трубку для декомпрессии желудка и рубца.
- Введите венозный катетер с одним просветом (16–18G) в головную или яремную вену для введения жидкости, инфузии пропофола и доставки препарата по мере необходимости.
- Установите артериальный катетер (22–24G) в ушную, бедренную или лучевую артерию для постоянного контроля артериального давления и взятия пробы крови.
- Побрить всю область брюшной полости — до спинной и паховой областей. Подготовьте место операции с использованием хлоргексидина, повидона-йода или спирта.
- Переведите овцу в операционную. Поместите животное на хирургический стол и поставьте под овцу согревающее устройство, чтобы предотвратить гипотермию. Закрепите все конечности.
- Применяйте неинвазивные мониторы, включая манжету для измерения давления на правой передней конечности, пульсоксиметр на ухе или языке, а электрокардиограмма позволяет контролировать давление матери, насыщение кислородом и частоту сердечных сокращений.
- Введите цефазолин (50 мг/кг) для профилактики антибиотиков перед разрезом. Повторяйте процедуру каждые 4 часа во время процедуры по мере необходимости.
2. Лапаротомия и гистеротомия овцы и торакотомия плода
- Проведите лапаротомию по средней линии, чтобы обнажить матку. Пальпацируйте матку и посчитайте количество плодов.
- Аккуратно выведите матку наружу. Выберите место для гистеротомии размером примерно 10–15 см, в зависимости от размера плода.
- Перед выполнением гистеротомии наложите шов из сумочной нитки (1 впитываемый плетённый шов) для контроля утечки амниотической жидкости. Открывайте стенку матки слой за слоем с помощью электрокоагулятера.
- Поставьте четыре зажима Babcock вдоль разреза матки, чтобы закрепить все слои и предотвратить потерю амниотической жидкости. Убедитесь, что амниотическая мембрана (самый внутренний слой) включена.
- Наложите непрерывный шов вдоль края разреза с использованием шёлка 2-0 для поддержания расположения амниотической оболочки к стенке матки.
- Аккуратно выведите голову плода наружу и закрепите шов на матке гемостатом (рисунок 1A). Накройте лицо плода индивидуальной пластиковой крышкой с отверстием для внутрисердечного эхокардиографического датчика (ICE), чтобы поддерживать влажность.
- Стабилизируйте головку плода с помощью марли для поддержания положения на спине.
- Введите зонд ICE в пищеводный орган плода через рот и проведите трансэзофагеальную эхокардиографию (TEE) (рисунок 1A).
- Получите исходные эхокардиографические измерения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Базовая эхокардиографическая оценка включает качественную оценку анатомии сердца и сократимости желудочков, а также количественные измерения размера желудочковой камеры и систолической функции при достаточном качестве изображения.
- Введите внутримышечную комбинацию препаратов, содержащую анальгетик, антихолинергический препарат и нейромышечный блокатор (фентанил 20 мкг/кг, атропин 20 мкг/кг и векуроний 20 мкг/кг) в бедро плода для уменьшения подвижности во время операции.
- Сделайте разрез на шее и обнажите яремную вену и сонную артерию.
- Введите катетер, наполненный жидкостью, в сонную артерию для мониторинга артериального давления, а другой — в яремную вену для контроля центрального венозного давления (рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Перевязывайте дистальные концы сосудов и закрепляйте катетеры двумя швами 2-0 швов.
- Закройте разрез на шее с помощью 2-0 шелковых швов, одновременно выводя катетеры наружу.
- Выровняйте две линии давления дополнительной амниотической линейкой и закрепите их вдоль шеи плода швами из 3-0 шелковых швов.
- Обнажите верхнюю часть тела плода, освободив шов из матки. Накладывайте швы на ксифовидной и дорсальной сторонах для надёжного положения.
- Закрепите голову плода и передние конечности марлей, чтобы разместить плод в правом боковом положении декубита.
- Проведите фетальную торакотомию в четвёртом межреберном пространстве и откройте грудную клетку с помощью разводчика рёбер.
- Откройте перикард и подвесьте его 4-0 шелковыми швами, чтобы обнажить левое предсердие (LA) и легочную артерию (PA).
- Вскрыть легочную артерию и восходящую аорту и окружить их сосудовыми петлями.
- Пропустите кабель 6-мм зонда потока через второе межреберное пространство и разместите его вокруг восходящей аорты.
- Проверьте достаточное качество сигнала, подключив датчик к блоку измерения потока.
3. Метод имплантации баллона 1: внутри левого предсердия (LA) (плоды старше GA110)
- Зажимайте левый предсердий (LA) немного выше атриовентрикулярной борозды с помощью небольшого наклонного сосудового зажима (рисунок 2A).
- Наложите шов из кошелька (6-0 полипропиленовый шов) на придатке LA и закрепите его жгутом.
- Вырежьте стену LA внутри шва кошелька с помощью тонких ножниц. Убедитесь, что отверстие достаточно для установки балона.
- Вставьте специально изготовленный баллонный катетер в LA. Закрепите катетер с помощью ранее наложенной шва на сумочку и укрепите фиксацию двумя дополнительными швами 4-0 швами (рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр шара составляет примерно 1,5 см при 5 мл и 2,7 см при 10 мл 30% глицерина. Хотя баллон был испытан на лаборатории для выдержки надувания до 17 мл, примерно 10 мл использовался как практический верхний предел для in vivo. надувания, поскольку большие объёмы могут указывать на неправильное накапливание или утечку и увеличивать риск чрезмерной компрессии или повреждения тканей.
- Проведите трансэзофагеальную эхокардиографию (TEE) для подтверждения правильного положения балона. Убедитесь, что шар лежит на митральной плоскости и не остаётся внутри придатка. Временно надуть баллон для подтверждения функциональной обструкции путём уменьшения митрального притока на TEE и уменьшения или исчезновения антеградного восходящего потока в аорте на зонде потока, затем сдуть его.
- Плотно закройте грудную клетку тремя швами из 2-0 швов. Избегайте сжатия баллонного катетера.
- Наружу вывести баллонный катетер из грудной полости в ту же подкожную плоскость, что и кабель проточного зонда, и направить их к дорсальной коже.
- Закрепите оба троса к спинной коже минимум в двух точках с помощью 2-0 шелковых швов (закрепите кожу, завяжите один трос, завяжите второй и заново закрепите кожу).
4. Метод имплантации балона 2: вне левого предсердия (LA) (плоды младше GA110)
- Освободите перикардиальную суспензию вокруг LA и оцените связь между перикардом и стенкой LA (рисунок 3).
- Наложите два полипропиленовых шва 6-0 на катетер баллона (один на кончике, другой у основания). Закрепите эти швы к перикарду в соответствующих позициях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разместить баллон в верхней стороне ЛА, когда перикард закрыт.
- Закройте перикард свободно, используя 2-0 шелковых швов.
- Корректируйте положение аэростаза под руководством TEE для достижения достаточного сжатия LA. Убедитесь, что надутый баллон сжимает LA с каудальной стороны, а не с задней стороны. Временно надувайте баллон для подтверждения гемодинамического эффекта, затем сдувайте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Адекватное сжатие определяется качественно как видимое уменьшение размера LA и митрального притока на TEE без сжатия соседних структур, а функционально — как уменьшение или исчезновение антеградного восходящего аортального потока на зонде потока.
- Плотно закройте грудную клетку тремя швами из 2-0 швов. Избегайте сжатия баллонного катетера.
- Наружу вывести баллонный катетер из грудной полости в ту же подкожную плоскость, что и кабель проточного зонда, и направить их к дорсальной коже.
- Закрепите оба троса к спинной коже минимум в двух точках с помощью 2-0 шелковых швов (закрепите кожу, завяжите один трос, завяжите второй и заново закрепите кожу).
5. Закрытие гистеротомии и лапаротомии с экстернализацией кабелей и катетеров
- Аккуратно возвращайте плод в матку. Сохраняйте как можно больше амниотической жидкости и плаценты.
- Снимите шов на сумочке и шов 2-0 с швом снова и снова. Удалите все остаточные швы из маточного разреза.
- Закройте матку с помощью впитывающихся плетёных швов в три непрерывных слоя: горизонтальный матрас, поверхностный и непрерывный покровительный шов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наружу выделите три линии давления, кабель зонда потока и баллонный катетер между слоями шва (рисунок 4).
- Вводите антибиотики (ампициллин 500–1000 мг и ципрофлоксацин 2 мг) в амниотический мешок через катетер амниотического давления, чтобы снизить риск внутриамниотической инфекции после гистеротомии, плодовой торакотомии и хронической экстернализации катетера/кабелей.
- Вернуть матку в брюшную полость.
- В брюшной фасции 2–3 см справа от linea alba наместите шов с кошельочной ниткой и пропустите кабели через отверстие.
- Отрегулируйте длину кабеля в брюшке живота и закрепите шов на фасции. Обеспечить небольшую подвижность кабелей; Не напрягайте слишком сильно.
- Введите специально изготовленное туннельное устройство в подкожную ткань правого бока овцы и продвигайте его к спинной области примерно на 50–60 см.
- Определите место выхода. Сделайте небольшой кожный разрез на дистальном конце туннельного устройства и удалите внутреннее ядро.
- Пропустите через устройство туннеля ещё две ПВХ-трубки. Соедините три линии давления и баллонный катетер к одной ПВХ-трубке, затем проведите их через туннель.
- Подключите кабель датчика потока к второй ПВХ-трубке и выведите её наружу через туннель.
- Уберите устройство туннеля с фланга.
- Закройте лапаротомию в три слоя: фасцию, подкожную ткань и кожу с помощью соответствующих швов.
- Частично закройте место выхода кабеля с помощью шва 3-0 полиглактина 910.
- Закрепите мешочек для хранения справа от овцы с помощью плётных полиэстеровых швов с 0 плет. Расположите сумку на 2–3 см от выхода кабеля, чтобы минимизировать трение. Общее время операции обычно составляет 4–4,5 часа от разреза кожи до закрытия.
6. Восстановление
- Прекратите анестезию и удалите орогастральную трубку. Экстубировать овцу после подтверждения самопроизвольного дыхания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экстубация обычно происходит после признаков возбуждения, включая движение шеи, моргание, тонус челюсти и жевание.
- Удалите артериальную линию от овцы.
- Переведите овцу в изолированную зону восстановления. Помогайте животному впасть в грудное положение, пока оно не сможет стоять и ходить самостоятельно.
- Вводите внутримышечный бупренорфин (0,015–0,05 мг/кг) каждые 8–12 часов для послеоперационной анальгезии. Вводите мелоксикам (0,3–1 мг/кг) по мере необходимости, с учетом ветеринарных рекомендаций.
- Внимательно следите за овцами в индивидуальном вольере в течение первых трёх дней в период острого восстановления.
7. Хроническое проживание и оценка
- Размещайте овцу в индивидуальном стойке, предназначенном для непрерывного гемодинамического мониторинга при минимизации напряжения.
- Подключите внешние катетеры к системам мониторинга. Постоянно измеряйте давление плода в аорте, центральное венозное давление, давление амниотической жидкости и аортальный поток.
- Получить образцы газов из артериального катетера при обнаружении аномальных гемодинамических значений.
- Начните надувание баллона примерно на третий день после операции с применением стерильного 30% глицерина. Увеличить объём баллона на 1 мл в день. После каждого прироста 0,5 мл контролируйте гемодинамический ответ плода не менее 5–10 минут для обеспечения стабильности, включая отсутствие брадикардии или среднего давления в артерии ниже 30 мм рт. ст. Продолжайте надувание до тех пор, пока антеградный восходящий поток аорты не снизится до нуля.
- Если 10 мл надувания баллона не достигается нулевого антеградного потока, подозревают утечку или неправильное накачивание шара, вместо продолжения надувания к лабораторно испытанной максимальной ёмкости шара. Спустите баллон и оцените наличие утечки или смещения с помощью катетера или ультразвуковой визуализации.
8. Вскрытие
- Отсоедините катетеры мониторинга и кабель зонда потока и уберите их во внешний контейнер.
- Успокойте и интубируйте овцу. Поддерживайте анестезию и установите орогастральную трубку и сосудистые катетеры по тому же протоколу, что и при первой операции.
- Переведите овцу в операционную. Положите животное на хирургический стол и поставьте под овцу согревающее устройство. Закрепите все конечности.
- Применяйте неинвазивные мониторы, как описано в начальной процедуре.
- Подключите катетеры давления и датчик потока к системе мониторинга.
- Откройте предыдущую лапаротомию и маточный разрез. Экстериоризировать экспериментальный плод.
- Стабилизируйте головку плода с помощью марли для поддержания положения на спине.
- Введите внутрисердечный эхокардиографический зонд (ICE) в пищевод плода через рот и проведите трансэзофагеальную эхокардиографию (TEE).
- Получите изображения положения баллона и собирайте эхокардиографические, данные о потоке и давлении. Спустите баллон и повторите измерения.
- Введите гепарин (10 000 U) плоду. Перевязать пуповину и ввести насыщенный хлорид калия в пуповинную вену, чтобы остановить сердце в диастоле.
- Удалять экспериментальный плод. Откройте грудную полость и оцените положение балона, миграцию и признаки инфекции.
- Удалить сердце, измерить вес сердца и взять образцы ткани миокарда.
- Повторите шаги 8.6–8.12 для контрольного плода.
- Усыпить овцу с помощью пентобарбитала натрия под анестезией.