Создание внеклеточных матриксных субстратов полиакриламида и силикона с определённой жесткостью для применения в клеточной биологии

Краткое содержание

Хотя жёсткость внеклеточного матрикса (ECM) является ключевым регулятором клеточного поведения, основные механизмы восприятия и трансдукции остаются неясными. Для решения этой задачи мы предлагаем протоколы создания субстратов на основе полиакриламида и силикона с регулируемой жёсткостью, чтобы углубить наше понимание перекрёстных помех между клетками и ЭКМ.

Аннотация

Внеклеточная матрица (ECM) является критически важным регулятором поведения клеток, при этом жёсткость ECM служит ключевым механическим сигналом, регулирующим клеточную сигнализацию, морфологию и судьбу. Однако экспериментальные исследования клеточных ответов, зависящих от жёсткости, часто ограничены наличием воспроизводимых, экономичных и доступных платформ культур с точно настраиваемыми механическими свойствами. Этот протокол описывает методы на основе полиакриламида (PA) и силикона для изготовления подложок ЭБУ с регулируемой жесткостью. Процедуры включают подготовку субстрата, функционализацию поверхности и конъюгирование белков ECM для обеспечения равномерной адгезии клеток в физиологически релевантном диапазоне жесткости. Субстраты на базе ПА совместимы с биохимическими анализами последующих процессов, включая экстракцию белков и РНК, а также с высокоразрешающей флуоресцентной визуализацией. Субстраты на основе силикона оптимизированы для микроскопии с полным внутренним отражением флуоресценции (TIRF), что позволяет визуализировать взаимодействие клетки и ЭКМ на базальной мембране. Кроме того, мягкие субстраты могут быть адаптированы для поддержки сфероидных культур, расположенных в единой плоскости визуализации, что способствует равномерному получению изображения. Эти методы предоставляют надёжные, экономичные и воспроизводимые платформы для систематического изучения того, как жёсткость ЭКМ регулирует клеточные процессы, расширяя механистическое понимание перекрёстного взаимодействия между клетками и ЭКМ как в физиологическом, так и в болезненом контекстах.

Введение

Внеклеточный матрица (ЭКМ) — это фундаментальный структурный и биохимический каркас, который определяет механические свойства тканей и поддерживает их биологические функции. Например, эластичные ткани, такие как лёгкие и артерии, обогащаются коллагеновой и эластиновой ЭБМ, которая обеспечивает механическую устойчивость, необходимую для повторяющихся циклов растяжения и отдачи во время дыхания. В отличие от этого, центральная нервная система содержит ЭКМ, богатый гликозаминогликанами, который создает высокоподатливую атмосферу, оптимизированную для дифференцировки нейронов и передачи^{сигналов 1}. В различных тканях тела жёсткость тканей составляет несколько порядков — от сотен паскалей в мягких тканях, таких как мозг и лёгкие, до мегапаскаля и гигапаскаля уровней жёсткости сухожилий и костей^{соответственно 2,3}. Эти механические различия не только структурные, но и играют критическую роль в регулировании поведения^{клеток 4,5}. Например, мезенхимальные стволовые клетки проходят специфическую линейность, зависящую от жёсткости, принимая нейронные судьбы на мягких субстратах, миогенные судьбы на промежуточных субстратах и остеогенные судьбы на жёстких^{субстратах 6}. Патологические изменения жёсткости ЭКМ также могут вызывать аномальные клеточные ответы и способствовать инициации и прогрессированию заболевания ^7,8,9. Аналогично, изменения свойств ЭКМ вокруг клеток также изменяют функцию органелл и различные клеточные поведения^10,11. Несмотря на признанную важность ЭКМ в руководстве сигналами, функционированием органелл и патогенезом заболеваний, механизмы, которыми клетки воспринимают и превращают сигналы ЭКМ в биохимические сигналы, остаются неполностью изучены.

Прогресс в понимании перекрёстного взаимодействия между клетками и ЭБУ частично затрудняется ограниченным доступом экспериментальных платформ, которые обеспечивают точный контроль над свойствами ЭБМ, оставаясь при этом полностью совместимыми со стандартными биохимическими анализами и рабочими процессами визуализации. Кроме того, изучение взаимодействий клеток и ЭКМ часто воспринимается как технически сложное, поскольку требует междисциплинарных знаний, охватывающих материаловедение, клеточную биологию и биоинженерию. Этот метод направлен на решение этих задач путём предоставления пошаговых протоколов для создания РЭБ на основе ПА и силикона с определёнными механическими свойствами, которые можно легко подготовить в большинстве лабораторных условий.

Гидрогели PA с регулируемой жёсткостью являются основой механобиологии; однако их полезность часто ограничивается высокой стоимостью реагентов для конъюгации ЭБМ, непоследовательной функционализацией поверхности и низкой совместимостью с крупномасштабными биохимическими рабочими процессами. Кроме того, практические и стандартизированные подходы к сбору образцов и визуализации субстратов с разной жесткостью не зарекомендованы должным образом. Эти узкие места можно решить с помощью описанной нашей платформы PA-геля, которая характеризуется четырьмя ключевыми инновациями: (i) значительное снижение затрат, (ii) воспроизводимая функционализационная химия, (iii) масштабируемое производство за счёт многоразового оборудования и (iv) бесшовная интеграция со многими традиционными клеточными биологическими и биохимическими анализами. Этот подход использует разные соотношения акриламида и бисакриламида для получения гидрогелей с различными механическими свойствами (Таблица 1). Гели PA инертны и не могут напрямую конъюгировать с белками ECM. Поэтому реакция полимеризации свободных радикалов, инициируемая УФ-излучением, используется для конъюгации тонкой перекрёстной сети ди(триметилолпропана) тетраакрилата, акриловой кислоты N-гидроксисукцинимида эфира (NHS-акрилат) и бисакриламида, на поверхность ПА-гелей (рисунок 1). Эта сеть создаёт двухдейственную адгезивную поверхность для белков ECM: NHS-акрилат обеспечивает стабильное ковалентное закрепление для белков ECM, а тетраакрилат способствует равномерной адсорбции белков^{ECM 12}. Кроме того, мы предлагаем методы, демонстрирующие сбор белков и нуклеиновых кислот, таких как РНК, из этих субстратов способом, совместимым с дальнейшими анализами клеточной биологии, такими как вестерн-блоттинг и обратная транскрипционно-количественная полимеразная цепная реакция (RT-qPCR). Кроме того, полученные соответствующие PA-субстраты также поддерживают формирование сфероидов и их позиционирование в единой фокальной плоскости, что позволяет систематически анализировать поведение 3D-клеток¹³.

В отличие от этого, оптические ограничения PA гидрогелей ограничивают их использование в продвинутых методах визуализации, особенно в микроскопии с полным внутренним отражением (TIRF)¹⁴. Чтобы решить это ограничение, мы разработали механически настраиваемые кремниевые субстраты на основе ЭБМ, оптимизированные для TIRF-визуализации. Эти материалы обладают показателем преломления, близко совпадающим со стеклом, при этом сохраняя регулируемую жесткость в широком диапазоне (рисунок 2A). Тонкий слой силиконового геля с разным соотношением деталей наносится спин-покрытием на крышное стекло перед конъюгацией ECM (см. рисунок 2B и таблица 2). Однако врождённая гидрофобность и химическая инертность силикона исключают прямую конъюгировку ЭБМ. Поэтому мы реализуем стратегию модификации поверхности, чтобы обеспечить ковалентное прикрепление лигандов ECM. Обработка кислородной плазмой вводит гидроксильные группы на поверхность силикона (рисунок 2C). Впоследствии (3-аминопропил)триэтоксисилан (APTES) превращает эти гидроксильные группы в реактивные амины. 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид (EDC), карбодиимид-сшиватель нулевой длины, затем способствует образованию ковалентных амидных связей между аминогруппами на поверхности геля и карбоксильными группами на белках ECM.

В совокупности эти платформы ECM обеспечивают экономичные, воспроизводимые и масштабируемые системы для исследования механизмов сигнализации, зависящих от жесткости ECM. Их гибкость позволяет бесшовно интегрировать биохимические анализы, высококачественную визуализацию и высокопроизводительные рабочие процессы, что позволяет исследовать, как жёсткость РЭБ влияет на поведение клеток и способствует прогрессированию заболеваний.

Протокол

1. Генерация гидрогелей ЭБ на базе ПА

1. Функционализация стеклянных поверхностей для крепления геля PA
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Тщательно промывайте качественной водой между этапами.
   1. Очистите стеклянные поверхности 10% отбеливателем в течение 3 часов в химически устойчивой посуде (например, полистирол). Используйте достаточный объём, чтобы полностью покрыть стекло и убедитесь, что нет застрявших пузырьков или сухих участков.
      ВНИМАНИЕ: Отбеливатель — это очень коррозийное и реактивное химическое вещество. Следуйте инструкциям производителя по безопасности.
   2. Инкубировать покрытие в 0,2 млн соляной кислоты (HCl) в течение 16 часов с мягким перемешиванием на шейкере.
      ВНИМАНИЕ: HCl очень коррозийна и может вызывать ожоги кожи. Носите соответствующую индивидуальносную защиту.
   3. Добавьте 0,1 млн NaOH и инкубуйте 1 час.
      ВНИМАНИЕ: растворы NaOH коррозийны и могут вызывать ожоги кожи. Носите соответствующую индивидуальносную защиту.
   4. Инкубировать покрытия в 0,5% APTES в высококачественной воде в течение 30 минут.
      ВНИМАНИЕ: Аптес токсичен. Работайте с APTES в вытяжной жидкости с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
   5. Промывайте крышки большим объёмом воды, чтобы удалить остатки APTES.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неполное промывка вызовет реакцию между APTES и глутаральдегидом на следующем этапе и приведёт к образованию белых осадков, которые нарушают активацию поверхности стекла.
   6. Инкубировать покрытия с 0,5% глутаральдегидом в PBS в течение 1 часа.
      ВНИМАНИЕ: Глутаральдегид токсичен. Работайте с глутаральдегидом в вытяжке с подходящими СИЗ.
   7. Сушите накладки на впитывающий материал (например, бумажные полотенца) на ночь. Храните покрытия в чистой, герметичной ёмкости до использования.
2. Подготовка раствора гидрогеля PA и гель-литье
   ПРИМЕЧАНИЕ: Формулы, необходимые для получения гидрогелей с указанным модулем упругости, приведены в Таблице 1. Рекомендуемые объёмы геля и размеры стекла для различных экспериментальных применений приведены в Таблице 3.
   1. Смешать компоненты гидрогеля PA в микроцентрифугной трубке объемом 1,7 мл, исключая персульфат аммония (APS) и тетраметилэтилендиамин (TEMED).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не готовьте большие объёмы, так как гели с более высокой жесткостью быстро полимеризуются и могут затвердеть до завершения литья.
   2. Дегазируйте смесь геля PA, APS и трубки TEMED в вакуумной камере при напряжении 25 мм рт. ст. в течение 30 минут.
   3. Подготовьте гидрофобные верхние покрытия, нанеся водоотталкивающее покрытие для очистки склейок ватным палочком. Убедитесь, что покрытия не имеют пятен для поддержания стабильной полимеризации геля.
   4. Добавьте APS и TEMED в дегазированный раствор, затем аккуратно пипетировать смесь на активированные накладки.
   5. Положите гидрофобные накладки поверх раствора, чтобы создать равномерный тонкий слой гидрогеля. Дайте гелям полимеризироваться 35 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что между накладками не застрядают пузырьки и раствор не выльется за края.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте рекомендуемые объёмы для гелевой отливки, чтобы обеспечить правильную толщину; Чрезмерно тонкие гели позволяют клеткам ощущать подлежащее^{стекло 15}. Перед разборкой гелевого сэндвича проверьте остаточную смесь в трубке микроцентрифуга, чтобы подтвердить наличие полимеризации.
   6. Погрузите гидрогель-сэндвич в PBS, чтобы разделить слои. Убедитесь, что гидрогель остаётся прикреплённым к активированному нижнему покровному скольжению, и гидрофобный верхний слой легко отсоединяется.
3. Функционализация гидрогелей с лигандами ECM
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы в данном разделе должны выполняться в стерильных условиях внутри шкафа для биобезопасности.
   1. Простерилизуйте гидрогели, погрузив их в 70% этанола, затем перенесите в пластиковую посуду для тканевых культур со стерильным PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте гидрогели в этаноле надолго, так как это приведёт к обезвоживанию гелей и нарушению конъюгации ECM.
   2. Приготовьте раствор для функционализации мастер-смеси, состоящий из воды, этанола, HEPES и бисакриламида, (Таблица 4).
      ВНИМАНИЕ: Бисакриламид токсичен при вдыхании или проглатывании.
   3. Приготовьте разбавленные растворы ультрафиолетового фотоинициатора и тетраакрилата. Оба реагента растворяются в этаноле (Таблица 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите серийное разбавление тетраакрилата каждый раз, так как чрезмерное количество может привести к чрезмерной полимеризации и видимому черному поверхностному отложению (см. рисунок 3A).
   4. Взвесьте необходимое количество NHS-акрилата с помощью аналитических весов. Немедленно перед употреблением суспензируйте NHS-акрилат в 50% этаноле/50% воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное количество NHS-акрилата приведёт к образованию видимых черных поверхностных отложений и может привести к неравномерному покрытию ECM (рисунок 3B).
   5. Добавьте растворы УФ-инициатора, тетраакрилата и NHS-акрилата в основную смесь, подготовленную в шаге 1.3.2. Аспирируйте PBS и добавьте мастер-микс в гели, чтобы они полностью покрыты.
   6. Подвергайте гидрогели (без крышек контейнеров для тканевой культуры) ультрафиолетовому излучению в течение 400 с (источник ультрафиолетового света с длиной волны менее 365 нм).
      ВНИМАНИЕ: При работе с ультрафиолетом используйте соответствующую защиту глаз.
   7. Снимите гели и положите их на лёд. Аспирировать функционализационный раствор, затем три раза промыть гели предварительно охлаждённым стерильным HEPES 25 мМ (pH 6,0), затем три промывки с предохлаждённым стерильным раствором 0,9% NaCl.
   8. Инкубировать гидрогели с выбранным лигандом ECM в предварительно охлаждённом стерильном HEPES 100 мМ (pH 8,0) с 100 мМ NaCl на ночь при 4 °C на орбитальном шейкере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация лигандов ECM может быть выбрана по усмотрению пользователя; однако крайне важно поддерживать одинаковую концентрацию лиганда во всех субстратах с разной жесткостью в одной партии.
   9. Аккуратно аспирируйте раствор лиганда ECM через 16 часов. Промой гидрогели три раза PBS и добавь безсывороточный базовый слой (PBS), чтобы они оставались увлажненными. Инкубировать гели за ночь в тканевом культурном инкубаторе для проверки стерильности перед засевом клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При обнаружении загрязнения после ночной инкубации при температуре 37 °C среда будет выглядеть мутной.
   10. Используйте гели сразу для посева клеток или храните их при 4 °C в базовой среде не более 3 недель.

2. Генерация механически настраиваемых силиконовых ЭБМ-субстратов

1. Подготовка стеклянных покрытий для покрытия силиконовым гелем
   1. Очистите стеклянные накладки с 3 M NaOH в течение 20 минут.
   2. Тщательно промыйте качественной водой пять раз и впитайте воду в конце. Дайте им высохнуть на воздухе и используйте струю азота, чтобы удалить оставшиеся капли или мусор.
2. Приготовление силиконового геля
   1. Взвесьте компоненты A и компоненты B двухкомпонентного силиконового эластомера в соответствии с коэффициентом веса, указанным в таблице 2, используя аналитические весы. Используйте наконечник пипетки для аспирации вязких растворов.
   2. Тщательно смешайте компоненты A и компоненты B с помощью наконечника пипетки для полного включения.
   3. Дегазируйте смесь в вакуумной камере при 25 мм рт. ст. в течение 10 минут.
3. Гель-отливка на стеклянные накладки
   1. Положите ковер на резиновый коврик, установленный на спин-коутер, убедитесь, что он хорошо центрирован.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Резиновый коврик обеспечивает правильную вакуумную герметизацию. Без достаточного уплотнения накладка может сдвинуться и сломаться. Неправильное центрирование может привести к неравномерному покрытию.
   2. Включите пылесос, чтобы закрепить защитное скольжение.
   3. Добавьте 100 мкл гелевой смеси в центр накладки. Вращение на 500 об/мин в течение 10 с, затем 8 000 об/мин на 60 секунд.
   4. Выпекайте покрытый коверслип при 80 °C в течение 2 часов. Дайте ей остыть до комнатной температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните при комнатной температуре до месяца перед использованием.
4. Функционализация силиконового геля с помощью лигандов ECM
   1. Подвергите покрытые силиконовыми гелями покрытие кислородной плазмы на 5 минут при мощности 11 Вт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие кислородной плазмы или более высокая мощность может привести к трещинам гелей. Оптимальное сочетание мощности и времени может потребоваться тестирование в зависимости от используемого оборудования.
   2. Приготовьте раствор для силанизации, содержащий 95% этанола, 0,5% APTES и 4,5%_{dH 2}O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все последующие шаги в стерильных условиях внутри шкафа для биобезопасности.
      ВНИМАНИЕ: Аптес токсичен. Работайте с APTES в вытяжной жидкости с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
   3. Инкубировать гель-покрытый коверслип раствором силанизации в течение 10 минут.
   4. Тщательно вымойте с помощью PBS пять раз.
   5. Подготовьте раствор ЭБУ с концентрацией 100 мкг/мл EDC и выбранный ЭБУ в желаемой концентрации в PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: EDC нестабилен в растворе и чувствителен к влаге. Подготовьте его свежим перед использованием и храните плотно закрытым в прохладном, сухом месте, защищённом от влаги и прямого солнечного света.
      ВНИМАНИЕ: EDC вреден при проглатывании и токсичен при вдыхании. Наденьте подходящие средства защитной защиты и используйте вытяжку с дымом.
   6. Инкубировать накладку с раствором ECM в течение 1 часа при 37 °C или ночью при 4 °C.
   7. Стирайте покрытие с помощью PBS пять раз. Прополосните базовым материалом и добавьте клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная плотность клеток зависит от конкретной клеточной линии и целей эксперимента (например, субконфлюент для морфологии или монослой для клеточно-клеточной адгезии). Например, плотность 0,1 x 10⁶ клеток/см^² обычно используется для фибробластов, чтобы достичь 50% слияния в течение 48 часов.

3. Подготовка субстрата ЭКМ для иммунокрашивки и визуализации

1. Иммунокрашивание и визуализация субстратов на основе ПА
   ПРИМЕЧАНИЕ: Восемнадцатимиллиметровые гидрогели PA обычно обеспечивают достаточную площадь для изображения для количественного анализа. Для визуализации отливайте гидрогели и проводите иммунокрашивание в «оранжевых камерах», подготовленных из трубок объемом 15 мл. Используйте оранжевые камеры для многократных раундов гель-литья и окрашивания, при условии, что они сохраняют структурную целостность.
   1. Перфорационные кольца из поликарбонатной и силиконовой резиновой плёнки с использованием отверсаҡ диаметром 18 мм и внутренней 14 мм для подготовки прокладок и прокладок.
   2. Вырежьте отверстие в центре крышки центрифугной трубки объёмом 15 мл с помощью ножниц, чтобы создать камеру для гель-литья и окрашивания.
   3. Видел центрифугную трубку на отметке 14 мл. Обрежьте неровные края скальпелем и подпилите край крышки, чтобы она помещалась в стандартную пластину на 12 лунок.
   4. Собрать сэндвич с гидрогелем и покрытием (как описано в Разделе 1), разместив кольцо прокладки на активированном ковлскальзе.
   5. Разберите сэндвич, когда гели полностью полимеризуются.
   6. Стерилизуйте гидрогели толщиной 18 мм и перенесите их на 12-луночную сетку для культуры тканей со стерильным PBS.
   7. Выполните функционализацию лиганда ECM, как описано в разделе 1.
   8. Засеять клетки и закрепить их 4% формальдегида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте фиксаторов на спиртовой основе, так как они обезвоживают гели и нарушают структурную целостность.
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен и должен использоваться в вытяжной вытяжке.
   9. (По желанию) Соберите образцы обратно в камеру крышки трубки центрифуги. Используйте силиконовую прокладку для герметизации камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите тест на утечку с помощью PBS в течение нескольких часов перед нанесением морилки. Хотя этот метод может показаться более трудоёмким, он способствует равномерному окрашиванию и снижает потребление антител.
   10. Проведите иммунофлуоресцентное окрашивание согласно предпочитаемым пользователям протоколам.
   11. После окрашивания храните образцы в PBS с добавлением 50% глицерина. Сфотографируйте образцы как можно скорее.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте стандартных крепящих материалов, которые затвердевают, так как они могут со временем повредить гидрогели и повредить образцы. Интенсивность флуоресценции со временем уменьшается; Снимок в течение 1 недели для оптимального качества сигнала.
   12. Нанесите небольшую каплю PBS (или монтажного материала) на стеклянную поверхность тканевой культурной чаши. Аккуратно инвертируйте окрашенные гидрогели на каплю так, чтобы клетки были обращены к стеклу, и приступите к визуализации.
2. Иммуноокрашивание и визуализация на силиконовых субстратах ЭКМ
   1. Фиксируйте образцы с помощью 4% формальдегида и окрашивайте их непосредственно на чашке с стеклянным дном по стандартному протоколу иммунофлуоресценции. Избегайте фиксаторов на спиртовой основе, так как они могут повредить субстраты ECM.
   2. Образцы снимаются непосредственно с помощью традиционного флуоресцентного микроскопа.

4. Сбор белков и РНК из клеток, покрытых субстратами ЭКМ

1. С помощью щипцов аккуратно удалите гели из посевной чаши и погрузите их в стерильный PBS, чтобы смыть остаточные культурные материалы и сыворотку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно обращайтесь с крышками, так как они крайне хрупкие и легко ломаются.
2. Аккуратно промокните край гидрогеля салфетками с низким количеством ворса, чтобы удалить лишний PBS.
3. Добавьте соответствующий объем буфера для экстракции РНК на крышку контейнера для культуры тканей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты на основе фенол-гуанидина совместимы с экстракцией РНК из PA-гелей. Буферы для лизиса белка могут использоваться в соответствии с экспериментальными требованиями. Визуализируйте образцы под микроскопом после инкубации буфера лизис, чтобы обеспечить полное разрушение клеток.
4. Нанесите коверслип (гелевую сторону вниз) на раствор лизис. Аккуратно поднимите и опустите гидрогель несколько раз, чтобы обеспечить равномерное лизирование всех клеток.
5. Аккуратно соскребите поверхность геля, чтобы освободить лизат.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте коммерческие скребки для пластиковых клеток, так как жёсткий пластик может повредить мягкие гидрогели и загрязнить лизат кусочками геля. Мягкий пластик, используемый для изготовления прокладок (см. шаг 3.1.1), подходит для этой цели и может быть переоборудован для изготовления индивидуальных скребков.
6. Храните РНК или белковые лизаты при -80 °C до дальнейшей обработки традиционными биохимическими методами или используйте их немедленно.

5. Формирование культуры сфероидов в одной плоскости

1. Подготовьте гидрогель PA 75 Па на 18-мм накладках и функционализуйте поверхность с помощью экстракта базальной мембраны (BME) или другого соответствующего лиганда ECM для облегчения прикрепления клеток.
2. Насыпать клетки на гидрогели или силиконовые гели с покрытием ECM с нужной плотностью.
3. Через 2 часа аккуратно удалите отделённые клетки и нанесите BME-наложение, разбавленный в предварительно охлаждённой базальной среде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: BME полимеризуется по мере нагрева. Наконечники предварительного охлаждения перед пипетированием. Процент встроенных BME определяется желаемой механической целостностью и стабильностью полученного 3D-каркаса.
4. Инкубировать культуры при 37 °C в инкубаторе для культуры тканей в течение 1,5 часа, чтобы обеспечить полимеризацию BME.
5. Аккуратно добавьте клеточную культурную среду, чтобы полностью покрыть 3D-гели.
6. Поддерживайте культуры в стандартных условиях. Клетки будут продолжать расти и самособираться в трёхмерные сфероиды со временем, пока не будет достигнута желаемая экспериментальная конечная точка.

Результаты

Жёсткость геля PA, полученная с использованием формул из таблицы 1 , была экспериментально проверена с помощью реометра. Были выбраны гели с номинальными значениями жесткости 0,4 кПа, 6 кПа и 60 кПа, охватывающими три порядка величины. Измеренные значения жёсткости составили 363 ± 76 Па для гелей 400 Па, 6,41 ± 0,50 кПа для гелей 6 кПа и 36 ± 8 кПа для гелей 60 кПа (рисунок 4A). Для оценки равномерного прикрепления ЭКМ к гелям ПА флуоресцентно маркирован...

Обсуждение

Описанный протокол изготовления ECM обеспечивает воспроизводимый, масштабируемый и экономичный рабочий процесс, который легко реализуется в большинстве лабораторий. Хотя традиционная стеклянная и пластиковая посуда, удобная и обеспечивает быстрый сбор данных, синтетические субстраты не воспроизводят физиологически релевантную жёсткость тканей. Альтернативные механически настраиваемые субстраты, такие как полидиметилсилоксан (PDMS) или желатиновый метакрилоил (GelMA), проще изготовить, но...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
(3-Аминопропил)триэтоксисилан (АПТЭС)	919-30-2	-	Thermo Fisher Scientific
Микроцентрифужные пробирки 1,7 мл	-	LMCT1.7B	FroggaBio
12-лунковые пластинки, обработанные для культуры тканей	-	83.3921	Sarstedt
15-мл центрифужные пробирки (для оранжевой камеры)	-	CLS430790	Corning
2-Гидрокси-4'-(2-гидроксиэтокси)-2-метилпропиофенон (Иргакюр)	106797-53-9	-	Thermo Fisher Scientific
2% раствор бисакриламида	110-26-9	-	Bio-Rad
3-(3-Диметиламинопропил)-1-этилкарбодиимид хлорид (ЭДЦ)	25952-53-8	-	Chem Impex International
4',6-Диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид	28718-90-3	-	Sigma
4',6-Диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (ДАПИ)	-	D1306	Invitrogen
40% раствор акриламида	01/06/1979	-	Bio-Rad
50% Глутаральдегид	111-30-8	-	Thermo Fisher Scientific
6-см чаши для культуры тканей, обработанные для культуры	-	83.3901	Sarstedt
Клетки A549	-	CCL-185	ATCC
Эфир акриловой кислоты с N-гидроксисукцинимид	38862-24-7	-	Thermo Fisher Scientific
Alexa Fluor 488 козлиный анти-кроликовый антиген	-	A11008	Invitrogen
Alexa Fluor 594 NHS эфир (трис(триэтиламмониевый соль))	-	A37572	Invitrogen
Персульфат аммония	7727-54-0	-	Bio-Rad
Прозрачная ударопрочная пленка из поликарбоната (0,005 дюйма; прокладка)	-	85585K72	McMaster-Carr
Силиконовый гель CY 52-276, компоненты А и В	2624028	-	Dow
Измененная среда Дульбекко (DMEM)	-	11995-065	Thermo Fisher Scientific
Этанол безводный	64-17-5	-	Greenfield Canada
Fast SYBR Green Master Mix	-	4385612	Thermo Fisher Scientific
Фетальный бычий сывороточный анализ	-	A52567-01	Thermo Fisher Scientific
Фибронектин	-	356008	Corning
Формальдегид (16%)	-	28908	Thermo Fisher Scientific
ГЕПЕС	7365-45-9	-	BioShop
Лист силикона для высоких температур (0,020 дюйма; прокладка)	-	86435K452	McMaster-Carr
Соляная кислота	7647-01-0	-	BioShop
Набор инструментов для вырубки полых отверстий большого размера	-	66000	Mayhew Pro
Matrigel	-	356234	Corning
Боросиликатная стеклянная бутылка для хранения среды, 250 мл	-	CLS1395250	Corning
Боросиликатная стеклянная бутылка для хранения среды, 500 мл	-	CLS1395500	Corning
Микроамперная быстрая оптическая 96-лунковая реакционная пластинка	-	4346906	Thermo Fisher Scientific
Крышки для микроскопических предметов, диаметром 18 мм	-	72222-01	Electron Microscopy Sciences
Крышки для микроскопических предметов, диаметром 50 мм	-	1.84E+16	eBay
PBS (1×)	-	14190144	Thermo Fisher Scientific
PBS (10×)	-	70011044	Thermo Fisher Scientific
Фаллоидин	17466-45-4	-	Biotium
Фосфо-ФАК (Tyr397) антиген	-	85567	Cell Signaling Technology
Фосфо-МЛЦ (Ser19) антиген	-	3671	Cell Signaling Technology
Очиститель плазмы	-	PDC-32G	Harrick Plasma
qPCR праймеры (прямой и обратный)	-	N/A	Integrated DNA Technologies
qScript набор для синтеза комплементарной ДНК	-	95047	QuantaBio
Rain-X	-	-	Rain-X
Пробирки с винтовыми крышками, конусной подставкой, 15 мл	-	62.554.101	Sarstedt
Пробирки с винтовыми крышками, конусной подставкой, 50 мл	-	62.547.205	Sarstedt
Серологическая пипеточка, 10 мл	-	170356N	Thermo Fisher Scientific
Серологическая пипеточка, 25 мл	-	170357N	Thermo Fisher Scientific
Серологическая пипеточка, 5 мл	-	170355N	Thermo Fisher Scientific
Серологическая пипеточка, 50 мл	-	170358N	Thermo Fisher Scientific
Гидроксид натрия	1310-73-2	-	BioShop
Белоково-гелева