Метастазы мозга при раке молочной железы — мышиная модель для характеристики иммунных и стромальных клеток у менинга и обонятельной лукови

Краткое содержание

Протокол устанавливает метастазирование рака молочной железы в мозге через внутричерепную инокуляцию и характеризует с помощью потоковой цитометрии ключевые подгруппы лимфатических и иммунных клеток, регулирующих иммунитет мозга. Эти анализы дают представление о динамике иммунных и стромальных клеток, формирующих микроокружение мозга, что способствует разработке новых терапевтических стратегий.

Аннотация

Центральная нервная система (ЦНС) окружена специализированными иммунными интерфейсами, включая мозговые каналы и обонятельную луковицу, которые могут служить как разрешенными путями для метастатической колонизации, так и входными точками противоопухолевых иммунных ответов. Понимание того, как динамика иммунных клеток эволюционирует внутри этих структур во время метастазного прогрессирования, крайне важно для выявления механизмов, которые поддерживают или ограничивают рост опухолей в мозге. Этот протокол подробно описывает создание модели мышей с метастазами мозга при раке молочной железы (BCBM) посредством внутричерепной инъекции клеток рака молочной железы E0771 мышам C57BL/6. После развития опухоли мозговые клетки и обонятельная луковина тщательно вскрываются, ферментативно перевариваются и превращаются в отдельные суспензии. Эти популяции затем анализируются с помощью мультипараметрической спектральной цитометрии для всесторонней характеристики лимфоидных, миелоидных и стромальных клеточных подмножеств внутри иммунных нишей, связанных с ЦНС. Такой рабочий процесс позволяет проводить сравнительный анализ между опухоленосными и неопухолевыми контролями, выявляя изменения в иммунных интерфейсах ЦНС, которые могут лежать в основе обхода от иммунитета опухоли и представлять потенциальные терапевтические цели. В целом, протокол обеспечивает воспроизводимый подход к изучению BCBM и изучению иммунной регуляции на интерфейсах периферической иммунной системы ЦНС. Её можно адаптировать для дополнительных раковых клеточных линий, иммунотерапии или генетических мышиных моделей для изучения механизмов иммунной устойчивости и терапевтического ответа в микросреде мозга.

Введение

Метастазы в мозге — самые распространённые злокачественные опухоли, поражающие центральную нервную систему (ЦНС), встречающиеся чаще, чем первичные опухоли мозга. Рак легких, рак молочной железы и меланома — основные виды рака, которые чаще всего метастазируют в мозг^{. 1}. Среди них метастазы в мозге при раке молочной железы (BCBM) представляют собой серьёзную клиническую проблему, затрагивая 10–30% пациентов с метастазом и демонстрируя растущую частоту заболеваемости благодаря улучшенным системным методам терапии и достижениям в^{нейровизуализации 2}. Прогноз для пациентов с BCBM остаётся плохим, поскольку доступные методы лечения — включая хирургию, лучевую терапию и химиотерапию — в основном паллиативные, а неврологические симптомы серьёзно влияют на качество^{жизни 3}. Хотя таргетные и иммунотерапии рассматриваются как дополняющие стратегии, клиническая польза иммунотерапии при метастазах в мозге остаётся^{ограниченной 4,5,6}.

Недавние исследования усовершенствовали наше понимание иммунитета мозга и возобновили интерес к функциональным лимфатическим путям, связанным с ЦНС, включая лимфатические сосуды в^{мозговых мозгах 7} и^{слизистой слизистой носа 8}. Эти структуры образуют непрерывную лимфатическую сеть, окружающую мозг и простирающуюся рядом с обонятельной луковицей и крибриформной пластинкой, в конечном итоге соединяясь с шейными лимфатическими узлами. Эта система играет ключевую роль в гомеостазе жидкости, иммунном надзоре и транспорте иммунных клеток между ЦНС и периферическими лимфоидными^{органами 9}. По мере роста интереса к иммунотерапевтическим подходам к опухолям и метастазам мозга эти лимфатические и иммунные интерфейсы становятся перспективными, но всё ещё недостаточно изученными путями, через которые системный иммунитет может взаимодействовать с внутричерепными поражениями. Кроме того, механизмы, регулирующие набор иммунных клеток в микросреду опухоли мозга, и то, как эти клетки взаимодействуют в этой уникальной среде, остаются плохо изученными. В совокупности эти пробелы подчёркивают необходимость доклинических моделей и процедур, позволяющих всесторонний анализ взаимодействий между опухолью и иммунным взаимодействием и поддерживающих разработку стратегий по улучшению противоопухолевой иммунитета против метастазов в мозге.

Здесь мы описываем протокол, который сочетает создание воспроизводимой, иммунокомпетентной модели мышей BCBM посредством стереотаксичной внутричерепной инокуляции клеток E0771 с выделением и диссоциацией мозговых мозгов и обонятельной луковицы для иммунофенотипирования с помощью спектральной цитометрии. Этот подход позволяет проводить контролируемое моделирование BCBM для оценки безопасности и эффективности терапевтических вмешательств, а также позволяет глубоко охарактеризовать иммунные и стромальные популяции на интерфейсе лимфатического и иммунного мозга, предоставляя представление о клеточных факторах, формирующих микроокружение опухолей мозга и влияющих на ответы на лечение.

Животные модели остаются незаменимыми для изучения метастазов в мозге, поскольку многие критически важные аспекты прогрессирования метастатического цикла невозможно воспроизвести in vitro. Было разработано несколько моделей мышей in vivo для генерации метастазов в мозге, каждая из которых имеет свои преимущества и ограничения¹⁰. Модели спонтанных метастазов, включая ортотопную имплантацию или генетически модифицированные мышиные модели, более близко имитируют клиническое прогрессирование заболевания, но редко вызывают внутричерепные поражения, требуют длительных экспериментальных сроков и часто обеспечивают высокую изменчивость из-за широко распространённых экстракраниальных заболеваний. Системные методы, включая интракардиакальные, интракаротидные или хвостовые вены, вводят опухолевые клетки в кровообращение и лучше имитируют гематогенное распространение, экстравазацию гематоэнцефалического барьера и колонизацию. Однако эти модели не охватывают ранние стадии первичного вторжения в опухоли и часто приводят к обширным и изменчивым экстракраниальным метастазам, особенно в лёгких. Среди системных моделей интрасонная инъекция имеет наименьшую вариабельность, но требует продвинутых хирургических знаний. Альтернативно, внутричерепная инъекция обладает рядом преимуществ, включая точный контроль расположения опухоли, быстрое и воспроизводимое развитие опухоли, а также снижение вариабельности между экспериментами. Этот подход также может дополняться ортотопической первичной опухолью, а затем хирургической резекцией для более точного имитации метастатического процесса. Хотя внутричерепная инъекция не воспроизводит полный метастатический каскад и не подходит для изучения ранней инвазии и распространения, она предоставляет надёжную модель для оценки терапевтической эффективности при выявленных поражениях и для изучения взаимодействий в микроокружении мозга. Известное ограничение заключается в том, что сама инъекция может вызывать локальное нейровоспаление, потенциально влияя на иммунные показатели, которые можно оценить, сравнивая иммунные профили у инъекционных и неинъекционных мышей.

Иммунная характеристика мозговых мозгов и обонятельной лукови остаётся относительно новой и малоизученной областью исследований. Большинство исследований опираются на образцы целого мозга или шейных лимфатических^{узлов 11}, которые не отражают характерный клеточный состав и специализированные иммунные функции этих лимфатических тканей. Восстановление обеих структур даёт более широкий и информативный взгляд на иммунитет мозга. В сочетании с мультипараметрической спектральной потоковой цитометрией этот рабочий процесс поддерживает высокопроизводительное профилирование многочисленных и редких иммунных клеток, участвующих в периферической иммунной коммуникации ЦНС. Это включает количественную оценку поверхностных и внутриклеточных маркеров для выявления подмножеств клеток, оценки состояний активации и изменений, вызванных лечением. Другие методологии иммунного анализа ЦНС, не охватываемые этим протоколом, включают иммуногистохимию (IHC) и иммунофлуоресценцию (IF), которые сохраняют пространственное распределение иммунных клеток, но ограничены низкомаркерным мультиплексированием, субъективной количественной оценкой и недостаточной представленностью редких типов^{клеток 12}. В последнее время секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) расширило возможности профилирования иммунных популяций ЦНС, позволяя открывать клеточные состояния и транскрипционные программы с высоким разрешением. Несмотря на мощное транскриптомическое понимание, scRNA-seq ограничен стоимостью, артефактами диссоциации, выпадением транскрипта и потерей разрешения на уровне^{белка 13,14}. Потоковая цитометрия, хотя и не обладает пространственным анализом и чувствительна к эффектам, связанным с диссоциацией, обеспечивает превосходное фенотипическое разрешение благодаря продвинутой мультипараметрической панели и обеспечивает надёжное количественное иммунное профилирование.

В совокупности описанные здесь методологии предоставляют гибкую и мощную платформу для моделирования BCBM и анализа иммунной динамики на лимфатических интерфейсах ЦНС, поддерживая доклиническую разработку терапии, направленных как на микроокружение опухолей мозга, так и на связанные с ней иммуннорегуляторные пути.

Протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с рекомендациями фармацевтического факультета Лиссабонского университета. Протоколы были рассмотрены и утверждены португальским компетентным органом по защите животных, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (ссылка 0421/000/000/2021).

1. Подготовка клеток E0771 для имплантации in vivo

1. В стерильном капюшоне культивируйте клетки E0771 в термофляге T75 с использованием Modified Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco, дополненных 10% (v/v) сывороткой плода (FBS) и 1% (v/v) пенициллином и стрептомицином (PEST).
   1. Убедитесь, что клетки аутентифицированы с помощью профилирования STR после получения от поставщика и подтверждены отсутствие микоплазмы путём регулярного тестирования. Культивировать опухолевые клетки как минимум через 2–8 проходов после оттаивания перед имплантацией в мозг.
2. В день имплантации убедитесь, что клетки здоровы и на 80-90% слились. Удалите среду и промыйте клетки с помощью фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
3. Добавьте трипсин в колбу и инкубуйте 5 минут при 37 °C. Затем добавьте в три раза больше объёма дополнительной среды (DMEM с 10% v/v FBS и 1% v/v PEST), чтобы нейтрализовать трипсин и диссоциировать клетки.
4. Перенесите ячейки в трубку и центрифугите при 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Удалите супернатант и снова суспензуйте гранулу в PBS для подсчёта клеток.
5. Снова центрифугуйте (300 г в течение 5 минут), выбросьте супернатант и снова суспензируйте клетки в PBS при концентрации 1 x 10⁵ E0771 в 2 мкл на животное. Держите клеточную суспензию на льду до инокуляции опухоли. Подготовьте клеточную суспензию непосредственно перед инъекцией.

2. Инокуляция внутричерепной опухоли с помощью стереотаксического аппарата

1. Заведите самок мышей C57BL/6 (6-8 недель) и приучите их к животному хозяйству как минимум за 7 дней до операции. Держите домашних мышей в контролируемых условиях с 12-часовым циклом свет/темнота и обеспечивайте едой и водой по умолчанию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется минимум пять животных на экспериментальную группу, чтобы обеспечить достаточную статистическую мощность для значимого сравнительного иммунного профилирования между опухолоносными и контрольными состояниями.
2. Подготовьте хирургическое поле и все необходимые материалы перед началом процедуры:
   1. Хирургические инструменты: лезвия для скальпеля, ножницы, щипцы, держатели для игл, проволока для швов.
   2. Оборудование и другое: стереотаксичный прибор, стеклянный шприц, дрель, бритва, ватные палочки, грелка.
   3. Анестезия: Приготовьте кетамин-ксилазин (K-X) (25 мг/мл и 2 мг/мл соответственно) в PBS в пробирке на 15 мл.
   4. Обезболивание: приготовьте бупренорфин при 15 мкг/мл в PBS в пробирке на 15 мл.
   5. Другие растворы: повидон-йод, перекись водорода 3% V/V (H_2O2), офтальмологическая мазь.
      ВНИМАНИЕ:_H2O2 вреден при проглатывании и может вызвать раздражение кожи.
3. Анестезия мыши путём интрабрюшинной (т.е.) инъекции K-X (100 мкл на 10 г массы тела). Подтвердите адекватную анестезию по отсутствию ответа на защемление пальца.
4. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить обезвоживание, и кладите мышь на грелку на протяжении всей процедуры.
5. Побрийте кожу головы и продезинфицируйте операционную зону повидон-йодом. Сделайте продольный разрез длиной 1 см вдоль средней линии, чтобы обнажить череп.
6. Очистите обнажённый череп H₂O₂ ватной палочкой по кругу, чтобы визуализировать брегму. Если появляется избыток пены, удалите её сухим тампоном.
7. Разместите мышь в стереотаксичном кадре. Установите брегму в качестве ориентира (0,0) и измерьте 2,5 мм боковой и 0,5 мм перед брегмой. Отметьте место инъекции.
8. Снимите мышь и просверлите небольшое отверстие по отмеченным координатам. Избегайте слишком глубокого сверления, чтобы предотвратить повреждение мозга.
9. Закрепите шприц на инжектор. Суспензируйте клетки и загрузите стеклянный шприц достаточным объёмом для двух инъекций (4–5 мкл). Не готовьте более двух инъекций за раз, чтобы избежать оседания клеток.
10. Переместите мышь в стереотаксике, выровняйте иглу с отверстием и медленно опускайте её на глубину 3,0 мм в паренхиму мозга. Вводите клетки (или стерильный PBS для фиктивного контроля) при 1 мкл/мин.
11. После инъекции держите иглу на месте не менее 1 минуты, затем отступите на 1,5 мм, подождите ещё минуту, затем полностью отключите. Это минимизирует обратный поток и обеспечивает правильное отложение ячеек.
12. Закройте разрез швами и нанесите повидон-йод. Вводите бупренорфин (100 мкл) подкожно.
13. Держите мышь на грелке до полного восстановления после наркоза. Верните мышь в чистую клетку и ежедневно следите за проблемами, неврологическими признаками или инфекциями.

3. Внутрисердечная перфузия мыши

1. Анестезия мышей путём инъекции K-X (100 мкл на 10 г массы тела). Подтвердите адекватную анестезию по отсутствию ответа на защемление пальца.
2. С помощью ножниц сделайте разрез диаметром 5–6 см через брюшную стенку и два разреза через грудную клетку до ключицы. Будьте осторожны, чтобы не перерезать крупные кровеносные сосуды.
3. Когда сердце открыто, перережьте правое предсердие, чтобы обеспечить кровоток. Введите ледяной PBS в левый желудочек шприцем на 20 мл с иглой 25G × 1 дюйм.
4. Прекратите перфузию, когда жидкость, выходящая из неё, будет чиста от крови. Для взрослых мышей требуется около 20 мл PBS.

4. Изоляция мышиных менинцев и обонятельной луковицы

1. После внутрисердечной перфузии обезглавить мыши хирургическими ножницами. Полностью удалите кожу головы, чтобы обнажить череп.
2. С помощью ножниц разрежьте череп в поперечной плоскости от задней части к глазам, стараясь не повредить подлежащую ткань мозга. Аккуратно извлекайте мозг с помощью тонких щипцов, избегая контакта или царапания внутренней поверхности черепа.
3. После удаления мозга дуральные менинги остаются прикреплёнными к внутренней поверхности черепа. Погрузите череп в ледяной PBS минимум на 5 минут, чтобы облегчить целое разделение мозговых волос.
4. Вскрыть обонятельную луковицу из передней части мозга и перенести её в ледяную PBS для временного хранения до обработки.
5. С помощью тонких щипцев аккуратно отделите мозговые волосы от внутренней поверхности черепа, аккуратно поднимая и отдыхая тонкий слой ткани. Перенесите мозги в ледяной PBS до дальнейшей обработки. Избегайте разрыва ткани, чтобы обеспечить оптимальное восстановление клеток на следующей линии.

5. Диссоциация тканей на отдельные клетки

1. Менингес
   1. Перенести менинги в 3 мл RPMI 1640, содержащие 0,05% коллагеназу II и ДНКазу I. Инкубировать 20 минут при 37 °C, аккуратно перемешивать каждые 10 минут. Чрезмерное переваривание снижает жизнеспособность клеток и его следует избегать.
   2. Пропустите переваренную ткань через сито для клеток размером 40 мкм в трубку объемом 50 мл. Механически диссоциируйте оставшуюся ткань, аккуратно прижимая поршень шприца к сито, и промывайте 5 мл PBS.
   3. Центрифуга при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C. Отбросьте супернатант и снова суспензируйте пеллеты в 3 мл PBS.
   4. Повторяйте центрифугирование. Сбросьте супернатант, подвесьте последнюю гранулу в оставшееся объём и перенесите на 96-колодную пластину с U-дном.
2. Обонятельная лампочка
   1. Удалять PBS и механически диссоциировать ткани с помощью поршня для шприца. Добавьте 3 мл раствора для пищеварения, содержащего 0,02% коллагеназу II, в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS). Инкубировать 20 минут при 37 °C, слегка перемешивая каждые 10 минут.
   2. Пропустите суспензию ячейки через сито 70 мкм в трубку объемом 50 мл и промывайте с помощью 10 мл PBS.
   3. Центрифуга при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C. Сбросьте супернатант и снова подвесьте финальную гранулу в оставшемся объёме. Перенесите на U-дно пластину с 96 скважинами.
3. Храните тарелки при 4 °C до появления окраски.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание проводите в тот же день, чтобы обеспечить оптимальную жизнеспособность клетки.

6. Окрашивание клеток и получение потоковой цитометрией

1. Дизайн панелей
   1. Пожалуйста, см. таблицу 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Панель в этом протоколе была разработана для спектрального потокового цитометра, оснащённого 4 лазерами (фиолетовый, синий, жёлто-зелёный и красный) и всего 51 детектором (48 флуоресцентных + 3 рассеяющих каналов). Панель должна быть спроектирована с учётом конфигурации потокового цитометра и интересующих белков/маркеров.
2. Клеточное окрашивание
   1. Центрифугуйте 96-колодные пластины с U-дном при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C. Аккуратно отбросьте супернатант. С этого этапа защищайте пластины от света.
   2. Добавьте краситель с жизнеспособностью 50 мкл (FVD, разбавление 1:5000 в PBS) в соответствующие колодцы и инкубировать 20 минут при RT. Промыть 150 мкл PBS, центрифугировать при 300 x г 5 минут при 4 °C и сбросить супернатант. Добавляйте краску жизнеспособности только к контролям жизнеспособности и образцам.
   3. Блокировать Fc-рецепторы путём инкубации клеток с 30 мкл антитела к CD16/CD32 (0,01 мкг/мл в буфере FACS: PBS с 2 мМ ЭДТА и 0,5% BSA) в течение 10 минут на льду. Промыйте буфером FACS на 170 мкл, центрифугой при 300 x г в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте супернатант.
   4. Добавьте смесь антител 30 мкл или одноцветные контролеры (подготовленные в соответствии с разбавлениями антител, указанными в таблице материалов, в буфере FACS) и инкубировать 20 минут на льду. Промыйте буфером FACS на 170 мкл, центрифугой при 300 x г в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте супернатант.
   5. Зафиксировать ячейки с 100 мкл 2% параформальдегида (PFA) в PBS на 20 минут при RT. Промыть 100 мкл PBS, центрифугировать при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C и выбросить супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для внутриклеточных маркеров замените этот этап фиксацией и проницаемостью с помощью коммерческого буферного набора, затем проведите внутриклеточное окрашивание перед окончательным восстановлением.
   6. Суспензировать конечные клеточные гранулы в 200 мкл буфера FACS. Храните пластины при 4 °C до их обнаружения на проточном цитометре.
3. Контроли с одноцветным окрашиванием и флуоресценцией минус один (FMO)
   1. Для оптимизации размешивания требуются образцы с одноцветной окрашенностью. Клетки используются для одноцветных образцов маркеров, показывающих положительные и отрицательные пики. В противном случае предпочтительно использовать компенсирующие шарики для оптимального разбивания. Подготовьте компенсационные шарики для флуоресцентно-конъюгированных антител согласно протоколу производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка FMO-контролей — важный шаг для достижения правильного гейтинга, особенно для маркеров, которые не показывают чётких положительных и отрицательных пиков. При необходимости подготовьте несколько образцов FMO для различных флуорохромов.
   2. Подготовьте образцы FMO для антигенов поверхности клеток, следуя шагам из части 6.2, но исключите интересующие антитела из смеси антител на шаге 6.2.4.
4. Получение и анализ потоковой цитометрии
   1. Включите цитометр, запустите программное обеспечение для получения проточного цитометра и подготовьте шарики контроля качества (QC) (1 капля на 300 мкл PBS) в пробирке размером 12 x 75 мм во время прогрева машины (не менее 30 минут).
   2. Очистите прибор так: 3 мин 10 % отбеливателя в В/В, 30 мин Ч₂O при высокой скорости расхода. Для следующих шагов убавьте расход обратно к минимуму.
   3. Выберите вкладку QC, загрузите трубку и проведите бусины, нажав старт. После завершения контроля качества появляется сообщение «Passed».
   4. Перейдите на вкладку приобретения, выберите или создайте эксперимент и начните приобретение, ограничивая ячейки по FSC и SSC. Получите незапятнанные и одноцветные элементы, запустите мастер размешивания и сохраните настройки. Переходите к получению окрашенных образцов.

Результаты

После внутричерепной инокуляции клеток E0771 у мышей развилось локализованное поражение рака молочной железы в целевых стереотаксических координатах. Стереотаксические координаты, направленные на стриатальную паренхиму (2,5 мм латерально, 0,5 мм перед брегмой и 3,0 мм вентрально от брегмы), были выбраны на основе стандартных атласов мозга мышей и ранее описанных методов внутричерепной^{имплантации 15,16}. Эта область широко используется для имплантации внутричерепны...

Обсуждение

Сочетая имплантацию внутричерепной опухоли с изоляцией, диссоциацией и иммунной характеристикой мозговых мозгов и обонятельной луковины, этот протокол позволяет подробно исследовать динамическое взаимодействие между микроокружением опухоли мозга и иммунными интерфейсами, ассоциированными с ЦНС. Метод обеспечивает воспроизводимое внутричерепное образование опухолей, высококачественные клеточные суспензии и устойчивое разрешение иммунных подгрупп. Однако внутричерепная имплантация обходит ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD45R/B220 antibody (clone RA3-6B2)	BioLegend	103254	used at 1:300 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD8 antibody (clone 53-6.7)	BioLegend	100730	used at 1:50 dilution
APC anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848006	used at 1:80 dilution
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	Povidone-iodine
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich	A2153	To prepare FACS Buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse Podoplanin antibody (clone 8.1.1)	BioLegend	127423	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD11b antibody (clone M1/70)	BioLegend	101263	used at 1:30 dilution
Brilliant Violet 570 anti-mouse NK1.1 antibody (clone PK136)	BioLegend	108733	used at 1:40 dilution
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5)	BioLegend	115541	used at 1:50 dilution
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD44 antibody (clone IM7)	BioLegend	103057	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 785 anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8)	BioLegend	123141	used at 1:40 dilution
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	Buprenorphine
Cell strainer 40-µm	Avantor	732-2757
Cell strainer 70-µm	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
Collagenase type II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix	Corning	356231
Cytek Aurora Spectral Flow Cytometer	Cytek Biosciences
Dnase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
Drill	Stoelting Europe	51630
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high-glucose, pyruvate	Gibco	41966029
E0771 cell line	ATCC	CRL-3436
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Merck	E4884	To prepare FACS Buffer
FCS Express Flow Cytometry Software	De Novo Software
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A5256801
FITC anti-mouse CD3 (clone 17A2)	BioLegend	100204	used at 1:50 dilution
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	Viability dye (used at 1:5000 dilution)
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Heating Pad	MOBICLINIC
Hydrogen Peroxide 34.5 to 37% (H2O2)	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	Ketamine
Lubrithal Eye Gel	Bio4	1731329
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 1M	Gibco	15630080
Paraformaldehyde (PFA) 16 %	Avantor	43368	To prepare Fixation Buffer
Pacific Blue anti-mouse Ly-6G antibody (clone 1A8)	BioLegend	127612	used at 1:50 dilution
PE anti-mouse Ly-6C antibody (clone HK1.4)	BioLegend	128008	used at 1:300 dilution
PE anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848004	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine5 anti-mouse CD11c antibody (clone N418)	BioLegend	117316	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine7 anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1)	BioLegend	104734	used at 1:100 dilution
PE-eFluor 610 anti-mouse CD31 antibody (clone 390)	eBioscience	61-0311-82	used at 1:160 dilution
PE/Fire 810 anti-mouse I-A/I-E (clone M5/114.15.2)	BioLegend	107667	used at 1:300 dilution
Penicillin-Streptomycin (PEST), 10 000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 antibody (clone 30-F11)	BioLegend	103132	used at 1:80 dilution
Phosphate-buffered saline (PBS) 10X, pH 7.4	Gibco	70011044
Prism (version 10)	GraphPad
RN Needle (27/51/3)S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870044
Scalpel Blades, carbon steel	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/mL	Bio2	1112384	Xylazine
Spark Blue 574 anti-mouse CD4 antibody (clone GK1.5)	BioLegend	100490	used at 1:50 dilution
Stereotaxic Instrument	Stoelting Europe	51730D
Suture wire Silkam black 5/0 10x45 cm	B Braun	C0266639	non-absorbable
Surgical Tool Kit (Scissors, Clam