Методическая статья

Выделение отдельных клеток из ранних эмбрионов Xenopus и их сортировка по размеру

DOI:

10.3791/70630

⸱

20 марта 2026 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем метод выделения отдельных клеток из ранних эмбрионов Xenopus laevis и их сортировки по размеру клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ранний эмбриогенез требует экспоненциального уменьшения размера клеток, тогда как эмбрион остаётся постоянным на самых ранних стадиях развития. Функциональная значимость и механизмы, с помощью которых размер клетки влияет на развитие эмбрионов, до сих пор в значительной степени недостаточно изучены. Ранний эмбрион Xenopus предоставляет уникальную систему для устранения этих основных пробелов. По сравнению с другими модельными организмами, ранний эмбрион Xenopus чрезвычайно крупен и содержит градиент размером клетки — от мелких клеток на полюсе животного до больших клеток на вегетальным полюсе, по всему эмбриону на стадиях около перехода средней бластулы. Здесь мы описываем протокол для диссоциации отдельных клеток от ранних эмбрионов Xenopus и их сортировки по размеру с помощью клеточных сита с разным размером пор сетки. Как определяется с помощью визуализации и измерений размера, отсортированные ячейки находятся в ожидаемом диапазоне размеров и могут использоваться для анализа или секвенирования живых клеток, либо фиксироваться для визуализации. Эта система прольёт новый свет на выявление регулирующих механизмов, зависящих от размера, на ранних этапах развития.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изменение размера клеток — распространённая особенность раннего эмбриогенеза, когда оплодотворённая яйцеклетка проходит несколько этапов расщепления, что приводит к увеличению числа клеток. Хотя много известно о роли размера клетки как основного параметра, контролирующего функцииклетки 1,2,3, то, как размер клетки влияет на раннее развитие, менее известен. Недавние исследования различных моделей эмбриональных систем показывают, что размер клетки регулирует активацию зиготного генома (ZGA)4 и спецификацию судьбыклеток 5, что поддерживает важную роль размера клетки в решениях оразвитии 6,7.

Ранний эмбрион Xenopus является важной моделью для изучения принятия решений в развитии, регулируемого размером клеток. Поскольку ранний эмбрион Xenopus крупный (~1,2 мм в диаметре), его размер легко физически изменять, что делает его полезным для оценки прямых последствий изменения размера клеток. Например, мини-эмбрионы разных размеров могут быть созданы путём суждения 1-клеточных эмбрионов с помощью волосяныхпетель 4,8, демонстрируя дозозависимуюZGA 4. Кроме того, ранний эмбрион Xenopus содержит градиент размеров клеток вдоль оси животно-растительность, с наименьшими клетками на животном полюсе и крупнейшими на вегетальным полюсе, что демонстрирует более чем 100-кратную разницу втом 4. Важно, что, напрямую визуализируя и количественно оценивая зарождающиеся транскрипты в отдельных клетках эмбрионов целого маунта, мы определили порог размера клетки, регулирующийZGA 4. Кроме того, выделение отдельных клеток из ранних эмбрионов Xenopus и их сортировка по размеру подтвердили важность порога размера клеткиZGA 4.

Здесь мы описываем подробные процедуры выделения отдельных клеток из ранних эмбрионов Xenopus laevis и их сортировки по размеру. Ранние эмбрионы Xenopus могут быть диссоциированы на отдельные клетки, инкубировав их в среде Ca2+, Mg2+-свободной среде (CMFM)9, а эти отдельные клетки могут быть дополнительно сортированы с помощью клеточных сита с разным размером пор сетки. Отсортированные клетки могут быть очищены и использованы в различных областях, включая анализ живых клеток, секвенирование или визуализацию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанные здесь работы с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Южной Каролины.

1. Подготовка раствора

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом протокола подготовьте следующие решения.

  1. Приготовьте 20× MMR: смешайте 100 мМ HEPES, 2 мМ EDTA, 2 М NaCl, 40 мМ KCl, 20 мМ MgCl2 и 40 мМ CaCl2. Отрегулируйте pH до 7.8 с NaOH. Автоклав и хранение при комнатной температуре.
  2. Приготовьте Ca2+, Mg 2+-свободную среду (CMFM): смешать 50,3 мМ NaCl, 0,7 мМ KCl, 9,2 мМ Na2HPO 4, 0,9 мМ KH2PO4, 2,4 мМNaHCO 3 и 1,0 мМ EDTA. При необходимости отрегулируйте pH до 7,4. Автоклав и хранение при комнатной температуре.
  3. Приготовьте гель агарозы 1,5% в чашке Петри диаметром 60 мм: добавьте 0,75 г агарозы на 50 мл CMFM. Нагрейте, чтобы агароза растворилась в микроволновой печи. Добавьте 5-10 мл агарозного геля, чтобы покрыть тонкий слой в чашке Петри толщиной 60 мм.
  4. Подготовьте среду с градиентом плотности 15% (масса/объём)/CMFM: Медленно добавьте 15 г среды с градиентом плотности в 100 мл CMFM. Для облегчения растворения нагревайте и перемешивайте на тарелке, пока среда градиента плотности полностью не растворится. Держите раствор при 4 °C до использования.
  5. Приготовьте 4% PFA/1× MEM: смешайте 1 флакон (10 мл) 16% параформальдегида и 4 мл 10× MEM (1000 мМ MOPS pH 7,4, 20 мМ EGTA и 10 мМMgSO 4). Добавьте ультрачистую воду до 40 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения эмбрионов Xenopus следует стандартному протоколу проведения экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) (например, см. Sive et al., 2007)10. Эмбрион должен быть готов к использованию в 0,1× MMR.

2. Диссоциация ранних эмбрионов на отдельные клетки

  1. Добавьте ~15 мл CMFM в новую чашку Петри диаметром 60 мм, покрытую гелем 1,5% агарозы. Используйте пластиковую трансферную пипетку, чтобы переместить в чашу 10-100 эмбрионов (в зависимости от экспериментальных потребностей). Поставьте тарелку под стереомикроскоп.
  2. Используйте пинцет обеих рук, чтобы аккуратно удалить мембрану вителлина, захватывая её одним пинцетом и снимая другой. Избегайте повреждения эмбрионов во время процесса.
  3. Инкубировать девителлинированные эмбрионы в CMFM в течение ~1 часа при комнатной температуре. Очень аккуратно встряхивайте блюдо каждые 5 минут, чтобы облегчить диссоциацию клеток. Регулярно проверяйте, пока не видно ни одной кучи бластомеров (рисунок 1).

3. Сортировка диссоциированных клеток по размеру

  1. Во время диссоциации бластомеров погрузите клеточные красители (40 мкм, 70 мкм и 100 мкм) в отдельные чашки Петри, заполненные CMFM (рисунок 2). Разместите блюда в порядке слева направо, как указано. Также добавьте ещё две тарелки с CMFM между группами для краткого мытья клеточных красилок при каждой сортировке.
  2. Аккуратно покрутите блюдо с отдельными одиночными бластомерами, чтобы обогатить их в центре. Аккуратно перенесите бластомеры в 40-мкм красилку в CMFM.
  3. Аккуратно потрясите сито несколько раз, чтобы бластомеры < 40 мкм осели через сито. Затем быстро переместите сито 40 мкм в чашу с CMFM для краткой промывки. Аккуратно переместите бластомеры в ситечке диаметром 40 мкм, которое > 40 мкм, в ситечко диаметром 70 мкм.
  4. Повторяйте шаги, пока бластомеры не будут отсортированы в сите 100 мкм.
  5. Аккуратно перемешайте каждое блюдо с сортированными бластомерами, чтобы обогатить их в центре. Аккуратно переместите бластомеры (~4 мл) на верхнюю часть среды с градиентом плотности 15% в флуоресцентно-активной трубке для сортировки клеток (FACS) (рисунок 3). Избегайте смешивания.
  6. Дайте трубке постоять 10 минут. Целые бластомеры оседают на дно под действием силы тяжести, отделяясь от желтковых шаров от взрывных бластомеров во время сортировки и переноса (см. рисунок 3).
  7. В зависимости от целей дальнейших экспериментов следует провести анализ живых клеток, заморозить бластомеры в жидком азоте для работы с РНК или закрепить бластомеры для иммунного окрашивания (рисунок 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбрионы Xenopus laevis (n = 50) на 9-й стадии инкубировали в среде CMFM для диссоциации в отдельные бластомеры по этому протоколу (см. пример на рисунке 1). Диссоциированные одиночные бластомеры сортировались последовательно с использованием фильтров ячеек 40 мкм, 70 мкм и 100 мкм, как описано выше. Неотсортированная контрольная смесь и отсортированные одиночные бластомеры фиксировались в 4% параформальдегиде и сфотографировались под яркопольным ми...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Размер клетки имеет фундаментальное значение дляклеточных функций 3, и его влияние на раннее развитие требует более тщательного анализа в модельных эмбриональных системах. Здесь мы описали детали выделения отдельных клеток из ранних эмбрионов Xenopus laevis и сортировки клеток по размеру с помощью клеточных ситеток, что может быть применимо для изучения размера клеток. Этот метод позволил нам предоставить прямые доказательства активации зиготических генов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор заявляет, что нет конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить лабораторию Мэттью Гуда в Университете Пенсильвании за обучение. Эта работа частично поддерживалась Национальным институтом здоровья детей и развития человека имени Юнис Кеннеди Шрайвер (R03HD105802).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16% параформальдегид (PFA)EMS15710-СЗа создание фиксирующего раствора
60 мм одноразовые чашки ПетриVWR25384-092Для инкубационных эмбрионов
Стереомикроскопы ACCU-SCOPE 3075 ZoomVWR470351-130Для визуализации эмбрионов
АгарозеСигма-ОлдричA-9414Для покрытия чашек Петри
Cell Strainer, 100 & micro; mVWR76327-102Для сортировки ячеек по размеру
Cell Strainer, 40 & micro; mVWR76327-098Для сортировки ячеек по размеру
Cell Strainer, 70 & micro; mVWR76327-100Для сортировки ячеек по размеру
Одноразовые трансферные пипеткиVWR414004-035Для переноса эмбрионов
Пинцет Dumont, стиль 5Науки об электронной микроскопии72701-DДля удаления вителлиновой мембраны
стеклянная чаша Петри, 60 и раз; 15 ммVWR75845-542Для инкубационных эмбрионов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. Cell biology. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075(2015).
  2. Xie, S., Swaffer, M., Skotheim, J. M. Eukaryotic cell size control and its relation to biosynthesis and senescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 38, 291-319 (2022).
  3. Chadha, Y., Khurana, A., Schmoller, K. M. Eukaryotic cell size regulation and its implications for cellular function and dysfunction. Physiol Rev. 104 (4), 1679-1717 (2024).
  4. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  5. Hubatsch, L., et al. A cell size threshold limits cell polarity and asymmetric division potential. Nat Phys. 15 (10), 1075-1085 (2019).
  6. Fung, H. F., Bergmann, D. C. Function follows form: How cell size is harnessed for developmental decisions. Eur J Cell Biol. 102 (2), 151312(2023).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  9. Venkataraman, T., Dancausse, E., King, M. L. PCR-based cloning and differential screening of RNAs from Xenopus primordial germ cells: Cloning uniquely expressed RNAs from rare cells. Methods Mol Biol. 254, 67-78 (2004).
  10. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи