Мы описываем метод физического сужения для получения мини-эмбрионов из 1-клеточных эмбрионов Xenopus laevis .
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Физическая манипуляция для создания эмбрионов Xenopus Mini
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Определяющей чертой раннего эмбриогенеза является быстрое, экспоненциальное уменьшение размера отдельных клеток при постоянном объёме эмбриона. Соотношение нуклеоцитоплазматических (N:C) играет критическую роль в регулировании клеточной и молекулярной активности, необходимой для раннего эмбриогенеза. Физическая манипуляция размером эмбриона, таким образом, представляет собой важный способ изучения этих механизмов развития. Большой размер (~ 1,2 мм в диаметре) и высокая пластичность ранних эмбрионов Xenopus laevis делают их идеальной моделью для физического вскрытия и манипуляций с целью изучения регуляторных механизмов развития. Здесь мы описываем подход к получению мини-эмбрионов с изменённым цитоплазматическим объёмом и соотношением N:C путём сужения одноклеточных эмбрионов Xenopus laevis волосяными узлами. Полученные мини-эмбрионы инициируют раннюю активацию зиготного генома (ZGA), напрямую вызванную уменьшением размера клеток и ростом соотношения N:C. Эти мини-эмбрионы, которые можно обобщить на другие эмбриональные системы, предоставляют уникальный и мощный инструмент для анализа механизмов раннего развития эмбриона, опосредованных размером.
Введение
Одной из самых заметных особенностей раннего эмбриогенеза является экспоненциальное уменьшение размера отдельных клеток внутри эмбриона, при котором объём сохраняется постоянным. Быстрый синтез ДНК и уменьшение размера клеток приводят к увеличению нуклеоцитоплазматического соотношения (соотношение N:C), что играет важную роль в регулировании ряда характерных активностей перехода среднего бластулы (MBT) в модельных эмбриональных системах, включая зиготную транскрипцию генов, удлинение клеточный цикл и подвижностьклеток 1,2,3,4
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Описанные здесь работы с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Южной Каролины.
1. Подготовка материалов
- Подготовка решений
- Приготовьте 20× MMR, смешивая 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2 и 40 mM CaCl2. Отрегулируйте pH до 7.8 с NaOH. Автоклав и хранение при комнатной температуре.
- Приготовьте раствор среды с градиентом плотности 3% (масса/объём), смешивая 1,5 г среды с градиентом плотности с 50 мл 0,5× MMR. Аккуратно перемешивайте магнитной перем....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эмбрионы Xenopus laevis на стадии 1 клетки были сжаты волосяными узлами, как описано выше. Контрольные и мини-эмбрионы на ~9-й стадии (8,5 hpf при 23 °C) были снимены под стереомикроскопом. Как показано на рисунке 2, объём некоторых мини-эмбрионов составляет ~1/3 от объёма контрольных. Этот результат свидетельствует о том, что ранние эмбрионы Xenopus можно манипулировать для создания мини-эмбрионов, предоставляя уникальную модель для изучен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем метод генерации мини-эмбрионов в Xenopus путём физического сужения одноклеточных стадий эмбрионов с волосяными узлами. Этот подход предоставляет прямые доказательства того, что уменьшение размера клетки индуцирует ЗГА в модельномэмбрионе 11.
Несколько аспектов этого протокола критически важны для успешного создания мини-эмбрионов. Для завязывания волос важно использовать тонкие, долговечные волосы, желательно.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Автор заявляет, что нет конкурирующих интересов.
Благодарности
Мы благодарим лабораторию Мэттью Гуда при Университете Пенсильвании за предоставленное обучение. Эта работа частично поддерживалась Национальным институтом здоровья детей и развития человека имени Юнис Кеннеди Шрайвер (R03HD105802).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Игла 30 G | BD Medical | 305128 | Для проколов эмбрионов |
| 60 мм одноразовые чашки Петри | VWR | 25384-092 | Для инкубационных эмбрионов |
| Стереомикроскопы ACCU-SCOPE 3075 Zoom | VWR | 470351-130 | Для визуализации эмбрионов |
| Агарозе | Сигма-Олдрич | A-9414 | Для покрытия чашек Петри |
| Пинцет Dumont, стиль 5 | Науки об электронной микроскопии | 72701-D | Для корректировки и хранения эмбрионов |
| Ficoll 400 | Сигма-Олдрич | GE17-0300-10 | Для инкубационных эмбрионов |
| TipOne Pipette Tip, 10 и микро; L | USA Scientific | 1111-3700 | Для крепления волосяных узлов |
| Восковый блок, чёрный | Carolina Biological Supply Co. | 974228 | Для крепления волосяных узлов |
Ссылки
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
- Newport, J., Kirschner, M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
