Методическая статья

Физическая манипуляция для создания эмбрионов Xenopus Mini

213 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70602

⸱

10 апреля 2026 г.

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод физического сужения для получения мини-эмбрионов из 1-клеточных эмбрионов Xenopus laevis .

Аннотация

Определяющей чертой раннего эмбриогенеза является быстрое, экспоненциальное уменьшение размера отдельных клеток при постоянном объёме эмбриона. Соотношение нуклеоцитоплазматических (N:C) играет критическую роль в регулировании клеточной и молекулярной активности, необходимой для раннего эмбриогенеза. Физическая манипуляция размером эмбриона, таким образом, представляет собой важный способ изучения этих механизмов развития. Большой размер (~ 1,2 мм в диаметре) и высокая пластичность ранних эмбрионов Xenopus laevis делают их идеальной моделью для физического вскрытия и манипуляций с целью изучения регуляторных механизмов развития. Здесь мы описываем подход к получению мини-эмбрионов с изменённым цитоплазматическим объёмом и соотношением N:C путём сужения одноклеточных эмбрионов Xenopus laevis волосяными узлами. Полученные мини-эмбрионы инициируют раннюю активацию зиготного генома (ZGA), напрямую вызванную уменьшением размера клеток и ростом соотношения N:C. Эти мини-эмбрионы, которые можно обобщить на другие эмбриональные системы, предоставляют уникальный и мощный инструмент для анализа механизмов раннего развития эмбриона, опосредованных размером.

Введение

Одной из самых заметных особенностей раннего эмбриогенеза является экспоненциальное уменьшение размера отдельных клеток внутри эмбриона, при котором объём сохраняется постоянным. Быстрый синтез ДНК и уменьшение размера клеток приводят к увеличению нуклеоцитоплазматического соотношения (соотношение N:C), что играет важную роль в регулировании ряда характерных активностей перехода среднего бластулы (MBT) в модельных эмбриональных системах, включая зиготную транскрипцию генов, удлинение клеточный цикл и подвижностьклеток 1,2,3,4 . Манипуляции соотношением N:C путём изменения плоидии ДНК подтверждают его функциональную значимость в раннем эмбриогенезе в нескольких модельныхсистемах 3,4,5,6.

Физическая манипуляция размером эмбриона представляет собой важный метод изучения регуляторных механизмов в раннем эмбриональномразвитии 7. Цитоплазматическое удаление аспирацией, изменяющее соотношение N:C в ранних эмбрионах мышей, вызывает преждевременноеуплотнение 8. Кроме того, уменьшение размера эмбриона данио-рерио, путём рубки, выявило новый механизм масштабирования сомитовна основе градиентов 9. Кроме того, уменьшение цитоплазматического объёма в эмбрионах Xenopus выявило динамику клетического цикла, зависящую от соотношения N:C 10. Важно, что, создавая мини-эмбрионы Xenopus путём уменьшения размера клеток и маркируя зарождающиеся транскрипты 5-этинилуридином (5-EU) в отдельных клетках, мы продемонстрировали, что уменьшение размера клетки индуцирует активацию зиготического генома (ZGA) в дозозависимомрежиме 11. Эти результаты подтверждают ключевую роль размера клеток в раннем эмбриогенезе.

Здесь мы описываем подробную процедуру получения мини-эмбрионов Xenopus laevis с помощью физических манипуляций с использованием волосяных узлов (рисунок 1)10,11. Этот подход основан на фундаментальном использовании Newport и Kirschner (1982) сужения волосяной петли на ранних эмбрионах Xenopus 1, обеспечивая чёткий и надёжный протокол для создания мини-эмбрионов в качестве экспериментальных инструментов. Кроме того, этот метод применим и к другим эмбриональнымсистемам 7, что способствует выявлению новых механизмов раннего эмбриогенеза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Описанные здесь работы с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Южной Каролины.

1. Подготовка материалов

  1. Подготовка решений
    1. Приготовьте 20× MMR, смешивая 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2 и 40 mM CaCl2. Отрегулируйте pH до 7.8 с NaOH. Автоклав и хранение при комнатной температуре.
    2. Приготовьте раствор среды с градиентом плотности 3% (масса/объём), смешивая 1,5 г среды с градиентом плотности с 50 мл 0,5× MMR. Аккуратно перемешивайте магнитной перемешивающей стержницей до растворения полимера. Держите при 4 °C до использования.
    3. Приготовьте гель агарозы 1% в чашке Петри толщиной 60 мм, смешав 0,5 г агарозы с 50 мл массой 0,1× MMR. Нагрейте в микроволновке для растворения агарозы, затем добавьте 5 мл агарозы, чтобы тонким слоем покрыть дно чашки Петри толщиной 60 мм.
  2. Подготовка волосяных узлов для сужающих эмбрионов
    1. Возьмите тонкие волоски и нарежьте их на ~5 см кусочки.
    2. Пинцетом вставьте один кончик волоса в кончик P10 глубиной примерно ~1 см.
    3. Нанесите воск на ложку и нагрейте, чтобы воск расплавился. Быстро окуньте прикреплённый к волосу кончик P10 в воск и дайте ему высохнуть 1 минуту. Убедитесь, что волосы фиксированы на конце кончика P10.
    4. Используйте пинцет, чтобы аккуратно завязать волосы сверху. Отрегулируйте размер петли на ~1,5 мм. При необходимости подрежьте выступ. Отложите узел на будущее.
    5. Повторяйте предыдущие шаги, чтобы сделать больше волосяных узлов по мере необходимости.

2. Создание мини-эмбрионов Xenopus

  1. Для получения эмбрионов Xenopus следует стандартному протоколу проведения экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) (например, см. Sive et al., 2007)12. Эмбрион должен быть в 0,1× MMR, готов к использованию.
  2. Чтобы визуализировать ZGA в отдельных клетках ранних эмбрионов и изучить их регуляторные механизмы, микроинъекцируйте эмбрионам 1-клеточной стадии 5-этинилуридин (5-EU) для метаболической маркировки зарождающихся транскриптов11,13 перед выполнением следующих процедур.
  3. Когда эмбрионы находятся на ~1 час после оплодотворения (HPF), используйте пластиковую трансферную пипетку для переноса ~20 эмбрионов в чашку Петри диаметром 60 мм (покрытую 1% агарозным гелем), содержащей ~15 мл среды с градиентом плотности 3% / 0,5× MMR.
  4. Используйте пинцет в одной руке, чтобы повернуть эмбрион примерно на ~45–60 градусов под стереомикроскопом, чтобы получить доступ к растительному полюсу (бледному полушарию). Держите наклонённый эмбрион пинцетом, а в другой руке аккуратно проколите вегетационный столб иглой 30G. Выпустите часть цитоплазмы, аккуратно надавливая на эмбрион.
  5. Аккуратно накройте волосяной узел, закреплённый в наконечнике P10 на эмбрионе, чтобы полюс животных (тёмное полушарие) находился внутри волосяного узла. Отрегулируйте положение узла в соответствии с желаемым размером мини-эмбриона.
  6. Держите пипетку P10 одной рукой, а другой — пинцетом, чтобы потянуть два верхних конца узла в противоположных направлениях. Волосяной узел затягивается вокруг эмбриона, между животным полюсом (целым) и растительным полюсом (с выделением цитоплазмы). Отрежьте узел волос в месте, где он крепится к кончику P10.
  7. Повторите шаги 2.4–2.6 выше, чтобы получить нужное количество мини-эмбрионов.
  8. Пусть эмбрионы находятся в среде с градиентом плотности 3% / 0,5× MMR в течение ~1–2 часа. Затем удалите среду пипеткой P1000, не нарушая эмбрионы, и пополните её 15 мл 0,1× MMR.
  9. Дайте эмбрионам развиться до нужных стадий, затем с помощью пинцета аккуратно снять узлы с мини-эмбрионов.
  10. Собирайте эмбрионы для желаемого анализа, например, визуализации ZGA в отдельныхклетках 11,13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эмбрионы Xenopus laevis на стадии 1 клетки были сжаты волосяными узлами, как описано выше. Контрольные и мини-эмбрионы на ~9-й стадии (8,5 hpf при 23 °C) были снимены под стереомикроскопом. Как показано на рисунке 2, объём некоторых мини-эмбрионов составляет ~1/3 от объёма контрольных. Этот результат свидетельствует о том, что ранние эмбрионы Xenopus можно манипулировать для создания мини-эмбрионов, предоставляя уникальную модель для изучен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем метод генерации мини-эмбрионов в Xenopus путём физического сужения одноклеточных стадий эмбрионов с волосяными узлами. Этот подход предоставляет прямые доказательства того, что уменьшение размера клетки индуцирует ЗГА в модельномэмбрионе 11.

Несколько аспектов этого протокола критически важны для успешного создания мини-эмбрионов. Для завязывания волос важно использовать тонкие, долговечные волосы, желательно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор заявляет, что нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим лабораторию Мэттью Гуда при Университете Пенсильвании за предоставленное обучение. Эта работа частично поддерживалась Национальным институтом здоровья детей и развития человека имени Юнис Кеннеди Шрайвер (R03HD105802).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Игла 30 GBD Medical305128Для проколов эмбрионов
60 мм одноразовые чашки ПетриVWR25384-092Для инкубационных эмбрионов
Стереомикроскопы ACCU-SCOPE 3075 ZoomVWR470351-130Для визуализации эмбрионов
АгарозеСигма-ОлдричA-9414Для покрытия чашек Петри
Пинцет Dumont, стиль 5Науки об электронной микроскопии72701-DДля корректировки и хранения эмбрионов
Ficoll 400Сигма-ОлдричGE17-0300-10Для инкубационных эмбрионов
TipOne Pipette Tip, 10 и микро; LUSA Scientific1111-3700Для крепления волосяных узлов
Восковый блок, чёрныйCarolina Biological Supply Co.974228Для крепления волосяных узлов

Ссылки

  1. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  2. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  3. Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
  4. Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
  5. Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
  6. Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
  9. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
  10. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  11. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
  13. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  14. Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи