Характеристика структуры-функции липидно-белковой мембраны с использованием двухслойных слоёв интерфейса капель

Summary

Представлен экспериментальный протокол для сборки, электрической стимуляции и анализа двухслойных интерфейсных капель с легированным грамицидином A. Взаимосвязь структуры и функции липидов и белка количественно оцениваются путем измерения изменений площади мембраны, ионного потока и одноканальной проводимости, а также связи этих реакций с пластичными изменениями ионной проводимости в мембранной модели, вдохновлённой электрическими синапсами.

Abstract

Капельно-интерфейсные бислои (DIB) предоставляют настраиваемую платформу для исследования электромеханических свойств липидных и липидно-пептидных мембран под контролем электрической стимуляции. DIB позволяют измерять ионную проводимость как одноканальное, так и ансамблевое измерение на площадях мембраны, которые на порядки превышают традиционные методы патч-клампа, что позволяет анализировать электромеханическую деформацию на уровне мембраны и её влияние на ионопроводящие пептиды. Систематически настраивая мембранную структуру через фазу объёмной углеводородной нефти (например, гексадекан [C16] против додекана/гексадекана [C12/C16] [25%/75%, v/v]), эта платформа снизу вверх позволяет систематически изменять состав мембраны и масляную среду, что влияет на вязкоупругость мембраны и структурную реорганизацию, а значит, и на проводимость пептидных ионов. Предусмотрены подробные процедуры для сборки мембран с помощью граммицидин-легированных 1,2-дифитаноил-сн-глицеро-3-фосфохолина (DPhPC) с использованием различных составов углеводородного масла, а также для применения протоколов напряжения-импульсов, приводящих мембраны в метастабильные электромеханические состояния. Характеризуется адаптивная мембранная ионная проводимость, включая краткосрочные, пластичные (STP-подобные) и долгосрочные потенциационные и депрессивные (LTP-подобные/LTD-подобные) ответы в модельной мембранной системе. В более широком смысле, этот протокол предоставляет надёжный, воспроизводимый подход для систематического изучения составно-зависимых от состава мембранных электромеханических вкладов в синаптическое проводящее поведение, а также для понимания того, как липидные мембранные среды модулируют функцию ионных каналов.

Introduction

Биологические мембраны — это критически важные супрамолекулярные структуры, способные регулировать ионную проводимость и обеспечивать связь между нейронами через электрические и химические синапсы 1,2,3,4.Этот тип коммуникации дополнительно контролируется синаптической пластичностью, при которой структурные изменения синапсов модулируют их силу и устойчивость в диапазоне^{временных масштабов 5,6}, обычно описываемых с терминами краткосрочной пластичности (STP) и долгосрочной потенциации или подавления (LTP или LTD). Эти явления, включающие динамические изменения мембранной проводимости в ответ на нейронную активность, часто связаны с^{нейропластичностью 7}, которая лежит в основе обучения и памяти⁸. Традиционные модели пластичности часто подчёркивают биохимическую регуляцию ионных каналов через синтез, транспортировку или фосфорилирование^{белков 9}. Однако роль нейронных плазматических мембран в моделях пластичности в основном была упущена^10,11.

Методы патч-клампа используются уже более полувека для изучения электрофизиологии моноионных каналов. Однако они могут исследовать только мембранные площади, значительно меньше, чем целые синапсы или крупномасштабные синтетические модели. Таким образом, они создают техническое ограничение для изучения реорганизации и деформации мембран в мезомасштабе. Мезомасштаб всё больше признаётся критической длиной для понимания многих аспектов мембранной^{биофизики 12,13}.

Представлена методология использования интерфейсных капельных двуслоев (DIBs14,15), легированных моновалентным пептидным катионом ионофором грамицидин-А (gA), для моделирования ионной проводимости, подобно тому, что происходит в электрическом синапсе. Эта система обладает несколькими ключевыми преимуществами: (i) DIB обеспечивают регулируемую липидную и масляную платформу, позволяющую систематически реорганизационировать^{мембраны 16}; (ii) DIB позволяют изучать события одноканального и ансамблевого канала на диапазоне длинных^{шкал 17, 18}; и (iii) DIB позволяют исследовать мембранные участки^{размером 2} миллиметра, которые фиксируют коллективную электромеханически индуцированную реструктуризацию мембраны, сохраняя при этом способность разрешать события одноканальной ионной^{проводимости 19,20}. Этот метод наиболее подходит для исследований, требующих одновременного электрического и оптического анализа мембранной электромеханики на мембранных площадях, превышающих доступные обычным патч-зажимом, при этом сохраняя способность разрешать дискретные события канала. Он особенно полезен, когда целью эксперимента является изучение того, как состав мембран, среда масла и формы наложенных напряжений влияют на коллективную реструктуризацию мембраны и проводимость пептидов. Этот метод менее подходит для экспериментов, требующих нативной клеточной архитектуры или прямых молекулярных показаний конформационных изменений белка в целостных биологических^{мембранах} 19,20,21.

Применяя физиологически значимую электрическую стимуляцию, DIB переходят в неравновесные стационарные состояния, при которых динамическая электромеханическая реструктуризация изменяет проводимость ионного канала пептидов. Эти возникающие изменения ионной проводимости описательно аналогичны неврологическим явлениям STP, LTP и LTD, обсуждаемым в^neuroscience 22,23,24. В настоящем исследовании эти поведения интерпретируются преимущественно как физические реакции на уровне мембраны на электрическую стимуляцию, связанные с внутренними механическими свойствами мембраны, такими как вязкоэластичность и сжимаемость в модельной^{мембранной системе 25}. В частности, описанное здесь исследование опирается на предыдущие данные о том, что липидные билейеры могут обладать фундаментальной электрической памятью благодаря устойчивым сдвигам проводимости и ёмкостному накоплению заряда после^{стимуляции} 14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33^{, 34}, предлагая новые знания о механизмах, с помощью которых липидные бислои могут поддерживать адаптивную, синаптическую функцию при отсутствии сложного клеточного механизма. Наконец, эта методология также позволяет напрямую изучать взаимоотношения структура-функция и то, как возникающее макромасштабное поведение возникает из простой структурной^{реорганизации} 21,25,27.

Protocol

Тщательно очистите всю посуду и оборудование соответствующими лабораторными моющими средствами и прополосните дистиллированной водой перед подготовкой образца. Всегда носите защитные очки и перчатки из нитрила или латекса, чтобы избежать загрязнения. Утилизировать все химические отходы в соответствии с институциональными стандартами безопасности. Обеспечьте правильное хранение летучих растворителей в соответствии с институциональными нормами безопасности. Обеспечить свободное пространство и оборудование лаборатории для экспериментов (рисунок 1A), экспериментальный сосуд (рисунок 1B), а также электрические и оптические соединения (рисунок 1C) без препятствий.

1. Приготовление водного буферного раствора

1. Взвесьте соответствующее количество 3-(N-морфолино) пропансульфоновой кислоты (MOPS) и хлорида калия (KCl) для получения желаемых конечных концентраций (например, 10 мМ MOPS, 0,1 M KCl в 500 мл).
2. Добавьте MOPS и KCl к ~450 мл дистиллированной воды в объёмной колбе объёмом 500 мл или градуированном цилиндре и перемешивайте магнитным перемешивателем до полного растворения.
3. Измерьте pH с помощью калиброванного pH-метра. Отрегулируйте pH до 7,4, добавляя 1 M гидроксида калия (KOH) или соляной кислоты (HCl) с интервалами по 0,25 мл при непрерывном перемешивании.
4. Увеличите общий объём до 500 мл дистиллированной водой и тщательно перемешайте. Перенесите буфер в чистую бутылку с этикеткой, запечатайте и храните при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте буфер до ~2 месяцев. Проверяйте и регулируйте pH до 7,4 перед каждым использованием.

2. Приготовление раствора грамицидина

1. В химической вытяжке добавьте 5 мг грамицидина A (gA) в чистый стеклянный флакон объёмом 20 мл. Добавьте 10 мл метанола с помощью стеклянного или газонепроницаемого шприца и вооружите вихрь до полного растворения пептида. Маркируйте флакон как «gA stock» и храните при -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ансамблевые эксперименты используют липидные: пептидные молярные соотношения ~1:^10-4. Одноканальные эксперименты используют ~10–100 раз меньше пептида (1:^10-5–^10-6) для разрешения отдельных событий в короткие сроки записи (<1 минута). Подготовка разбавленного приклада повышает точность пипетирования при низких молярных соотношениях (< ~ 1:^10-4).
2. Прочистите два дополнительных чистых стеклянных флакончика по 20 мл с аргоном на ~5 секунд каждая, чтобы убрать пыль.
3. С помощью чистого газогерметичного шприца насыпьте 9,9 мл метанола в каждую прочистенную ампулу.
4. Пипетта 100 мкл стандартного раствора gA стерильным газонепроницаемым шприцом в один флакон для получения общего объёма 10,0 мл. Пометьте этот флакон как «A». Концентрация = 2,66 мкм гА в метаноле.
5. Пипетта 100 мкл раствора «A» во второй стеклянный флакон для получения общего объёма 10,0 мл. Пометьте этот флакон как раствор «B». Концентрация = 26,6 нМ гА в метаноле.
6. Запечатайте флаконы крышками и оберните парапленкой.
7. Все растворы с gA храните при -80 °C до использования.

3. Подготовка липидно-пептидных пузырьков

1. Очистите чистый стеклянный флакон объёмом 20 мл аргоном на ~5 секунд.
2. Добавьте 4 мг липида 1,2-дифитаноил-сн-глицеро-3-фосфохолина (DPhPC) в флакон.
3. В выхлопчике добавьте 1 мл метанола с помощью стеклянной пипетки. Аккуратно покрутите или вихрьте, пока весь липид не растворится.
4. Используя газонепроницаемый шприц объёмом 500 мкл, добавьте 178 мкл раствора «A» (для экспериментов на уровне ансамбля STP; Молярное соотношение DPhPC:gA = 1:^10-4) или 890 мкл раствора «B» (для одноканальных экспериментов; Молярное соотношение DPhPC:gA = 1:5×^10-6) в раствор метанола DPhPC. Аккуратно разведите вихрь для смешивания.
5. Под мягким струёй аргона в выхлопной вытяжке метанол испаряется, пока на дне флакона не образуется тонкая, однородная липидная пленка.
6. Поставьте открытый флакон в вакуумную духовку при температуре 40 °C и втяните в полный вакуум на 10–12 часов или на ночь, чтобы удалить остатки растворителя.
7. Вынимите флакон из вакуумной печи и добавьте 2 мл буфера на 0,1 млн кКл, подготовленного в Секции 1 для экспериментов по STP, что приведёт к итоговой концентрации липидов и грамицидина в суспензии 2,36 мМ и 236 нМ соответственно. Для одноканальных экспериментов добавьте 2 мл буфера 1 М KCl, как это предусмотрено в Секции 1. Вихрь для регидратации липидной пленки и получения липидной суспензии 2 мг/мл, что приводит к конечной концентрации липидов и грамицидина в суспензии 2,36 мМ и 11,8 нМ соответственно.
8. Заморозьте флакон при -80 °C минимум 6 минут, затем разморозите на горячей плите при 40 °C или в водяной бане 6 минут. Ненадолго Vortex для смешивания. Повторите этот цикл заморозки-оттаивания шесть раз, чтобы способствовать формированию мультиламеллярных пузырьков.
9. Соберите экструдер липидного пузырька с мембраной диаметром 0,1 мкм с травлением по дорожке согласно инструкциям производителя. Пропустите 500 мкл буфера через экструдер три раза, чтобы увлажнить мембрану, убедитесь, что нет утечек, и избавьтесь от буфера.
10. Загрузите 1 мл разтаявшейся липидно-пептидной суспензии в экструдер и проведите 31 проход через мембрану 0,1 мкм, чтобы получить униламеллярные везикулы диаметром ~100 нм и обеспечить однородность размеров.
11. Перенесите экструдированные пузырьки (крупные одномеллярные пузырьки, LUV) в ПЦР-пробирку объемом 1 мл, промаркуйте и храните при 4 °C. Используйте в течение 2 недель после подготовки.
12. Запечатайте оставшуюся неэкструдированную липидно-белковую суспензию в оригинальном флаконе, оберните парапленкой и храните при -80 °C для последующего использования.
13. Если использовать ранее замороженные, неэкструдированные образцы, переплавите при 40 °C с помощью горячей пластины или дайте образцу нагреться до комнатной температуры, затем экструдируйте образец.

4. Приготовление агарозного геля

1. Поставьте чистую стеклянную стакан на 50 мл на горячую плиту. Добавьте одну таблетку агарозы к 50 мл того же буфера, который используется для гидратации липидной пленки (например, 10 мМ MOPS, 0,1 М KCl, pH 7,4), чтобы получить 1% раствор агарозного геля.
2. Добавьте чистую тефлоновую батончик и энергично перемешивайте, пока таблетка не рассеется.
3. Накройте стакан алюминиевой фольгой и проколите небольшое вентиляционное отверстие металлической лопаткой. Установите температуру плиты на 220–230 °C. Раствор становится прозрачным и достигает закипения, что указывает на полное растворение агарозы.
4. Выключите огонь и аккуратно снимите фольгу. Скользите по любой поверхностной плёнке чистой металлической лопаткой. Сразу используйте горячий раствор агарозы для покрытия электрода или дайте ему остыть и затвердеть в стакане для последующего использования.
5. После покрытия агарозой электродом накройте затвердевшую агарозу фольгой, запечатайте парапленкой, наклейте и храните при 4 °C. При необходимости разогревайте до кипения и помешивайте, пока полностью не расплавите.

5. Подготовка электродов

1. Разрезать серебряную проволоку диаметром 0,125 мм на ~70 мм длины для электродов для головной сцены и ~130 мм для заземляющих электродов.
2. Используя открытое пламя (например, ручную зажигалку или горелку Бунзена), удерживайте по одному концу каждой серебряной проволоки горизонтально в самом горячем центральном конусе пламени, пока кончик не расплавится и не образует сферический шар диаметром ~0,2 мм (рисунок 2A).
3. Положите провода на чистую поверхность и под микроскопом убедитесь, что шарики сферические и имеют похожий размер. Если шар продолговатый или неправильный, отрежьте кончик и повторите плавление (Шаг 5.2).
4. Поместите концы обоих серебряных проводов в стеклянную ёмкость со свежим бытовым отбеливателем (гипохлорит натрия, NaClO). Убедитесь, что шары полностью погружены под воду и инкубируют не менее 1 часа, чтобы хлорировать поверхность и образовать Ag/AgCl. Тусклый коричнево-серый вид подтверждает успешное хлорирование (рисунок 2B).
5. Удалите провода с отбеливателя, когда концы шарика приобретут тускло-серый цвет, тщательно прополосните дистиллированной водой и положите их на чистую, свободную от ворса поверхность для сушки.
6. Возьмите один держатель пипетки на головной сцене и один держатель заземляющего электрода. Разрежьте 100-мм боросиликатный стеклянный капилляр (1,0 мм OD, 0,58 мм ID) пополам с помощью стеклореза.
7. Вставьте один полукапилляр в держатель пипетки на сцене и затяните его, чтобы закрепить его. Закрепите полный капилляр диаметром 100 мм на держатель заземляющего электрода и закрепите его.
8. Вставьте нешаровый конец серебристого провода 130 мм в капилляр заземляющего электрода, пока не будет выступать ~20 мм конца шара. Прикрепите противоположный конец провода к держателе, оставив ~5 мм открытыми для заземления.
9. Повторите следующий шаг с проводом 70 мм для электрода сцены, обеспечив плотный контакт между проводом и разъёмом сцены (золотистым элементом). Обрежьте лишний провод от конца разъёма сцены.
10. Каждый хлорированный серебряный шар окуньте в агарозу, чуть выше соединения шариково-вала, чтобы получить тонкое, равномерное покрытие. Погружайтесь в воду и выходите минимум 10 раз.
11. Вынимите электрод и дайте агарозе зажечь гель при комнатной температуре. При необходимости повторяйте погружение, чтобы получить гладкую, ровную агарозную раковину толщиной десятки микрометров. Избегайте нанесения покрытия слишком высоко или слишком низко по проводу (рисунок 2C).
12. Установите электроды на микроманипуляторы сцены и землю. Подключите открытый заземляющий провод (~5 мм) к земле усилителя с помощью аллигаторного клипса.
13. С помощью пинцета аккуратно согните каждый электрод посередине между концом шарика и капилляром так, чтобы конец был перпендикулярен стадии микроскопа. Избегайте изгибов выше 90°, чтобы минимизировать оптические искажения в визуальных и видеосъёмках микроскопа.
14. Отрегулируйте ориентацию электродов в их держателях так, чтобы концы шара, покрытые агарозой, были перпендикулярны плоскости изображения микроскопа (рисунок 3A).

6. Формирование двухслойных интерфейсов капель (DIB)

1. Поставьте чистую, прозрачную чашку Петри на сцену перевёрнутого микроскопа. Заполните блюдо алкановым маслом (например, 100% гексадеканом или 25%/75% в/в додеканом/гексадеканом) на глубину ~ 5 мм (рисунок 1B).
2. Используя микроманипуляторные органы управления, опустите оба конца шарика, покрытые агарозой, в масло на глубину ~2,5 мм ниже поверхности масла. Избегайте резких движений микроманипулятора, чтобы предотвратить столкновения шариковой головки электрода с чашкой Петри.
3. Отрегулируйте фокус микроскопа так, чтобы оба конца шарика и их агарозные покрытия стали в чётком фокусе. Разместите электроды у края поля зрения так, чтобы оба можно было наблюдать одновременно.
4. Используя откалиброванную пипетку объёмом 2 мкл, аспирируйте экструдированную липидно-пептидную везикулу. Медленно нанесите 250 нл подвески непосредственно на каждый конец шарика, покрытый агарозой, используя отдельный кончик пипетки для каждого, не касаясь агарозной оболочки кончиком пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы минимизировать вибрации рук и повысить устойчивость, закрепите оба локтя к выступу стола против вибраций. Стабилизируйте пипетирующее запястье рукой, медленно погружайте пипетку в масло и постепенно подойдите к электроду. Кратковременная задержка дыхания во время загрузки каплей может дополнительно уменьшить нежелательные движения.
5. Позвольте каплям распространиться и покрыть агарозную оболочку и провиснуть от электрода под действием гравитации. Наблюдайте прогибание сбоку через стенку чашки Петри, если это свободно (рисунок 3B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для проседания капель, зависит от распределения размеров везикул, температуры и топографии агарозы. Для DPhPC DIB подождите не менее 5 минут после осадки^{капель 15}.
6. Аккуратно подтолкните антивибрационный стол, чтобы оценить готовность капель. Подтвердите, что провисшие капли движутся с небольшой задержкой относительно движения электрода, что указывает на образование полностью покрытых монослойных липидных капель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Задержка движения происходит потому, что образование липидного монослоя вокруг водной капли значительно снижает поверхностное натяжение, задерживая физическую реакцию при перемещении электрода в масле.
7. Если такого поведения не наблюдается, подождите ещё 2–3 минуты и повторите процесс.

7. Электрическая установка и двухслойный мониторинг (визуальный и электрический)

1. Убедитесь, что микроскоп, антивибрационный стол, клетка Фарадея и все электрические компоненты, включая усилитель, дигитайзер, генератор функций и компьютер, подключены к общей земле (рисунок 1).
2. Организуйте соединения приборов согласно руководству производителя по настройке. Используйте рисунок 1C в качестве схемного ориентира для основной электрической и оптической конфигурации. Обратитесь к подробным инструкциям по заземлению³⁵, аппаратной/программной конфигурации и регулировке смещения пипетки для экспериментов с DIB.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям по настройке оборудования, специфическим для всего программного и аппаратного обеспечения, указанных в Таблице материалов.
3. Подключите электроды заголовка сцены и заземления к усилителю с патч-клампом.
4. Настройте внешний генератор функций (или выходной канал программного обеспечения для получения информации) для генерации треугольной волны напряжения 10 Гц и 10 мВ. Подтвердите амплитуду и частоту на подключённом осциллографе и внутри программного обеспечения для получения информации.
5. После того как капли провиснут на ~ 10 минут, используйте микроманипуляторы, чтобы мягко соприкоснуться с двумя каплями. Отрегулируйте положение электродов так, чтобы площадь контакта капель изначально не превышала ~ 1/4 их диаметра.
6. Включите треугольную форму 10 Гц, 10 мВ и контролируйте ёмкостный ток с помощью усилителя и программного обеспечения для сбора сигнала.
7. Ждите спонтанного образования бислоя, что электрически обозначается расширяющимся откликом ёмкостного тока от пика к пику, а оптически — увеличением внутреннего отражения (овальный облик) от контакта с бислоем (рисунок 4). Подтвердите, что чистые липидные бислои демонстрируют прямоугольные токи на треугольном стимуле напряжения, тогда как gA-легированные бислои при липиде ~1:^10-4 пептиды демонстрируют наклонные плато, отражающие ансамблевую ионную проводимость.
8. Регулировать площадь контакта капель, немного сдвинув электроды до тех пор, пока ёмкостный ток от пика к пику на треугольную форму треугольника 10 мВ 10 мВ не будет в диапазоне ~100–200 пА для DIB с ~250 нЛ в маслах C16 или C12/C16, что соответствует диапазону ёмкости ~250–500^{pF 33}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высокочастотные импульсы или ненулевые удерживающие напряжения постоянного тока могут вызывать электроувлажнение и чрезмерное расширение двух слоёв, что приводит к слиянию капель и разрыву двуслойных слоёв. Диапазон 100–200 пА обеспечивает баланс между двуслойной стабильностью и соотношением сигнал/шум, позволяя достаточно расширять площадь во время стимуляции.
9. Если DIB срастается, поднимите электроды из масла. Тщательно промыйте головки электродов тем же водным буфером, что и для образцов липидов и агарозы.
10. Удалите все водные капли из чашки Петри стерильным шприцем. При необходимости заправьте свежим маслом, электроды снова погружите. Перезагрузите раствор LUV на электроды, как описано в разделе 6, и повторите процесс.
11. После подтверждения стабильной ёмкостной или проводящей реакции отключите треугольную форму и дайте DIB уравновеситься минимум 15 минут перед применением протоколов стимуляции.

8. Протоколы электрической стимуляции

1. Импульсные эксперименты (ансамблевые STP-подобные и LTP/LTD-подобные отклики)
   1. Настройте генератор функций или программное обеспечение для передачи импульсов напряжения с нужной амплитудой, длительностью и межимпульсным интервалом (например, PPF [парное облегчение импульсов] и PPD [парное подавление импульсов]).
   2. Откройте программу для видеозахвата. Выберите подходящие настройки камеры и объектива. Установите частоту кадров не менее 20 кадров в секунду и убедитесь, что она остаётся стабильной во время записи.
   3. В программном обеспечении для сбора данных установите частоту дискретизации не менее 5 кГц для текущего сигнала.
   4. Нажмите Acquire > New Protocol, чтобы создать новый протокол, или Acquire > Edit Protocol , чтобы изменить существующий. Во вкладке «Режим приобретения » выберите «Эпизодическая стимуляция». Установить Runs/Trial на 1, а Sweeps/Run — на 1.
   5. Установите длительность сканирования на 4 секунды больше, чем общая продолжительность эксперимента. Для протокола STP длительностью 120 с (60 с PPF + 60 с PPD) установите продолжительность сверозания на 124 с, чтобы обеспечить исходные значения до и после стимула 2 с.
   6. Во вкладке «Входы » назначите канал записи текущему входу. Во вкладке «Выходы » назначите канал стимуляции выходному напряжению, управляющему электродами.
   7. Откройте вкладку Waveform. В столбце A установите тип на шаг, первый уровень на 0 мВ, а первую длительность на 2000 мс, чтобы определить исходную границу до стимуляции.
   8. В столбце B (PPF) установить тип на Step. Укажите желаемую амплитуду напряжения (например, +100 мВ), длительность импульса (например, 100 мс) и скорость передачи, чтобы установить межимпульсный интервал, соответствующий целевому рабочему циклу (например, 90,9%).
   9. В столбце C (PPD) аналогичным образом установите тип на Step с той же амплитудой и длительностью импульса, но увеличите скорость поездки или интервал между импульсами для достижения желаемого меньшего рабочего цикла (например, 28,6%).
   10. В столбце D настройте базу после стимуляции, идентичную столбцу A (0 мВ, 2000 мс).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если общая продолжительность всех эпох во вкладке Waveform превышает длительность свипа во вкладке Mode/Rate , немного увеличьте продолжительность прохода, пока ошибка не исчезнет.
   11. Сохраняйте протокол с описательным названием (например, «STP_120s»).
   12. Начинайте запись видео, затем сразу же приступайте к электрическому захвату/стимуляции, нажав на красную кнопку «Запись» для записи данных. Или же настройте цифровой триггер так, чтобы начало стимуляции одновременно запускало запись видео и электрическое получение.
   13. В первые 60 секунд стимуляции (PPF) измеренный ток обычно увеличивается с первого импульса и может достигать видимого плато на t = 60 с, тогда как в последние 60 секунд стимуляции (PPD) измеренный ток обычно снижается (см. рисунок 5). В конце протокола одновременно прекратите электрический захват и видеозапись.
2. Одноканальные эксперименты
   1. На передней панели усилителя для зажима зажима установите переключатель внешнего входа команд в режим OFF .Установить удерживающее напряжение на +200 мВ. Установите встроенный фильтр низких частот усилителя на 1 кГц. В программном обеспечении установите частоту дискретизации на 10–50 кГц и выберите непрерывный режим записи без промежутков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высокие частоты дискретизации могут снизить отношение сигнал/шум в полученных данных. Использование более высоких частот дискретизации при разрешении быстрых переходов гейтинга или кратковременных мерцающих состояний имеет значение. Средние открытые сроки жизни грамицидина A обычно находятся в диапазоне от 0,1 с до 10 с, тогда как мерцание состояний может происходить на суб-мс и μs временных шкалах; поэтому для захвата таких событий может потребоваться частота дискретизации ~50^{кГц. 36}. Последующий одноканальный анализ идеализации с JSMURF позволяет надёжно обнаруживать события на записях с переменным отношением сигнал/шум³⁷.
   2. При отсутствии внешней команды начните запись сигнала базового тока. На усилителе переключите команду напряжения с OFF на «+ », чтобы подать напряжение постоянного тока +200 мВ на DIB.
   3. Зафиксировать на ~15 с для фиксации одноканальных событий при ограничении базового дрейфа. При молярной концентрации липидной:gA 1:5×^10-6 _{зафиксированный} ток выглядит ступенчатым из-за образования и устранения венальных проводящих событий.
   4. Перед завершением записи переключите команду напряжения с "+ " обратно в OFF .Остановите сбор данных и сохраните запись с описательным именем файла (например, «DIB_C16_postPPF_200mV.abf»).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одноканальные записи определённой длительности также могут выполняться с помощью программированной эпизодической стимуляции с фиксированной амплитудой и продолжительностью, как описано в разделе 8 для PPF/PPD. Для «пост-PPF» одноканальных экспериментов сразу после 60 секунд PPF проводится эпизодическая стимуляция с напряжением постоянного тока +200 мВ.

9. Площадь мембраны и экстраполяция потока

1. В конце каждого ансамблевого эксперимента (STP, LTP/LTD) медленно перемещайте один электрод вбок с помощью микроманипуляторов, чтобы отсоединить DIB.
2. Ослабьте держатель электрода микроманипулятора и поверните его в его держателе на ~45° так, чтобы серебряный провод толщиной 125 мкм оказался в плоскости изображения.
3. Регулируйте высоту электрода, пока провод не станет в чётком фокусе под микроскопом. Сделайте неподвижное изображение или скриншот сфокусированного серебристого провода с помощью программного обеспечения камеры. Сохраните изображение масштаба для последующей калибровки размера пикселя в миллиметры.
4. Обработайте записанные следы тока согласно процедурам, описанным в ссылке 28, чтобы получить непрерывные, свободные от артефактов данные по сравнению с током и временем (рисунок 6A).
5. Определите отображение от кадра к времени, разделив индексы кадров на измеренную частоту кадров и сопоставив их с временными метками приобретения.
6. Импортируйте калибровочные и экспериментальные кадры в программное обеспечение для анализа изображений.
7. Используйте известный диаметр провода (125 мкм) с изображения калибровки масштаба для установки пространственной шкалы с помощью программной функции калибровки (Analyze > Set Scale).
8. Для расчётов потока для каждого эксперимента выберите N временных точек, охватывающих общий период стимуляции (например, 30 точек времени за эксперимент длительностью 120 с). Убедитесь, что первая точка времени соответствует первому импульсу стимула.
9. В каждой точке времени измеряйте диаметр DIB, проведя линию через пересечение краёв бислоя и записывая её длину в калиброванных единицах.
10. Преобразуйте каждый измеренный диаметр в площадь мембраны (A), предполагая круговую геометрию или используя соответствующий эллипсовый геометрический коэффициент для конкретной конфигурации липидно-масляной конструкции. Используйте полученные участки для оценки эволюции площади мембраны во времени при различных экспериментальных условиях (рисунок 6B).
11. Для каждой временной точки делим соответствующее значение тока на площадь, чтобы получить поток (I/A). Разделите все N точек данных потока на первое значение потока, чтобы получить поток, нормализованный к первому импульсу (I/A) / (I₀/_{A 0}), когда требуется нормализованный анализ потока (рисунок 6C).
12. График флюса или нормализованного потока по времени или числу импульса против времени. Повторный анализ потоков для всех ансамблевых экспериментов (STP, LTP/LTD) (рисунок 6D).
13. Интерпретировать устойчивые повышения потока или нормализованный поток относительно первого импульса во время ППД или более 2 минут как усиленную проводимость, тогда как возвраты к исходной линии или уменьшение ниже первого значения импульса указывают на снижение проводимости. Используйте полученные временные шкалы для классификации реакций как краткосрочные пластичные поведения (<2 мин) или долгосрочные потенциационные/депрессивные (> ~5 мин).

10. Одноканальный анализ

1. Импортируйте сырые одноканальные записи в предпочтительную аналитическую среду или интерфейс clampSeg и обратитесь к³⁷ для полных описаний и объяснений программных функций.
2. Примените цифровой фильтр низких частот , соответствующий экспериментальному фильтру приёма (например, 1 кГц Бесселя).
3. Конфигурация параметров.
   1. Установите альфа (α) = 0,05, определяя статистический уровень доверия так, что каждый обнаруженный шаг имеет <5% вероятность случайного флуктуации шума.
   2. Определить 5 000–10 000 итераций Монте-Карло на 1 с сегмент для оценки распределения шума и повышения статистической устойчивости обнаружения событий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте параллельную вычислительную обработку по 1 с «чанками», если это возможно, чтобы сократить время анализа.
   3. Запустите алгоритм JSMURF на фильтрованном токовом трассе.
4. Валидация модели.
   1. Наложите идеализированную (квадратно-волную) следовую проводимость на фильтрованный ток и визуально подтвердите, что шаговые переходы совпадают с резкими изменениями в экспериментальном сигнале.
   2. Используйте известные характеристики фильтра в низких частотах для создания запутанной реконструкции идеализированного следа и наложите её на необработанный^{трек 37}. Подтвердите, что восстановленный сигнал близко соответствует временной и амплитудной огибающей записанного тока.
5. Количественная оценка проводимости и срока службы.
   1. Определим самое низкое стабильное плато в идеализированной трассе как замкнутое базовое состояние. Определите первую ненулевой амплитуду плато как основную открытую проводимость (одноканальный уровень).
   2. Классифицируем более высокие целочисленные кратные этой амплитуды как многоканальные открытые состояния (2+, 3+ и т.д.). Определите промежуточные плато, которые стабильны, но ниже полностью открытых уровней, как субпроводимость.
   3. Извлеките амплитуду и длительность каждого события из идеализированного следа и разместите их для получения гистограмм амплитуды проводимости и гистограмм за всю жизнь.
6. Амплитудные гистограммы и распределения за всю жизнь
   1. Сравните идеализированные гистограммы проводимости и амплитуды с амплитудными гистограммами, полученными непосредственно из отфильтрованных данных. Подтвердите, что идеализированные гистограммы показывают более чёткие, лучше разделённые пики, соответствующие дискретным состояниям^{проводимости 37}.
   2. Для каждого экспериментального условия вычислим функцию выживания N(t)/N(0), где N(0) — общее количество открытых событий (полные и субпроводимые), а N(t) — количество событий с длительностью длиннее t. Исключить из этого анализа интервалы замкнутого состояния.
   3. Постройте функции экспоненциального затухания N(t)/N(0) по времени и подгонке с помощью нелинейной рутины наименьших квадратов в предпочитаемом программном обеспечении.
   4. Интерпретировать сдвига вправо в пиках распределения проводимости в амплитудных гистограммах как увеличенную проводимость, более длинные константы времени распада в графиках N(t)/N(0) по сравнению с временными графиками как повышенную стабильность в открытом состоянии, а лево-сдвиговые распределения — как более короткие сроки службы канала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать воздействия окружающей среды, такие как воздушные течения, вибрация и движущиеся объекты поблизости. Избегайте опираться на оптический стол и держите разговоры подальше от экспериментальной установки. Держать мобильные телефоны, планшеты, ноутбуки и другие персональные электронные устройства на расстоянии не менее 1,5 м от клетки Фарадея, чтобы уменьшить электромагнитные помехи. Используйте оптически прозрачный масляный резервуар и оптимизируйте микроскопическое освещение и контраст, чтобы сделать края капель и двуслойных слоёв. Приобретайте и/или экспортируйте видео в оттенках серого, если это улучшает контраст границ и упрощает ручные измерения диаметра DIB. Для экспериментов, не исследующих температурное влияние, следите за поддержанием температуры лабораторной среды, стенда микроскопа и масла при температуре 21–22 °C.

Results

Экспериментальная установка DIB
Система записи размещена в клетке Фарадея на антивибрационном столе, при этом электрические и видеоданные получаются двумя отдельными компьютерами (рисунок 1A), хотя может использоваться один компьютер с возможностью разделённого экрана. Среда образца DIB состоит из двух электродов, покрытых агарозой, погруженных в определённый объём алканового масла (рисунок 1B). Рисунок 1C показывает схему основных электрических и оптических соединений для экспериментальной установки, описанной в этой рукописи.

Рисунок 1: Экспериментальная установка. (A) Антивибрационный стол и корпус клетки Фарадея с указанными основными компонентами, включая усилитель, дигитайзер, шумовой фильтр, генераторы функций и интерфейс с двумя компьютерами для электрического и видеозаписи. (B) Вид сверху на среду DIB-образца и электроды. (C) Схема электрических и оптических связей, связанных с экспериментальной установкой, описанной в этой рукописи. Все отдельные компоненты имеют общий язык в лабораторном здании. Все эксперименты проводились при комнатной температуре (21–22 °C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Подготовка и контроль качества электродов Ag/AgCl
Расплавляя наконечник серебряной проволоки, образуется сферический шар (рисунок 2A); Некачественные расплавы выглядят продолговатыми или неправильными. Хлорирование в отбеливателе образует тусклую коричнево-серую поверхность Ag/AgCl (рисунок 2B). Тонкая, однородная агарозная оболочка толщиной порядка десятков микрометров на шаре необходима для стабильной поддержки капель и низкоимпедансной электрохимической связи, тогда как неравномерное покрытие приводит к плохому прикреплению капель (рисунок 2C).

Рисунок 2: Подготовка электрода. (A) Микроскопические изображения расплавов электродов хорошего и низкого качества. (B) Сравнение нехлорированных и хлорированных головок электродов. (C) Примеры качественных и низкокачественных агарозных покрытий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Установка электродов. (A) Вид сверху выравнивания угла установленного электрода. (B) Боковой вид при сравнении непровисших капель сразу после загрузки LUV с провисшими каплями после формирования монослоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Положение электродов и поведение прогибания капель
Вид сверху вниз показывает правильное угловое положение электродов для минимизации оптических искажений (рисунок 3A). Боковые виды сравнивают непровисшие капли (сразу после загрузки раствора LUV) и провисшие капли с липидным покрытием (спустя 5 минут) (рисунок 3B). Провисшие капли, используемые для формирования DIB, демонстрируют задержку физической реакции на движение из-за значительного снижения поверхностного натяжения от липидных монослоёв, что визуально подтверждает образование взвешенной водной капли, полностью покрытой липидным монослоем. После установления проседания треугольная стимуляция используется для электрического подтверждения формирования и стабильности^{бислоя 35}.

Рисунок 4: Формирование двухслойного интерфейса капель.(A) Таймлапс-последовательность, показывающая образование и расширение двухслойных слоёв после контакта с каплями. (B) Отражение внутренней мембраны, используемое для оценки диаметра и площади бислоя. DIB-визуализация проводится из-под установки с помощью инвертированного микроскопа. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Образование и измерение площади DIB
Последовательные изображения запечатлено спонтанное «затягивание» бислоя и расширение площади, когда две провисшие капли соприкасаются (рисунок 4A). Яркие, внутренние овальные отражения на контакте с каплей используются для оценки диаметра бислоя и, соответственно, площади мембраны со временем (рисунок 4B).

Рисунок 5: Протокол STP — стимуляция и реакция. Представлены репрезентативные токовые реакции при парном импульсном фасилитировании (PPF, 0–60 с, красный) и парной импульсной депрессии (PPD, 60–120 с, синий) (вверху), вместе с соответствующим протоколом стимуляции (внизу). Импульсы PPF и PPD имеют длительность 100 мс с временем выключения 10 мс и 250 мс соответственно, обеспечивая рабочие циклы 90,9% и 28,6%. Фасилитация соответствует чистому увеличению ионного тока; депрессия соответствует чистому снижению. Текущие ответы фиксируются только в периоды ON; для визуализации данные между импульсами интерполируются для выделения общих текущих тенденций. Длительность времени и количество импульсов схемы импульсов в фазах PPF и PPD не отображаются в масштабе и иллюстрируются для визуализации. Репрезентативные данные о текущем отклике, воспроизведенные из Podar PT и др.^,25 в рамках CC BY-NC-ND 4.0. Авторские © права 2025 Автор(ы). Опубликовано PNAS. Схема стимуляции изменена для настоящей рукописи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Протокол электрической стимуляции для индуцирования краткосрочного пластичного поведения (похожий на STP)
Описанные здесь паттерны стимуляции представляют собой парную импульсную фасилитацию (PPF) и депрессию (PPD) по аналогии с терминологией нейронауки, аналогично Koner и^{Najem 28,29}. Парная импульсная фасилитация (PPF; 0–60 с) и парная депрессия импульсов (PPD; 60–120 с) реализуются с помощью импульсов по 100 мс с временем выключения 10 мс и 250 мс соответственно, что соответствует рабочим циклам 90,9% для PPF и 28,6% для PPD. Верхняя панель показывает репрезентативные текущие реакции во время периодов ON, а нижняя — паттерн стимуляции.

Текущий, площадный и ионный поток во время STP и последующей долгосрочной стимуляции
Нормализованный ток (I/_{I 0}) для двухслойных слоёв DPhPC с gA в маслах C16 и C12/C16 показан при PPF и PPD (рисунок 6A). Нормализованная площадь мембраны (A/_{A 0}), измеренная в 30 точках времени, показывает схожую эволюцию площади в обоих условиях масла, несмотря на разные токи (рисунок 6B). Данные для нормализованного тока и площади представлены в виде среднего ± облаков и баров Южной Дакоты соответственно по 28 независимым DIB на состояние нефти. Нормализованный поток, J/_{J 0} = (I/_{I 0})/(A/_{A 0}), отделяет промежуточные изменения проводимости и соответствует изменениям мембранной проводимости за пределами простого расширения площади (рисунок 6C). Однако эти изменения могут отражать вклад как одноканальной проводимости, так и количества активных проводящих каналов. Длительное стимуляция ППД до 30 минут вызывает длительное поведение, похожее на депрессию (LTD), в мембранах C16, но сохраняет повышенный поток, соответствующий LTP-подобному поведению, в мембранах C12/C16 (рисунок 6D). Вместе эти данные показывают, что состав мембран модулирует как краткосрочные, так и долгосрочные изменения пластичности ионного потока.

Рисунок 6: Ток, площадь и рассчитанный ионный поток DIB во время STP и перехода в LTP/LTD. (A) Нормализованный ток (I/I₀) в PPF (0–60 с, белый фон) и PPD (60–120 с, серый фон) для мембран DPhPC, легированных gA, в маслах C16 (оранжевый) и C12/C16 (синий), при этом каждое условие включает n = 28 независимо сформированных DIB. (B) нормализованные площади мембраны (A/A₀), измеренные в 30 точках времени, показывающие сопоставимые траектории площади несмотря на разные отклики токов; данные представлены как среднее ± S.D. по одному n = 28 независимых DIB на состояние нефти. (C) Нормализованный поток, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)), рассчитывается на основе соответствующих измерений тока и площади, подчёркивая изменения в проводимости за пределами площадных эффектов. (D) Долгосрочное поведение при длительной стимуляции PPD: после начального STP 120 с (серый оттенок) DIB подвергались 30-минутным импульсам PPD с ON = 100 мс и OFF = 250 мс (сплошное красное/зелёное) или 30 с (оранжевый/серый) импульсами. Поток распадается до или ниже исходного уровня в мембранах C16, что указывает на поведение, похожее на LTD, но остаётся повышенным в мембранах C12/C16, что указывает на устойчивое поведение, похожее на LTP. Затененные области представляют распространенную ошибку от I/I₀ и A/A₀. Расширенные наборы данных PPD в (D) были получены из n = 6 независимых DIB на состояние масла для протокола 120 с, за которыми следовали 3 DIB за расширенное условие PPD. Все точки данных связаны только для визуализации. Панели A, B и D воспроизведены под CC BY-NC-ND 4.0. Авторские © права 2025 Автор(ы). Опубликовано PNAS. Панель C была недавно создана для данной рукописи на основе данных, опубликованных в Podar PT и др.^{, 25}. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Репрезентативный одноканальный след тока 15 s от DIB, легированного gA, образованного в нефти C16 после стимуляции PPF
Трасса включает сырой сигнал, захваченный на частоте 50 кГц с низкочастотным фильтром 1 кГц, 8-полюсную дорожку с фильтром Бесселя на 250 Гц и идеализированную посадку JSMURF. Самый низкий стабильный уровень определяет замкнутое состояние, а более высокие уровни соответствуют событиям одноканального, многоканального и подпроводимого. Эти следы служат основой для анализа амплитуды проводимости и срока службы. Пример времени пребывания в состоянии проводимости отражает продолжительность определённого уровня проводимости, амплитуда и продолжительность которого отражают совокупный вклад нескольких одновременных полных и/или субпроводимых событий.

Амплитуда проводимости и распределения по сроку службы
Гистограммы амплитуды проводимости для мембран C16 и C12/C16 (рисунок 7A–B) сравнивают условия до и после PPF при молярном соотношении DPhPC:gA 1:5×^10-6. Гауссовские приближения ниже данных указывают на сдвиги средних пиков проводимости после PPF и разрешают отдельные пики, соответствующие субпроводимым и многоканальным состояниям. Статистические сравнения распределений проводимости проводились на объединённых данных на уровне событий с использованием t-теста Уэлча и U-теста Манна-Уитни (α = 0,05), при этом каждое условие включало 3 независимых записи DIB, а N для заданного состояния проводимости обозначал общее количество обнаруженных событий, объединённых в этих записях. Распределения вероятности за всю жизнь, N(t)/N(0), до и после (рисунок 7C–D), показывают, что мембраны C12/C16 развивают более длинные распределения проводимости и изменённые сроки жизни относительно C16, что указывает на изменения в стабильности канала. Данные гистограммы являются репрезентативными для отфильтрованного 15-секундного следа (красного следа), полученного для каждого состояния. Распределения жизненного цикла состояния проводимости были получены на основе 3 независимых записей DIB на каждое состояние; пунктирные кривые обозначают отдельные реплики, а сплошные — глобальные экспоненциальные совпадения к N(t) / N(0) по сравнению с t.

Рисунок 7: Гистограммы амплитуды проводимости и распределения времени пребывания в состоянии проводимости. Гистограммы амплитуды проводимости для активности gA в мембранах (A) C16 и (B) C12/C16 сравнивают условия до PPF (серый) и пост-PPF (оранжевый/синий) при молярном соотношении 5 × ^10-6 gA:липид. Гауссовские приближения под гистограммами указывают на сдвиги средних пиков проводимости и стандартные отклонения для одно- и многоканальных состояний. Сдвиги средней проводимости после PPF обозначаются пунктирными линиями (чёрный = до PPF; синий/оранжевый = после PPF) и стрелками. Каждое состояние представляет собой 3 независимых записи DIB. Статистические сравнения распределений проводимости проводились на объединённых данных на уровне событий с использованием t-теста Уэлча и U-теста Манна-Уитни (α = 0,05), где N для данного состояния проводимости обозначает общее количество обнаруженных событий, суммированных в этих трёх записях. В анализ также были включены события субпроводимости, при этом репрезентативные распределения субпроводимости были отмечены слева от первого пика открытого состояния для каждого состояния мембраны. Распределения вероятности жизни событий состояния проводимости в мембранах C16 (C) и C12/C16 (D) до (оранжевый / синий) и после стимуляции PPF (тёмно-оранжевый / тёмно-синий) при 5×10-6 M gA:липидах соответствуют анализам проводимости, показанным на рисунке 7A–B. Здесь N(t) обозначает накопленное число полных и субпроводимых событий с длительностью длиной времени t. Пунктирные линии обозначают распределения за время жизни отдельных реплик (n = 3 независимых DIB на условие), а сплошные вставки показывают глобальные экспоненциальные подгонки, выполненные с помощью программного обеспечения для подгонки нелинейных кривых. Панели A–D воспроизведены из Podar PT и др.,²⁵ и собраны для настоящей рукописи под редакцией CC BY-NC-ND 4.0. Авторские © права 2025 Автор(ы). Опубликовано PNAS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8: Исследование одноканального поведения — отслеживание текущего ответа для DIB в C16 после стимуляции PPF. (A) Пример токовой трассы 15 секунд, показывающий сырые данные (синий), отфильтрованный с помощью 8-полюсного низкочастотного фильтра Бесселя 250 Гц (красный) и идеализированной дорожкой (зелёной), используемой для идентификации состояний проводимости. Самый низкий стабильный уровень определяет базовое «закрытое» состояние. (B) Репрезентативные уровни субпроводимости, обнаруженные между^2-м и^3-м уровнями полной проводимости, подтверждённые чёткими промежуточными пиками в амплитудной гистограмме (см. рисунок 7A, оранжевый). Время пребывания проводимости извлекается из длительности каждого идентифицированного уровня проводимости (за исключением замкнутого состояния) для генерации распределений по продолжительности жизни N(t)/N(0). Воспроизведено из Podar PT и др.^{, 25} в разделе CC BY-NC-ND 4.0. Авторские © права 2025 Автор(ы). Опубликовано PNAS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

После PPF мембраны C12/C16 демонстрируют заметный сдвиг вправо в распределении амплитуд проводимости, что указывает на повышенную одноканальную проводимость, сопровождающуюся сдвигом влево в распределении срока службы проводимости, что соответствует сокращению времени открытия канала. Эти изменения соответствуют электромеханическому истончению двухслойного слоя C12/C16 во время PPF, что подтверждается прямыми механическими и толщиновыми измерениями, опубликованными в ссылке 25, которые снижают энергетический барьер для переноса ионов через gA и увеличивают пропускную способность ионов на отверстие, одновременно снижая стабильность канала. В отличие от этого, мембраны C16 демонстрируют минимальные изменения в обоих распределениях, что подчёркивает их ограниченную структурную адаптивность. Вместе эти результаты демонстрируют, что платформа DIB фиксирует как ансамбльные, так и одноканальные корреляты мембранной электромеханической адаптации, включая STP-подобные и LTP/LTD-подобные изменения ионной проводимости, возникающие в результате динамики, зависящей от состава мембраны (рисунок 8).

Discussion

На практике этот метод предоставляет три ключевые экспериментальные возможности: контролируемое изменение состава билейта через липидный состав и фазу масла, одновременный оптический и электрический мониторинг реструктуризации мембран, а также доступ к режиму площади мембран, объединяющему одноканальную электрофизиологию и мезомасштабную механику мембран 14,15,20,21,25. Эти особенности делают метод особенно полезным для исследований структуры и функций в упрощённых мембранных системах, где мембранная электромеханика, а не полная клеточная сложность, представляет интерес 14,15,20,21,25,39.

Этот протокол описывает сборку и анализ DIBs, легированных А-легированными грамицидином, в алкановых маслах для изучения способности липидных мембран к реструктуризации под физиологически значимой электрической^{стимуляцией} 14,15,25,35,38. По сравнению с методами^{патч-зажима 21}, платформа DIB анализирует патчи мембраны, которые на порядки больше, сохраняя при этом достаточное разрешение для фиксации отдельных событий ионного^канала 14,15,19,20,21,28,38 . Эта возможность особенно ценна для разрешения мезомасштабного электромеханического ремоделирования (например, электроувлажнения и электрокомпрессии) и связи её с микроскопическим поведением каналов, которые вместе порождают фенотипы мембранной проводимости STP, LTP и LTD под физиологической^{стимуляцией} 13,25,27,38 . Текущая система DIB не предназначена для воспроизведения молекулярной сложности биологических^{синапсов} 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Соответственно, такие термины, как STP, LTP, LTD, PPF и PPD, используются в описательном, аналогическом смысле для обозначения кратко- и долгосрочных увеличений и уменьшения мембранной ионной проводимости при определённых протоколах стимуляции. Основные результаты этой работы наиболее непосредственно интерпретируются с точки зрения мембранной электромеханики, адаптации проводимости и составно-зависимой неравновесной реструктуризации в DIB, что может предложить полезные концептуальные аналогии и физические перспективы синаптической пластичности, не подразумевая механистическую эквивалентность нейронным цепям или биохимической синаптической^{регуляции} 10,11,25,38.

Для достижения воспроизводимых результатов критически важны несколько технических шагов. Тщательная подготовка электрода Ag/AgCl, включая равномерное плавление серебряного сферического наконечника, тщательное хлорирование и тонкую, ровную агарозную оболочку, обеспечивает стабильное прикрепление капель и низкоимпедансную электрохимическую^{связь 20,35}. Визуальное подтверждение провисания капель и правильная ориентация электрода минимизируют оптические искажения во время видеозаписи и повышают точность измерений площади мембраны. Калибровка масштабов после приобретения с использованием известного диаметра серебряной проволоки обеспечивает надёжное преобразование пикселя в мм, что необходимо для надёжного вычисления площади мембраны и потока ионов. В этой работе мембранная проводимость (поток) определяется как ток на единицу площади (I/A), и поскольку изменения площади DIB при электроувлажнении, точная количественная оценка потока требует согласованных по времени измерений тока и площади^{бислоев (}13,25,27,35).

Этот подход также поддерживает дополняющие ансамблевые и одноканальные считывания на одной^{платформе 14, 15, 20, 25, 35, 38}. На ансамблевом уровне синхронизированные видео- и электрические записи количественно оценивают динамические изменения площади (электроувлажнение) и тока, из которых получается ионный поток (ток/площадь). При электрической стимуляции мембраны переходят в неравновесные стационарные состояния (NESS), где реструктуризация мембраны, зависящая от состава, приводит к кратковременной реакции, похожие на пластичность, которые могут эволюционировать в поведение, похожее на потенциацию или депрессию, с более длительным временем (минимум)25,26,28,29,30,31,32,^33,38. На уровне одного канала анализ предполагает идеализацию следов тока в пошаговые уровни проводимости (закрытые, одноканальные, многоканальные и субпроводимые). Традиционные инструменты идеализации квадратных волн обычно разрешают лишь ограниченное количество дискретных уровней; для более сложных или шумных данных предпочтительнее методы идеализации без моделей, такие как JSMURF^. Короткие удерживающие потенциалы постоянного тока, анализируемые с помощью JSMURF, обеспечивают статистически строгое обнаружение событий при гетерогенном шуме, обеспечивая гистограммы по проводимости-амплитуде (целочисленные и субпроводимые уровни) и распределения по продолжительности жизни N(t)/N(0). Наложение идеализированных и фильтрованных амплитудных гистограмм позволяет визуально и количественно проверять назначение состояний проводимости, а свёртные реконструкции (идеализированные следы, прошедшие через известный фильтр низких частот) подтверждают выбор параметров и точность событий³⁷.

Состав мембран, настроенный здесь через окружающую масляную фазу (например, C16 против C12/C16), ожидается, будет модулировать двуслойную вязкоэластичность и способность к реструктуризации под воздействием электрической стимуляции, что соответствует прямым измерениям, опубликованным в предыдущих^{работах} 22,25,39. Ожидается, что более гибкие мембраны будут демонстрировать более сильное истончение, вызванное EC, и улучшенное гидрофобное сопоставление с gA в течение^PPF 22,23,25, что приведёт к увеличению одноканальной проводимости и облегчения, что может стабилизироваться в виде поведения, похожего на ^{LTP 25,38}. Напротив, более жесткие мембраны демонстрируют ограниченную структурную реакцию, меньшие изменения проводимости при ППФ и ППД, а также склонность к LTD при длительном пульсировании. Эти результаты, зависящие от состава, подчёркивают, как свойства материала предрасполагают мембраны к различным, функционально значимым долгосрочным^{режимам} 22,23,25,39.

Платформа DIB также имеет важные ограничения²¹. Выдвинутая здесь механистическая интерпретация заключается в том, что различия в составе масла изменяют свойства двуслойного материала и восприимчивость к электромеханической реструктуризации, которая, в свою очередь, модулирует проводимость граммицидина^A 22,23,25. Эта интерпретация подтверждается предыдущим исследованием, которое напрямую измеряло вязкоэластичность мембраны, межфейсное натяжение, а также динамические изменения толщины мембраны при этих условиях мембраны и^{стимуляции 22}. Однако в данной работе эти свойства материала не измерялись одновременно в каждом эксперименте, поэтому используются здесь для поддержки различных структурных и механических реакций на электрическую стимуляцию мембран в средах C16 и C12/C16, а не для самостоятельного установления механистической интерпретации данных. Кроме того, ансамбльный ток и поток могут отражать как изменения проводимости одного канала, так и изменения количества проводящих каналов, которые могут изменяться в зависимости от площади мембраны, диффузии пептида и димеризации при неравновесных^{условиях} 17,18,22,23. Окружающая фаза масла также может динамически инфильтровать или отступать от двухслойного ядра во время стимуляции, способствуя базовому дрейфу в одноканальных записях и постепенным изменениям состава мембраны со^{временем} 13,21,25. В совокупности эти факторы ограничивают использование длительных записей постоянного напряжения для определения статических свойств мембран и подчёркивают, что DIB ведут себя как открытые, динамические системы, а не как закрытые равновесные^{мембраны} 13,21,25. Таким образом, хотя текущий протокол фиксирует зависящие от стимуляции, пластичные изменения проводимости в течение предполагаемых экспериментальных^{временных масштабов 25,38}, будущие исследования, сочетающие прямые механические измерения с одновременными электрическими и оптическими записями, возможно, наряду с флуоресценционной одномолекулярной визуализацией, будут необходимы будущие исследования, которые будут более полно выяснить вклад реструктуризации мембраны, проводимости каналов и популяции каналов^21,25.

Распространённые способы отказа включают нестабильное прикрепление капель, неполное провисение капли, преждевременное слияние капель при формировании двуслойных слоёв и плохое оптическое определение края бислоя при анализе площади. Нестабильное прикрепление капель часто вызвано неправильной геометрией серебряного шара или неравномерным покрытием агарозы и может быть уменьшено при проверке симметрии шара и поддержании гладкой агарозной раковины. Загрузка электродов также требует ручного отложения водных капель размером с нанолитр на субмилиметровую головку электрода, что требует значительной координации рук и глаз и восприятия глубины по средам с разными показателями преломления (воздух против масла). В результате наконечник пипетки может случайно коснуться оболочки агарозы или промахнуться мимо головки электрода во время дозирования. Техники повышения устойчивости, такие как крепление запястья, медленное продвижение пипетки в масле и задержка дыхания, вместе с повторяющейся практикой, могут повысить навыки нагрузки. Кроме того, неполное провисение или задержка образования монослоя могут быть вызваны гетерогенностью везикул, изменением температуры или агазозной топографией и могут быть улучшены за счёт увеличения времени ожидания после капельного^{отложения} 15,20,35. Коалесценция при формировании двуслойных слоёв часто связана с избыточной площадью контакта или чрезмерно агрессивной электрической стимуляцией (> ± 200 мВ) и может быть смягчена использованием меньших начальных зон контакта с каплями, что даёт дополнительное время для стабилизации монослоя и проверяет ёмкость низкоамплитудного треугольного волнового ответа перед^{пульсированием} 25,35,38.

Несмотря на эти ограничения, платформа DIB высоко настраиваема, масштабируема и^{воспроизводимается} 14,15,20,21,25,35,38,40 и дополняет белок-центричную электрофизиологию, выделяя вклад липидной механики в ^{проводимость} 22,23,25 . Объединяя ансамблевые и одноканальные измерения в одной системе, этот протокол предоставляет практический путь для анализа того, как электрическая работа и вязкоупругость мембраны сочетаются для создания синаптического проводящего поведения (STP-подобных, LTP-подобных и LTD-подобных реакций) в контролируемой, снизу вверх модели 25,29,30,31,32,33,38. Таким образом, методология служит основой для систематического изучения правил обучения, зависящих от состава, в мембранах и для количественной оценки того, как механические и электрические силы связывают мембранные белки с их бислоем-носителем на временных и пространственных^{масштабах} 21,22,23,25 . В совокупности эти возможности позиционируют DIB как мощную основу для деконструкции сложных нейробиологических поведения на управляемые, проверяемые биофизические^{механизмы} 10,11,25,38.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-дифитаной-сн-глицеро-3-фосфохолин (DPhPC)	Avanti Polar Lipids	850356P/850356C	Приобретается в виде лиофилизированного порошка (P) или в хлороформе (C)
Agarose	Сигма-Олдрич	A9539
Агароза (таблетки агарозы 0,5 г)	Бенчмарк	A2501	Вы можете использовать либо порошковую форму, либо таблетки
Генератор волновых форм Agilent Technologies 33522A;	Keysight	–	Можно использовать любой генератор сигналов с выходами BNC-кабеля
Аргон (Ar) газ	Airgas	AR UHP300; 72-402221259-1	Argon Compressed; Сверхвысокая чистота
Аналитический баланс	Меттлер Толедо	Модель: MS304S/03	Любой лабораторный аналитический баланс с точностью 0,0001 г
Усилитель Axopatch 200B	Молекулярные устройства	–
BK Precision 4017B 10 МГц DDs Sweep/Function Generator	Digi-Key	BK4017B-ND
Боросиликатные стеклянные капилляры	World Precision Instruments	1B100F-4
Программный пакет Clampex pCLAMP 11	Молекулярные устройства	–
Система DigiData 1550B	Молекулярные устройства	–	Это включает мини-экструдер, 2 шприца, 100 ПК-мембран, 100 опор фильтров и 1 держатель/нагревательный блок
Додекана — 99%	Сигма-Олдрич	112-40-3
Комплект экструдера с держателем/нагревательным блоком	Avanti Polar Lipids	610000
Фиджийское программное обеспечение	ImageJ	–
Морозильник (-80 и градус; C)	Fisher Scientific	Isotemp; Модель: 8964; З/н: 828278-21
Стеклянная посуда	VWR International	–
Gramicidin-A	Миллипор Сигма	368020
Гексадекан, 99%	Сигма-Олдрич	544-76-3
Устранитель шума Hum Bug (60 Гц)	A-M Systems	726300
Система инвертированного микроскопа (Nikon Ti2-A)	Nikon	–	Можно использовать любой перевёрнутый или вертикальный микроскоп
Изопропиловый спирт	VWR International	BDH1133-4LP
Держатель микроэлектрода	World Precision Instruments	MEH1S
Микроманипуляторы	Инструмент Саттера	MP-285	Могут использоваться ручные манипуляторы
Микроскопическая камера	Олимп	DP74
Microsoft Excel	Microsoft	–
MOPS	Сигма-Олдрич	M1254
Программное обеспечение камеры микроскопа NIS-Elements	Nikon	–	Может использоваться программное обеспечение для захвата камеры с возможностью живого просмотра и/или видео. В качестве замены видеозахвата могут использоваться прямой эфир и одновременная запись экрана.
Универсальная лабораторная плёнка Parafilm M	Парафильм	PM999
Чашка Петри	-	-	Тарелка должна быть прозрачной снизу и, желательно — боковой стенки
Хлорид калия (KCl)	Сигма-Олдрич	P3911
Мягкие перчатки для исследования нитрила без порошка;	VWR International	CA89-38-272
Рефрижиратор (4 и °; C)	Fisher Scientific	CAT NO: 97-938-1; Модель NO: 3556FS
Серебряная проволока	GoodFellow	147-346-94
Горячая плита для перемешивания	Thermo Scientific	SP131325