Методическая статья

Разработка стандартизированного протокола манипуляции путем сжатия позвоночника для крысиной модели детской астмы

8 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70623

⸱

1 октября 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Acupuncture and Massage, Nanjing University of Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье представлен стандартизированный протокол манипуляции путем сжатия позвоночника (SP) на модели астмы у молодых крыс. Данный протокол снижал выраженность воспаления дыхательных путей, их гиперреактивности и ремоделирования в модели астмы, индуцированной OVA. Результаты исследования могут стать основой для изучения механизмов воздействия и последующего клинического применения.

Аннотация

Астма является наиболее распространенным хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей у детей и характеризуется хроническим воспалением дыхательных путей, гиперреактивностью дыхательных путей (ГРДП) и ремоделированием дыхательных путей. В традиционной китайской медицине (ТКМ) манипуляция «сдавливание позвоночника» (spine-pinching manipulation, SP) представляет собой широко используемую технику детского массажа для лечения астмы и других детских заболеваний. Несмотря на историю клинического применения, охватывающую более 1 000 лет, метод SP остается малоизвестным за пределами Китая. Более того, механизмы, лежащие в основе SP, остаются недостаточно изученными. В данной статье описывается осуществимый и стандартизированный протокол SP, который воспроизводит основные процедуры, используемые в клинической практике. Применение данного протокола привело к уменьшению воспаления дыхательных путей, ГРДП и ремоделирования дыхательных путей на ювенильной модели астмы у крыс. Для повышения воспроизводимости были стандартизированы ключевые параметры процедуры, включая силу нажатия пальцев, частоту манипуляций, количество повторений и продолжительность вмешательства. Стандартизированный протокол в данном исследовании может служить ориентиром для дальнейших исследований по стандартизации SP и изучению лежащих в ее основе механизмов при экспериментальной детской астме.

Введение

Детская астма характеризуется хроническим воспалением дыхательных путей, гиперреактивностью дыхательных путей (ГДП) и ремоделированием дыхательных путей1,2. Заболевание часто начинается в раннем детстве и является наиболее распространенным хроническим заболеванием среди детей школьного возраста. Современные стандартные методы лечения включают ингаляционные кортикостероиды, β₂-адренорецепторные агонисты, антагонисты лейкотриеновых рецепторов и биологическую терапию3,4. Тем не менее, в мировом масштабе адекватного контроля заболевания удается достичь лишь у 44,1% детей и 55,4% подростков с астмой5. Более того, повторное применение системных или ингаляционных кортикостероидов может способствовать задержке роста у детей с плохо контролируемой астмой6.

Массаж (известный в Китае как туйна), являясь традиционным методом наружной терапии, отличается экономической эффективностью, хорошей переносимостью и, как правило, считается безопасным для детей. Массаж давно используется как в Китае, так и в западных странах для профилактики и лечения астмы у детей7. Систематические обзоры и метаанализы сообщают о благоприятных результатах применения массажной терапии при лечении педиатрической астмы7,8. Манипуляция «защемление позвоночника» (SP) представляет собой классический и широко применяемый прием в традиционном китайском детском массаже. Согласно теории традиционной китайской медицины (ТКМ), стимуляция меридианов Ду-май (GV) и Мочевого пузыря (BL) вдоль спины модулирует функции органов Цзан-Фу, поддерживая тем самым системный гомеостаз, а также способствуя профилактике и лечению заболеваний9,10,11. Предыдущие исследования показали, что SP не только облегчает атопические симптомы и признаки у детей, но и снижает хроническое воспаление дыхательных путей в модели астмы у молодых крыс12,13,14. Помимо клинического применения, SP часто практикуется в качестве домашнего метода оздоровления11,15. Несмотря на клиническую историю длиной более тысячи лет, SP остается относительно малоизвестным за пределами Китая, а лежащие в его основе механизмы не были подробно изучены. Следовательно, стандартизированные модели на животных необходимы для выяснения механизмов действия SP и обеспечения его более широкой научной оценки и применения.

Ряд исследований позволил установить стандартизированные протоколы массажа для экспериментов на животных. В предыдущем исследовании был разработан стандартизированный протокол поглаживания спины или живота со скоростью примерно 20 cm/s и давлением 100 mm H₂O для подавления сердечно-сосудистых возбуждающих реакций16. Совсем недавно было показано, что повторяющаяся однонаправленная тактильная стимуляция позвоночника вдоль GV с использованием механического стимулятора способствует синаптическому ремоделированию в медиальной префронтальной коре на подростковых моделях мышей с аутизмом. В данном протоколе прикладывалось умеренное давление примерно 30–50 g при скорости около 15.3 cm/s, что не вызывало дискомфорта или травм. Стимуляция проводилась однонаправленно от каудальной области к затылку (затылочной области) дважды в день по 10 min в течение 21 дня17. Однако мануальное воздействие принципиально отличается от механической стимуляции, и в настоящее время не существует механического устройства, которое бы воспроизводило характерные движения SP. Кроме того, несмотря на то, что в нескольких исследованиях изучались механизмы SP на моделях крыс с астмой и другими детскими заболеваниями18, до сих пор не был разработан стандартизированный протокол, определяющий силу и скорость стимуляции, необходимые для SP в исследованиях на животных. Таким образом, разработка стандартизированного протокола SP необходима для повышения воспроизводимости и облегчения изучения механизмов воздействия.

Аллергическая астма является наиболее распространенным фенотипом астмы у детей19. Соответственно, сенсибилизация и провокация овальбумином (OVA) являются наиболее широко используемыми методами создания экспериментальной модели детской астмы20. Крысы особенно подходят для исследования вмешательств с применением массажа, поскольку их больший размер тела облегчает ручные манипуляции. Кроме того, модели на крысах надежно воспроизводят ключевые патологические признаки аллергической астмы, включая воспаление с преобладанием Th2-ответа, гиперреактивность дыхательных путей (AHR) и ремоделирование дыхательных путей21.

Предыдущие исследования показали, что SP облегчает воспаление дыхательных путей у молодых крыс после сенсибилизации и провокации OVA11,14. Следовательно, целью настоящего исследования была разработка стандартизированного протокола SP для модели детской астмы на молодых крысах, чтобы облегчить дальнейшее изучение лежащих в основе SP механизмов. Данный стандартизированный протокол обеспечивает воспроизводимую экспериментальную базу для механистических исследований и будущих трансляционных исследований SP на животных моделях детской астмы.

Протокол

Данное исследование было одобрено Комитетом по уходу и использованию животных Нанкинского университета китайской медицины (№ 202306A032). Все процедуры проводились в соответствии с руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных и рекомендациями ARRIVE 2.0.

Было использовано тридцать самцов крыс линии Sprague-Dawley (SD) в возрасте 3 недель, свободные от специфических патогенов (SPF), массой 45–55 g. Крыс содержали (по три особи в клетке) в SPF-барьерном виварии при 12-часовом цикле свет/темнота, температуре 22 ± 2 °C и относительной влажности 30%–40%, со свободным доступом к стандартному корму и воде. На основании предыдущих исследований с использованием моделей астмы у молодых крыс11,14 размер выборки был определен таким образом, чтобы минимизировать количество используемых животных в соответствии с принципом сокращения (reduction) концепции 3Rs. После 7-дневного периода акклиматизации была зафиксирована исходная масса тела, и каждой крысе был присвоен уникальный идентификационный номер. Крыс стратифицировали по исходной массе тела, а затем внутри каждой страты распределяли по одной из пяти групп с помощью таблицы случайных чисел с соотношением распределения 1:1:1:1:1 (n = 6 на группу): контрольная группа (CN), группа астмы (AS), группа астмы + SP (AS+SP), группа астмы + метилпреднизолон (AS+MP) и группа астмы + SP + метилпреднизолон (AS+SP+MP). Последовательность рандомизации и распределение по группам осуществлялись исследователем, который не принимал участия в последующих вмешательствах или оценке результатов.

Критериями включения были здоровые самцы крыс линии SD (SPF) в возрасте 3 недель, с исходной массой тела 45–55 г, нормальным типом дыхания и регулярной физической активностью. Крысы исключались из исследования при наличии признаков заболевания или отклонении массы тела на >20% от среднего значения по когорте в период акклиматизации или в случае гибели животного до завершения фазы вмешательства. На протяжении всей процедуры использовались соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, одноразовую маску и перчатки. Тушки и ткани животных помещали в двухслойные пакеты для биоопасных отходов и хранили при −20 °C перед утилизацией. Загрязненная подстилка утилизировалась как твердые биоопасные отходы, а острые предметы выбрасывались в утвержденные проколостойкие контейнеры для острых отходов. Для терминального забора тканей вводили 20%-ный уретан (5 мл/кг, в/б); глубокая анестезия подтверждалась отсутствием педального рефлекса и корнеального рефлекса.

1. Создание модели астмы у молодых крыс

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура была использована для создания модели астмы у молодых крыс12.

  1. Готовьте суспензию OVA/Al(OH)₃ непосредственно перед каждой инъекцией. Растворите 2 mg OVA Grade V непосредственно в 1 mL 4% геля Al(OH)₃ и перемешивайте на вортексе до получения однородной суспензии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед инъекцией убедитесь, что суспензия однородна. При выпадении осадка кратковременно обработайте смесь на вортексе для ресуспендирования. Храните суспензию на льду и используйте в течение 2 h после приготовления.
  2. Вводите 1 mL суспензии OVA/Al(OH)₃ внутрибрюшинно на 1, 8 и 15 экспериментальные дни. Крысам группы CN согласно тому же графику вводите 1 mL стерильного физиологического раствора (0.9% NaCl).
  3. Проводите провокацию крыс 2% раствором OVA Grade II с 21 по 42 экспериментальный день с помощью ультразвукового небулайзера. Последние две последовательные провокации проводите с использованием 3% OVA для индукции обострения после сенсибилизации.
  4. Проводите небулизацию через день по 30 min в течение 3 недель. Помещайте каждую крысу индивидуально в герметичную камеру экспозиции, подключенную к ультразвуковому небулайзеру (ультразвуковая частота: 1.7 MHz ± 10%; скорость небулизации: ≥3 mL/min; диаметр частиц: <5 µm).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите успешное создание модели астмы, наблюдая чихание, кивание головой при дыхании, дыхание с открытым ртом, сокращение мышц брюшного пресса и хрипы.

2. Эксплуатация и применение программного обеспечения системы Finger TPS

  1. Вертикально вставьте штекер датчика в интерфейс печатной платы. Подключите печатную плату к компьютеру с помощью кабеля USB-C длиной примерно 40 cm для обеспечения достаточной гибкости при работе.
  2. Продезинфицируйте руки и протекторы для пальцев. Вставьте большой и указательный пальцы правой руки оператора в наперстки с датчиками. Расположите гибкие датчики по центру подушечек пальцев и обеспечьте плотное прилегание к коже без складок.
  3. Выполните калибровку системы и контроль качества измерения силы
    1. Перед каждым сеансом обучения оператора проверяйте датчики и соединительные кабели, а также убедитесь в правильности подключения устройства.
    2. Выберите «N» в качестве единицы измерения и установите диапазон измерений от −3.5 до 32 N.
    3. Убедитесь, что на датчики не воздействует никакая внешняя сила. Выполните функцию «Tare» (Тарирование) для обнуления системы.
    4. Записывайте базовую линию без нагрузки в течение 30 s. Приступайте к измерению силы только тогда, когда колебания базовой линии остаются ниже 0.02 N.
    5. Повторяйте процедуру обнуления всякий раз при изменении положения датчика, регулировке плотности прилегания наперстков или при обнаружении дрейфа базовой линии.
    6. Используйте систему Finger TPS для мониторинга прикладываемой силы во время обучения оператора. Поддерживайте силу 5 ± 0.6 N при проведении обратного поглаживания (back stroking) и 12 ± 2 N при выполнении SP, соблюдая предписанную скорость и частоту.
    7. Принимайте кривую силы только в том случае, если базовая линия остается стабильной, отсутствуют прерывания или насыщение сигнала, а прикладываемая сила остается в пределах указанных целевых диапазонов.
  4. Выполняйте манипуляцию обратного поглаживания и SP, контролируя динамическую кривую силы. При необходимости регулируйте плотность наперстков до получения стабильной кривой силы.
  5. Отрабатывайте манипуляции, наблюдая за кривой силы в режиме реального времени. Поддерживайте целевую силу 5 ± 0.6 N и скорость примерно 5 cm/s при обратном поглаживании, а также целевую силу 12 ± 2 N при частоте 6–8 повторений/min при выполнении SP. Считайте оператора компетентным только после того, как пять последовательных тренировочных попыток будут соответствовать критериям техники манипуляции, силы нажатия пальцев и частоты SP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Считайте оператора квалифицированным только после стабильного достижения целевой силы и параметров движения. Перед проведением официальной процедуры SP снимите протекторы для пальцев, чтобы избежать дополнительной тактильной стимуляции крыс. Однако при использовании данного протокола в качестве эталона для исследования SP не следует учитывать результаты тестов на воспроизводимость между операторами, проведенных в данном исследовании.

3. Подробная процедура манипуляции по защемлению позвоночника

  1. Осторожно удерживайте крысу в положении на животе на одной ладони. Поддержите передние конечности, аккуратно обхватив передние подмышечные впадины большим и указательным пальцами, позволяя конечностям свисать естественным образом. Убедитесь, что крыса остается спокойной, а дыхание — ровным. В случае вокализации, сопротивления или дефекации отпустите крысу и дайте ей адаптироваться в течение 2–3 min перед повторным позиционированием (Рисунок 1).
  2. Дважды проведите по спине от области плеч к основанию хвоста вдоль сосуда Ду-май (GV), используя указательный, средний и безымянный пальцы правой руки. Приложите усилие примерно 5 N, чтобы успокоить крысу перед SP.
  3. Защипните кожу у основания хвоста, расположив большой палец правой руки сзади, а указательный и средний — спереди. Осторожно приподнимите кожу, затем скручивающими движениями продвигайте пальцы краниально вдоль позвоночника к точке Да-чжуй (GV14). Избегайте действий, вызывающих явные признаки дискомфорта. Поддерживайте давление пальцев примерно 12 N и выполняйте манипуляцию с частотой 6–8 повторений/min. Выполняйте 15 повторений с 1-го по 21-й день эксперимента и 25 повторений с 22-го по 44-й день.
  4. Повторите процедуру поглаживания спины, описанную в шаге 3.2, чтобы завершить сеанс терапии и успокоить крысу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно теории традиционной китайской медицины (TCM), SP выполняется вдоль позвоночника для стимуляции меридианов GV и BL (Рисунок 2). GV проходит вдоль дорсальной срединной линии от основания хвоста до точки Да-чжуй (GV14), в то время как меридиан BL расположен примерно в 3–6 mm латеральнее срединной линии, в зависимости от размера тела22. Точка Да-чжуй (GV14) находится посередине между седьмым шейным и первым грудным позвонками. Увеличивайте количество повторений SP по мере взросления животного, чтобы имитировать клинический режим лечения. При поглаживании спины следите за тем, чтобы крыса оставалась расслабленной, дышала спокойно и не проявляла защитного поведения. Во время SP ожидаются легкий изгиб спины и расправление вибрисс без стрессового мочеиспускания, дефекации, сильного сопротивления, вокализации или попыток побега.

4. Протоколы вмешательства

  1. Крыс в группе CN не подвергайте специфическому лечению заболевания. Проводите манипуляции с крысами в течение того же времени, что и в группе AS+SP, чтобы исключить влияние фактора обращения с животными. Вводите внутрибрюшинно нормальный физиологический раствор (1 mL/kg) по тому же графику, что и инъекции метилпреднизолона.
  2. Крыс в группе AS подвергните сенсибилизации и провокации OVA. Применяйте те же процедуры обращения и контрольные инъекции физиологического раствора, что и для группы CN.
  3. Крыс в группе AS+SP подвергните сенсибилизации и провокации OVA. Применяйте протокол SP один раз в день до индукции модели.
  4. Крыс в группе AS+MP подвергните сенсибилизации и провокации OVA. Вводите метилпреднизолон (10 mg/kg; 2 mg/mL, приготовленный на физиологическом растворе) путем внутрибрюшинной инъекции за 30 мин до каждой провокации OVA.
  5. Крыс в группе AS+SP+MP подвергните тем же процедурам, что и в группе AS+MP. Применяйте протокол SP один раз в день перед инъекцией метилпреднизолона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением групп AS+SP и AS+SP+MP, ко всем остальным группам применяйте одинаковые процедуры обращения для контроля неспецифических эффектов. Для всех инъекций используйте стерильные одноразовые шприцы, а иглы утилизируйте в контейнерах для острых предметов, устойчивых к проколам. Вводите иглу для внутрибрюшинной инъекции латеральнее срединной линии живота, чтобы минимизировать риск повреждения внутренних органов. Для контроля тактильной стимуляции в группах без SP поглаживайте крыс четыре раза в день во время тех же манипуляций, что и в группе SP. Используйте ту же процедуру поглаживания спины, что и для групп SP.

Результаты

Масса тела является важным показателем роста молодых крыс. До начала экспериментального лечения значимых различий в массе тела между пятью группами не наблюдалось. После индукции модели астмы в группе AS масса тела была значительно ниже, чем в группе CN (P = 0.000; Рисунок 3A). По сравнению с группой AS, в группе AS+SP наблюдалась значительно большая масса тела (P = 0.008; Рисунок 3A), тогда как в группе AS+MP значимых различий не выявлено (P = 0.975; Рисунок 3A). Аналогично, в группе AS+SP+MP не было отмечено значимого увеличения массы тела по сравнению с группой AS (P = 0.925; Рисунок 3A). Результаты свидетельствуют о том, что SP способствует увеличению массы тела при моделировании детской астмы и лечении метилпреднизолоном (MP) у молодых крыс.

После воздействия OVA у крыс группы CN не наблюдалось признаков респираторного дистресса, включая одышку, чихание, кивание головой, дыхание с открытым ртом, сокращение мышц живота или свистящее дыхание. Напротив, у крыс группы AS проявились типичные симптомы детской астмы, включая одышку, чихание, кивание головой и дыхание с открытым ртом. Эти клинические признаки заметно уменьшились после лечения с помощью SP, MP или их комбинированного применения.

Для оценки противовоспалительного действия SP у молодых крыс с экспериментальной астмой образцы тканей легких собирали после глубокой анестезии 20% уретаном (5 mL/kg, в/б) согласно ранее описанным процедурам12. Для оценки хронического воспаления дыхательных путей проводили окрашивание гематоксилином и эозином (HE) и анализ экспрессии провоспалительных генов, а для оценки ремоделирования дыхательных путей использовали окрашивание по Массону. Гиперреактивность дыхательных путей (AHR) оценивали с помощью плетизмографии всего тела (WBP), измеряя усиленную паузу (Penh).

После проведения стандартных процедур окрашивания гематоксилином и эозином (HE) и по Массону23, срезы легких окрашивали гематоксилином и эозином, а степень перибронхиолярного воспаления оценивали по модифицированной шкале от 0 до 424. В группе с моделью астмы показатели воспаления были значительно выше, чем в группе CN (P = 0.000). По сравнению с группой AS, во всех группах AS+SP, AS+MP и AS+SP+MP наблюдалось значительное снижение показателей воспаления (P = 0.005, P = 0.006 и P = 0.000 соответственно), при этом между тремя группами лечения значимых различий не выявлено (Рисунок 4A, Таблица 1).

Перестройку дыхательных путей оценивали путем количественного определения отложений коллагена вокруг бронхиол с помощью окрашивания по Массону. Отложение коллагена выражали как площадь коллаген-положительной зоны, нормированную по периметру базальной мембраны (µm2/µm). В группе AS наблюдалось значительно более выраженное отложение коллагена, чем в группе CN (P = 0.000). По сравнению с группой CN, в группах AS+SP и AS+MP отмечалось умеренно более высокое отложение коллагена (P = 0.050 и P = 0.051 соответственно), но значительно более низкое по сравнению с группой AS (P = 0.001 для обоих сравнений). В группе AS+SP+MP не было обнаружено значимых различий по сравнению с группой CN (P = 0.105), однако наблюдалось значительное снижение отложения коллагена по сравнению с группой AS (P = 0.001). Между тремя группами вмешательства значимых различий выявлено не было (Рисунок 4B, Таблица 1).

Репрезентативные кривые силы, полученные с помощью системы Finger TPS, представлены на рисунке 5. В ходе обучения оператора кривая силы, зарегистрированная при обратном движении (back stroking), оставалась стабильной на уровне примерно 5 N (рисунок 5A), тогда как кривая силы, зарегистрированная при SP, демонстрировала повторяющиеся пики силы, соответствующие манипуляции захвата, при этом приложенная сила поддерживалась в пределах заданного целевого диапазона (рисунок 5B). Эти профили силы демонстрируют стандартизированные характеристики силы, используемые при обучении оператора.

Общий график проведения эксперимента представлен на рисунке 6. После 7-дневного периода акклиматизации проводили сенсибилизацию OVA согласно установленному графику с последующими повторными провокациями OVA. SP вводили группам AS+SP и AS+SP+MP в течение назначенного периода вмешательства, а метилпреднизолон вводили перед провокацией OVA в соответствующих группах лечения. Оценку WBP и забор тканей проводили после заключительной провокации (рисунок 6).

Плетизмография всего тела широко используется для оценки Penh у бодрствующих, не зафиксированных грызунов без нанесения значительных повреждений или стресса25. Хотя Penh является косвенным показателем, на который влияют ритм дыхания и факторы окружающей среды, прямое измерение сопротивления дыхательных путей требует применения анестезии и проведения трахеостомии, что может изменить физиологию дыхательных путей26. Тем не менее, сообщалось, что Penh коррелирует с данными инвазивных измерений сопротивления легких27. Через двадцать четыре часа после последнего введения OVA крыс помещали в камеры без фиксации и последовательно подвергали воздействию аэрозоля PBS с последующим введением ацетилхолина (Ach) в концентрациях 3.125, 6.25, 12.5, 25 и 50 mg/mL. Каждое воздействие аэрозолем длилось 2 min, после чего следовал 5-минутный период записи28. В группе AS наблюдались значительно более высокие значения Penh, чем в группе CN, в то время как лечение препаратами SP, MP или их комбинированное применение значительно снижало значения Penh (P = 0.005; Рисунок 3B). Этот результат indicated, что SP улучшает функцию дыхания у крыс с астмой; данный вывод всё еще требует дальнейшего подтверждения в сочетании с прямыми измерениями сопротивления дыхательных путей (Raw).

Интерлейкин-4 (IL-4) инициирует Th2-опосредованное эозинофильное воспаление, в то время как фактор некроза опухоли-α (TNF-α) способствует гиперреактивности дыхательных путей (AHR) и ремоделированию дыхательных путей; вместе они играют центральную роль в патогенезе астмы у детей29. Для дальнейшей оценки воспаления дыхательных путей уровни экспрессии IL-4 и TNF-α в тканях легких были количественно определены с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR). По сравнению с группой CN, в группе AS наблюдалось значительное повышение экспрессии IL-4 и TNF-α (P = 0.000 и P = 0.000 соответственно; Рисунок 3C,D). Экспрессия обоих цитокинов была значительно снижена после лечения SP или MP, при этом сочетание SP и MP обеспечило наибольшее снижение (P = 0.001 и P = 0.000 соответственно; Рисунок 3C,D).

figure-results-1
Рисунок 1: Подробная процедура манипуляции по защемлению кожи вдоль позвоночника (SP) у крыс. (A) Удерживайте крысу в положении на животе на ладони оператора. (B) Защемите кожу у основания хвоста. (C) Приподнимите защемленную кожу. (D) Поворачивайте и продвигайте пальцы краниально вдоль позвоночника в направлении точки Dazhui (GV14). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Схематическое изображение сосуда Ду-май (GV), меридиана мочевого пузыря (BL) и точки Да-чжуй (GV14) у крыс. На диаграмме показано анатомическое расположение GV, меридиана BL и точки Да-чжуй (GV14), которые являются целевыми участками для манипуляции путем сжатия позвоночника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Влияние манипуляции с защемлением остистых отростков позвонков на массу тела, гиперреактивность дыхательных путей и факторы воспаления легких у молодых крыс. (A) Сравнение массы тела между экспериментальными группами. (B) Сравнение значений усиленного пауза-индекса (Penh). (C) Относительная экспрессия гена интерлейкина-4 (IL-4) в ткани легких. (D) Относительная экспрессия гена фактора некроза опухоли-α (TNF-α) в ткани легких. Данные представлены как среднее значение ± SD. *P < 0.05 и **P < 0.01 по сравнению с группой CN; #P < 0.05 и ##P < 0.01 по сравнению с группой AS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Репрезентативные гистопатологические изменения в ткани легкого. (A) Окрашивание гематоксилином и эозином (HE), демонстрирующее перибронхиолярное воспаление. (B) Окрашивание по методу Массона, демонстрирующее отложение коллагена и ремоделирование дыхательных путей. Изображения получены при 200× увеличении. Масштабные отрезки = 100 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Репрезентативные кривые силы, зарегистрированные во время манипуляции по защемлению позвоночника с использованием системы Finger TPS. (A) Кривая силы, зарегистрированная во время манипуляции по поглаживанию спины. (B) Кривая силы, зарегистрированная во время манипуляции по защемлению позвоночника (SP). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: График хода эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ГруппаОценка воспаления при окрашивании гематоксилином и эозиномПлощадь коллагена/периметр базальной мембраны (μm²/μm)
ЦН1.10 ± 0.252.50 ± 0.43
АС2.32 ± 0.50**4.23 ± 0.53**
АС+СП1.66 ± 0.27##3.12 ± 0.56*##
AS+MP1.67 ± 0.31##3.12 ± 0.50*##
АС+СП+МП1.34 ± 0.27##3.01 ± 0.33##

Таблица 1: Показатели гистопатологии легких. Перибронхиолярное воспаление оценивали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (HE), а ремоделирование дыхательных путей количественно определяли как площадь коллаген-положительного участка, нормализованную по периметру базальной мембраны (µm2/µm). Данные представлены как среднее ± SD (n = 5 в группе). *P < 0.05 и **P < 0.01 по сравнению с группой CN; #P < 0.05 и ##P < 0.01 по сравнению с группой AS.

Обсуждение

Сенсибилизация и провокация овальбумином (OVA) являются одной из наиболее широко используемых экспериментальных моделей для изучения астмы у детей30,31. Настоящее исследование показало, что стандартизированный протокол манипуляции путем защемления остистых отростков позвонков (SP) уменьшает хроническое воспаление дыхательных путей, гиперреактивность дыхательных путей (AHR) и ремоделирование дыхательных путей. Предыдущие клинические исследования показали, что традиционный детский массаж, включая SP, улучшает течение астмы и других аллергических заболеваний у детей11,13,32. Кроме того, предыдущие исследования на животных продемонстрировали, что SP ослабляет воспаление дыхательных путей в моделях астмы у молодых крыс путем модуляции микробиоты кишечника12,15. В данном исследовании было дополнительно показано, что применение стандартизированного протокола SP улучшает показатели хронического воспаления дыхательных путей, AHR и ремоделирования дыхательных путей в модели астмы у молодых крыс. Более того, SP усиливал терапевтический эффект метилпреднизолона (MP), одновременно снижая его побочные эффекты, связанные с задержкой роста.

Метод SP практикуется в Китае более 1000 лет и остается одной из наиболее широко используемых техник педиатрического массажа для профилактики и лечения астмы и других детских заболеваний12,15,33,34,35. Несмотря на длительную историю клинического применения, метод SP остается относительно малоизвестным за пределами Китая. Согласно теории традиционной китайской медицины, меридианы GV и BL проходят вдоль или рядом с позвоночником и связаны с внутренними органами. Следовательно, считается, что стимуляция меридианов GV и BL регулирует функции внутренних органов, модулирует иммунную активность и повышает сопротивляемость организма заболеваниям. SP заключается в защемлении, приподнимании, скручивании и продвижении кожи вдоль позвоночника, что стимулирует как меридиан GV, так и меридиан BL. Эта манипуляция одновременно оказывает сжимающее и растягивающее воздействие на кожу и подлежащую фасцию, создавая умеренную механическую стимуляцию. В клинической практике до и после SP рутинно выполняется мягкое поглаживание спины для снижения интенсивности стимуляции и повышения комфорта пациента. Поглаживание спины представляет собой мягкие движения вниз по спине и широко применяется в педиатрическом массаже. Таким образом, основываясь на принципах клинической значимости, осуществимости, простоты и воспроизводимости, стандартизированный протокол включает в себя как SP, так и манипуляцию по поглаживанию спины.

Предыдущие исследования показали, что SP снижает воспаление как в легких, так и в гиппокампе посредством иммуномодулирующих механизмов12,36. Детская астма характеризуется воспалением с преобладанием Th2-ответа, тесно связанным с иммунной дисрегуляцией37. В предыдущих экспериментальных исследованиях сообщалось, что поглаживания рукой или щеткой регулировали иммунные ответы у мышей при приложении давления 100–150 mmH₂O (7–11 mmHg) и скорости примерно 3 cm/s38. Кроме того, в клиническом исследовании было отмечено, что поглаживания со скоростью примерно 1–10 cm/s воспринимались как более приятные39. На основании этих данных в стандартизированном протоколе была принята сила поглаживания спины 5 ± 0.6 N и скорость 5 cm/s для достижения соответствующего успокаивающего эффекта. Давление, частота и количество повторений SP были определены на основе предыдущих исследований12,15 и соответствующих работ других исследовательских групп40,41. Хотя в предыдущих исследованиях для достижения сердечно-сосудистого торможения или стимуляции синаптического ремоделирования у грызунов стандартизировали либо ручное поглаживание спины (20 cm/s; примерно 100 mmH₂O), либо механическую стимуляцию GV (30–50 g; примерно 15.3 cm/s), ручное SP представляет собой отдельное биомеханическое воздействие, которое опирается на тактильную и проприоцептивную обратную связь и, следовательно, не может быть полностью воспроизведено существующими механическими устройствами. Это различие подчеркивает важность стандартизированных протоколов для специалистов в будущих трансляционных исследованиях тактильных методов лечения аллергической астмы.

Многочисленные исследования, опубликованные на китайском языке, продемонстрировали, что SP модулирует иммунную функцию и подавляет воспаление42,43,44. Однако, насколько известно на данный момент, ни в одном предыдущем исследовании, за исключением работ исследовательской группы авторов, не были стандартизированы давление и скорость SP для изучения конкретного заболевания на моделях детской астмы у животных. В предыдущих работах изучались механизмы действия SP на моделях астмы у молодых крыс, включая модуляцию микробиоты кишечника, увеличение выработки короткоцепочечных жирных кислот, улучшение функции дыхательных мышц (например, силы диафрагмы), а также ослабление воспаления дыхательных путей и легочной дисфункции11. Настоящее исследование было сосредоточено прежде всего на разработке стандартизированного протокола, а не на всестороннем выяснении лежащих в основе механизмов действия. Для стандартизации силы нажатия при поглаживании спины и SP использовалась высокоточная система измерения и записи тактильного давления, в то время как скорость и частота манипуляций были стандартизированы в соответствии с предыдущими исследованиями. Крысы были выбраны потому, что размер их тела облегчает стабильный захват и ручное применение SP, максимально приближая процедуру к клинической. Поглаживание спины выполнялось пальцами одной руки, как в педиатрической клинической практике. Из-за меньшего размера тела крыс SP выполнялось тремя пальцами одной руки, а не обеими, при сохранении основных биомеханических характеристик клинической техники. Эта модификация точно воспроизводит стимуляцию меридианов GV и BL на модели крысы. Поскольку параметры измерения могут различаться в разных системах измерения тактильного давления, стандартизация ручных манипуляций на основе поведенческих реакций крыс во время поглаживания спины и SP может обеспечить более высокую воспроизводимость, чем опора исключительно на измерения силы конкретным прибором. Предыдущие исследования также показали, что поглаживание спины оказывает антидепрессивный эффект у молодых крыс с CUMS-индуцированным стрессом9, хотя SP приводило к значительно более выраженным терапевтическим эффектам. Следовательно, положительные эффекты, наблюдаемые в настоящем исследовании, могут частично отражать вклад манипуляций по поглаживанию спины в дополнение к основным эффектам SP.

Необходимо признать ряд ограничений. Во-первых, размер выборки был относительно небольшим, что может ограничивать надежность и обобщаемость полученных результатов. Во-вторых, настоящее исследование было в первую очередь сосредоточено на разработке и валидации стандартизированного протокола SP; следовательно, в нем изучался лишь ограниченный набор механистических исходов, а не проводилось всестороннее описание лежащих в основе биологических механизмов. Соответственно, механистическая валидация, включая подсчет воспалительных клеток в БАЛЖ, уровни OVA-специфического IgE, профилирование Th2-цитокинов (например, IL-5, IL-13) и анализ путей внутриклеточной сигнализации, не проводилась. Данный результат показал, что SP улучшает функцию дыхания у крыс с астмой; этот вывод все еще требует дальнейшего подтверждения в сочетании с прямыми измерениями сопротивления дыхательных путей (Raw). В-третьих, все манипуляции выполнялись одним обученным оператором, и воспроизводимость результатов между разными обученными операторами не оценивалась. Наконец, в исследование не была включена группа вмешательства только с поглаживанием спины, чтобы разграничить независимые эффекты поглаживания спины и эффекты SP. Будущие исследования должны включать более крупные выборки, оценивать воспроизводимость между операторами, предусматривать дополнительные контрольные группы и более детально изучать молекулярные механизмы, лежащие в основе терапевтических эффектов SP.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. В процессе подготовки данной рукописи инструменты искусственного интеллекта не использовались. Авторы несут полную ответственность за полноту и точность окончательного текста рукописи.

Благодарности

Данная работа была поддержана Национальным природным научным фондом Китая (руководитель проекта Xiong Ying, №81973970, на базе Нанкинского университета китайской медицины). Авторы благодарят Институт педиатрии, Ключевую лабораторию здоровья детей и китайской медицины провинции Цзянсу, а также Ключевую лабораторию исследований иглоукалывания и медицины Министерства образования за предоставление помещений, инструментов и оборудования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4% Al(OH)3 гельShanxi ZHHC Biomedical Technology Co., LTD, ChinaBS010Н/Д
Ach (ацетилхолин)Sigma, USAA2251Н/Д
Адгезионные предметные стеклаCitotest, Jiangsu, ChinaREF.188105
P/N.80312-3161		Н/Д
Пакеты для биоопасных отходовNanjing Xinyuan plastic Co., Ltd.HJ421-2008Н/Д
Аппарат для сушки биологических тканейKedee, Zhejiang, ChinaKD-HIIН/Д
Аппарат для заливки биологических тканейKedee, Zhejiang, ChinaKD-BMН/Д
Микротом для срезов биологических тканейKedee, Zhejiang, ChinaKD-PIН/Д
Buxco Research SystemsDSI Buxco,Wilmington, NC,USAPFTН/Д
Регулируемый миксер (MX-S)DLAB, Beijing, China8031102000Н/Д
Центрифуга для микропланшетовScilogex, USASCI-CF2800M E050S11B000798Н/Д
Ламинарный шкаф Sanfa, Shanghai, ChinaSF-CJ-1AН/Д
Обычная центрифугаDLAB, Beijing, ChinaD100BE: 9031001011Н/Д
Одноразовые стерильные перчаткиShanghai Kebang Medical Latex Equipment Co., Ltd.22010739https://www.sh-kebang.com/products_detail/6.html
Электронные весыJinghai, ShanghaiYP3001NН/Д
Электронные весыJinghai,  Shanghai, ChinaYP3001NН/Д
Система Finger TPSPressure Profile System, Inc, USAПрименимая версия ПО: Chameleon 2018https://pressureprofile.com/body-pressure-mapping/finger-tps
 Флуоресцентный оптический микроскопOlympus, Tokyo, JapanDP70Н/Д
Паровой стерилизатор высокого давленияTomy, JapanSX-500Н/Д
Высокоскоростная охлаждающая центрифугаEppendorf5418RН/Д
Набор для трихромного окрашивания по МассонуSolarbio, Shanghai, ChinaG1340Н/Д
Микропипетки и стерильные наконечникиeppendorfJ48931Lhttps://www.eppendorf.com/hk-en/Products/Liquid-Handling/All-Pipettes-Dispensers-Automated-Liquid-Handlers/Eppendorf-Reference2-p-PF-222171
МикротомыLeica, GermanRM2145Н/Д
MP (метилпреднизолона натрия сукцинат)Shyndec, Shanghai, ChinaH20070007Н/Д
Спектрофотометр NanoDrop LiteThermo Fisher Scientific, USAnd-ndl-pr-2yrw-cccН/Д
 Контроллер небулизацииEmka, FranceVENT4:14554Н/Д
Непрозрачные запечатанные конвертыNanjing Kongdu printing Co., Ltd201701Н/Д
OVA (Grade II)Sigma, USAA5253Н/Д
OVA (Grade V)Sigma, USAA5503Н/Д
Набор для ПЦРYeasen, Shanghai, China11201ES08Н/Д
Проколостойкий контейнер для острых предметовNanjing Xinyuan plastic Co., Ltd.KMT-15YН/Д
Набор для обратной транскрипцииBio.vazyme, Nanjing, ChinaR323Н/Д
Малые центрифугиHettich, GermanMIKRO 220R D-78532Н/Д
Стерильные сухие ватные тампоныZHENDE, Zhejiang, China202203121Bhttps://www.zhende.com/index.php?g=product&m=index&a=info&id=13
TrizolBio.vazyme, Nanjing, ChinaR771Н/Д
Морозильник для сверхнизкого храненияThermo Fisher Scientific, USA950GP-ULTSН/Д
Ультразвуковой небулайзерJiangsu Yuwell Medical Instruments Co., Ltd., China402AIН/Д
Система ПЦР в реальном времени ViiATM7Life TechnologiesTM , Singapore278882021Н/Д
Плетизмограф всего телаScrieq, Canada1185162,1184031,1185898FV-FXM1-01, экспираторный картридж FX1: FV-FXM1 ET, инспираторный картридж FX1: FV-FXM1-IA

Ссылки

  1. Bateman ED, et al. Global strategy for asthma management and prevention: GINA executive summary. Eur Respir J. 2008;31(1):143-178.
  2. Lizano-Barrantes C, et al. Impact of treatment adherence and inhalation technique on asthma outcomes of pediatric patients: A longitudinal study. Front Pharmacol. 2024;15:1340255.
  3. Vähätalo I, et al. Long-term adherence to inhaled corticosteroids and asthma control in adult-onset asthma. ERJ Open Res. 2021;7(1).
  4. Yılmaz İ, et al. Biological therapy management from the initial selection of biologics to switching between biologics in severe asthma. Tuberk Toraks. 2023;71(1):75-93.
  5. García-Marcos L, et al. Asthma management and control in children, adolescents, and adults in 25 countries: A Global Asthma Network phase I cross-sectional study. Lancet Glob Health. 2023;11(2):e218-e228.
  6. Kelly HW, et al. Effect of inhaled glucocorticoids in childhood on adult height. N Engl J Med. 2012;367(10):904-912.
  7. Wu J, Yang XW, Zhang M. Massage therapy in children with asthma: A systematic review and meta-analysis. Evid Based Complement Alternat Med. 2017:5620568.
  8. Yue QJ, et al. Effect of pediatric massage in the treatment of chronic persistent asthma in children: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. J Hainan Med Univ. 2019;25:1260-1266.
  9. Wu R, et al. Traditional pediatric massage enhanced hippocampal GR, BDNF, and IGF-1 expressions and exerted an antidepressant effect in an adolescent rat model of CUMS-induced depression. Neuroscience. 2024;542:47-58.
  10. Lin L, Yu L, Zhang S, Liu J. The positive effect of mother-performed infant massage on infantile eczema and maternal mental state: A randomized controlled trial. Front Public Health. 2022;10:1068043.
  11. Lin L, et al. Traditional pediatric massage enhanced skeletal muscle mass in OVA-exposed adolescent rats via regulating the SCFAs-FFAR2-IGF-1/AKT pathway. Front Microbiol. 2024;15:1492783.
  12. Xiong Y, Noraas AU, Yang X. The effect of chiropractic manipulation on atopic symptoms and gut microbiota in children with atopy. J Li Shizhen Tradit Chin Med. 2017;28:2440-2442.
  13. Liu Y, Gu Y, Xiong Y. Wrist-ankle acupuncture combined with spine-pinching manipulation for allergic rhinitis in children: A randomized controlled trial. World J Acupunct Moxibustion. 2019;29:259-263.
  14. Zhu Y, et al. Chiropractic therapy modulated gut microbiota and attenuated allergic airway inflammation in an immature rat model. Med Sci Monit. 2020;26:e926039.
  15. Lu W, Fang M, Yang X. Observation on the influence of parent-child massage on children's psychological and behavioral problems. Chin Med Mod Distance Educ China. 2025;23(4):75-78.
  16. Lund I, Lundeberg T, Kurosawa M, Uvnäs-Moberg K. Sensory stimulation (massage) reduces blood pressure in unanesthetized rats. J Auton Nerv Syst. 1999;78(1):30-37.
  17. Chen YN, et al. Repetitive unidirectional spinal tactile stimulation engages microglial BMAL1 pathways to promote synaptic remodeling in the medial prefrontal cortex of adolescent VPA-exposed mice. J Neuroinflammation. 2025;23(1):23.
  18. Gorrell LM, et al. Spinal manipulation characteristics: A scoping literature review of force-time characteristics. Chiropr Man Therap. 2023;31(1):36.
  19. Papadopoulos NG, Miligkos M, Xepapadaki P. A current perspective of allergic asthma: From mechanisms to management. Handb Exp Pharmacol. 2022;268:69-93.
  20. Nials AT, Uddin S. Mouse models of allergic asthma: Acute and chronic allergen challenge. Dis Model Mech. 2008;1(4-5):213-220.
  21. Martin JG, Tamaoka M. Rat models of asthma and chronic obstructive lung disease. Pulm Pharmacol Ther. 2006;19(6):377-385.
  22. QDV, et al. Construction of an acupoint atlas for experimental rats. Acupunct Res. 2025;50(11):1339-1351.
  23. Dong L, et al. Hypoxic hUCMSC-derived extracellular vesicles attenuate allergic airway inflammation and airway remodeling in chronic asthma mice. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):4.
  24. Muhamad SA, et al. Intranasal administration of Lignosus rhinocerotis (Cooke) Ryvarden (Tiger Milk Mushroom) extract attenuates airway inflammation in a murine model of allergic asthma. Exp Ther Med. 2019;17(5):3867-3876.
  25. Vaickus LJ, Bouchard J, Kim J, Natarajan S. Assessing pulmonary pathology by detailed examination of respiratory function. Am J Pathol. 2010;177(4):1861-1869.
  26. Glaab T, Taube C, Braun A, Mitzner W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respir Res. 2007;8(1):63.
  27. Lomask M. Further exploration of the Penh parameter. Exp Toxicol Pathol. 2006;57(Suppl 2):13-20.
  28. Leung SY, et al. Effect of transforming growth factor-beta receptor I kinase inhibitor 2,4-disubstituted pteridine (SD-208) in chronic allergic airway inflammation and remodeling. J Pharmacol Exp Ther. 2006;319(2):586-594.
  29. Ogulur I, et al. Type 2 immunity in allergic diseases. Cell Mol Immunol. 2025;22(3):211-242.
  30. Lee JH, Son SH, Kim NJ, Im DS. NJK14047 suppression of the p38 MAPK pathway ameliorates OVA-induced allergic asthma during sensitization and challenge periods. Biomol Ther (Seoul). 2023;31(2):183-192.
  31. Li J, et al. Establishment of a juvenile mouse asthma model induced by postnatal hyperoxia exposure combined with early OVA sensitization. Heliyon. 2024;10(1):e23291.
  32. Wei J, Yang X. Efficacy of pediatric tuina on spleen deficiency syndrome and allergic constitution in children with bronchial asthma during the remission period: A study of 29 cases. J Pediatr Tradit Chin Med. 2023;19(3):86-89.
  33. Gao J, He J. Fifty-eight cases of allergic rhinitis treated with spine-pinching manipulation and acupuncture in Switzerland. World J Acupunct Moxibustion. 2010;20(3).
  34. Hu Y, et al. Clinical study of Yupingfeng Powder combined with spine-pinching manipulation for cough variant asthma in children. Heilongjiang J Tradit Chin Med. 2024;53(2):369-371.
  35. Yao D, Zhang Y, Deng L. Effect of spine-pinching manipulation on asthma control in children. Heilongjiang J Tradit Chin Med. 2020;49(2):157-158.
  36. Zhang X, et al. Traditional pediatric massage exerted an antidepressant effect and activated the IGF-1/NRF2 pathway in CUMS-exposed adolescent rats. J Neuroimmunol. 2025;400:578554.
  37. Lan J, McCray A, Brown E, Eddens T. Early-life viral infections and asthma: New cells and ideas. Curr Opin Pediatr. 2025;37(6):597-605.
  38. Major B, et al. Massage-like stroking boosts the immune system in mice. Sci Rep. 2015;5:10913.
  39. Ackerley R, Carlsson I, Wester H, Olausson H, Backlund Wasling H. Touch perceptions across skin sites: Differences between sensitivity, direction discrimination, and pleasantness. Front Behav Neurosci. 2014;8:54.
  40. Li Q, et al. Experimental study on the effects of different durations of spine-pinching manipulation on immune function in rats with Wei Qi deficiency. Jiangsu J Tradit Chin Med. 2017;49(9):75-77.
  41. Tang Q, Shen L, Lin L. Effects of spine-pinching manipulation with different stimulation intensities on hippocampal inflammation-related factors and behavioral disorders in autistic rats. J Hunan Univ Chin Med. 2025;45(7):1264-1270.
  42. Li Z, et al. Effects of spine-pinching therapy on thoracic duct lymph flow and mesenteric lymphatic microcirculation in rats with spleen deficiency. China J Tradit Chin Med Pharm. 2025;40(8):4246-4250.
  43. Ma W, et al. Effects of spine-pinching intervention on anorexia in young rats based on the 2-AG/CB1/AMPK1 pathway. Shaanxi J Tradit Chin Med. 2025;46(2):159-164.
  44. Tang Q, et al. Effects of spine-pinching manipulation on BDNF and CREB protein expression in different brain regions of rats with autism spectrum disorder. J Hunan Univ Chin Med. 2025;45(2):259-266.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модель астмы у крысвоспаление дыхательных путейгиперреактивность дыхательных путейремоделирование дыхательных путейдетский массажтрадиционная китайская медицинастандартизация протоколаэкспериментальная астма

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.