Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Многолокусное секвенирование для типирования штаммов Toxoplasma gondii

265 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70645

⸱

26 мая 2026 г.

 , 
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, New Valley University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол быстрого выявления и генотипирования штаммов Toxoplasma gondii с помощью портативного нанопорного секвенирования выбранных генетических маркеров, что позволяет масштабироваться, целенаправленно определять штамм в лабораторно поддерживаемых изолятах с возможным будущим применением в условиях наблюдения.

Аннотация

Toxoplasma gondii — это глобально распространённый апикомплексный паразит, характеризующийся значительным генетическим разнообразием, что требует точных молекулярных подходов к различению штамм. Цель этого протокола — создать воспроизводимый рабочий процесс для целевого многолокусного генотипирования культивированных изолятов T. gondii . Процедура включает in vitro распространение репрезентативных штаммов типа I (RH) и II (ME49), экстракцию геномной ДНК, локусоспецифическую амплификацию генов SAG2 и SAG3 , а также анализ на основе секвенирования для обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) и событий вставки/делеции (INDEL). Данные секвенирования обрабатываются для создания высокодоверенных консенсусных последовательностей и проведения сравнительного выравнивания для идентификации специфических для деформации полиморфизмов. Применение этого рабочего процесса к архетипическим штаммам показало высокую эффективность картирования, стабильную глубину чтения между целевых локусами и точное восстановление ожидаемых размеров ампликонов, что подтверждает надёжное обнаружение генетической вариации на уровне локуса. Хотя комплексное присвоение генотипов требует включения дополнительных стандартизированных маркеров, этот протокол обеспечивает масштабируемую и воспроизводимую основу для целенаправленной генетической характеристики лабораторно поддерживаемых изолятов T. gondii и поддерживает последовательный многолокусный анализ последовательностей.

Введение

Toxoplasma gondii — это глобально распространённый апикомплексный паразит и крупная пищевая и водная зоонозная угроза, способная заразить практически всех теплокровных животных, при этом кошачьи являются основнымихозяевами 1. Инфекция у человека и животных обычно возникает при проглатении тканевых кист или спорулированных ооцистов, а способность паразита чередоваться между стадиями тахизоита и брадизоита обеспечивает длительное сохранение в нервных и мышечных тканях, способствуя передаче как через мясо, так и черезокружающую среду 2,3.

Хотя в Европе и Северной Америке доминируют три клональные линии (типы I, II и III), обширное генетическое разнообразие, включая атипичные и рекомбинантные штаммы, было зафиксировано по всему миру, особенно в регионах с богатыми резервуарами дикойприроды 4. Точная дискриминация по штаммам необходима для выяснения динамики передачи, изучения вспышек и понимания региональной эпидемиологии. Традиционные подходы к генотипированию, такие как PCR-RFLP, типирование последовательностей на основе Сэнгера (MLST) и микросателлитный анализ, существенно способствовали пониманию структуры популяции T. gondii , но ограничены по разрешению, пропускной способности и способности обнаруживать вариации внутригенотипов. Эти подходы часто требуют нескольких отдельных реакций и могут не обнаруживать вставки, делеции или сложные гаплотипы внутри полиморфныхлокусов 1. Секвенирование следующего поколения с коротким чтением (NGS) улучшило обнаружение редких вариантов, но остаётся ограниченным в выявлении сложных структурныхизменений 4.

Платформы секвенирования с длинным чтением, особенно Oxford Nanopore Technologies, теперь предлагают возможность генерировать непрерывные высокоточные считывания, подходящие для разрешения структурных вариантов и высокополиморфныхлокусов 5. Их портативность, возможности анализа в реальном времени и совместимость с рабочими процессами на основе ампликонов делают их перспективными инструментами для полевых применений и расследования вспышек6. Несмотря на эти преимущества, стандартизированные многолокусные рабочие процессы с длинным чтением для рутинного генотипирования T. gondii остаются ограниченными.

Для устранения этого пробела мы создали масштабируемый рабочий процесс секвенирования ампликонов с длинным чтением, ориентированный на два полиморфных локуса (см. рисунок 1). В сочетании с консенсусной доработкой и конвейером вызова вариантов этот подход обеспечивает точное обнаружение SNP и INDEL, поддерживая различие на уровне деформации. Протокол подходит для лабораторий, оснащённых для амплификации ПЦР и секвенирования с длинным чтением, и был валидирован с использованием культивированных изолятов. Хотя адаптация к первичным клиническим или экологическим образцам может быть осуществима, такие приложения требуют дополнительной оптимизации и валидации. В целом, этот рабочий процесс обеспечивает структурированную основу для целенаправленной молекулярной характеристики и может поддерживать эпидемиологические исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В этом исследовании использовались проверенные лабораторные штаммы паразитов и коммерчески полученные линии человеческих фибробластных клеток. Напрямую не участвовали ни люди, ни животные.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если не указано иное, буферы и реагенты, используемые в этом протоколе, поставляются в коммерческих комплектах, перечисленных в Таблице материалов.

1. Выбор биомаркеров

  1. Скачайте геномные последовательности SAG2 и SAG3 в формате FASTA из геномной базы данных ToxoDB (https://toxodb.org/toxo/app).
  2. Выполните парные выравнивания последовательностей с помощью EMBOSS Water (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water).
  3. Выберите области ампликона ≤1 600 пар оснований (bp) для минимизации времени секвенирования и обеспечения эффективного усиления ПЦР.
  4. Убедитесь, что каждая область содержит информативные SNP или полиморфизмы INDEL для дифференцировки деформаций.

2. Выращивание и сбор Toxoplasma gondii tachyzoites

  1. Поддержание культур клеток хозяина
    1. Получите фибробласты человеческой крайней плоти (HFF) из сертифицированного коммерческого источника и культивируйте их в полноценной среде для роста, состоящей из модифицированной среды Eagle Medium от Dulbecco, дополненной 10% сывороткой плода бычьего скота и 1% пенициллин-стрептомицином.
    2. Инкубировать культуры при 37 °C с 5% CO₂ в увлажнённом инкубаторе.
  2. Обслуживание и расширение паразитических линий.
    1. Инфицировать монослои фибробластов при слиянии 80–90% с использованием тахизоитов при множественном уровне инфекции 1–3 паразита на клетку хозяина. Для колбы T25, содержащей примерно 1 ×10 6 фибробластов, добавьте 1–3 × 106 тахизоитов.
    2. Ежедневно исследуйте культуры с помощью инвертированного светового микроскопа с увеличением 20× или 40×. Идентифицируйте лизис клеток хозяина, наблюдая масштабное нарушение монослойных слоёв.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте культуры фибробластов после раздела 20, чтобы избежать артефактов, связанных с культурой.
    3. Сбор тахизоитов.
      1. Собирайте культуры, когда видно ≥90% лизисирования клеток хозяина.
      2. Центрифуга при 1 300 × г в течение 10 минут при 4 °C.
      3. Повторно суспензировать гранулу в 10 мл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора с помощью мягкой пипеты и снова центрифугировать при 1 300 × г в течение 10 минут при 4 °C. Повторите ещё раз.

3. Извлечение геномной ДНК и генерация ампликонов

  1. Экстракция геномной ДНК с помощью набора для очистки геномной ДНК на основе кремнеземныхколонок 7. Элютная ДНК в буфере элюции 50 мкл.
  2. Измеряйте концентрацию ДНК с помощью микрообъёмного спектрофотометра.
  3. Храните ДНК при 4 °C для краткосрочного хранения или при −20 °C для длительного хранения.
  4. Подготовьте ПЦР-реакции с использованием мастер-смеси ДНК-полимеразы высокой точности, локусоспецифических праймеров (дополнительная таблица 1) и воды без нуклеазы.
  5. Выполнить усиление ПЦР с помощью калиброванного теплового циклера при следующих циклических условиях: (a) начальная денатурация при 98 °C в течение 30 с, (b) 35 циклов при 98 °C в течение 10 секунд; специфическая для локуса отжиг: 60 °C для SAG2, 68 °C для SAG3, 30 с; 72 °C в течение 20 секунд, (c) Окончательное удлинение: 72 °C на 2 минуты.
  6. Проверьте продукты ПЦР с помощью электрофореза на геле с 1,5% агарозой.
  7. Очищайте продукты ПЦР с использованием системы очистки ПЦР и гелевого экстракция в колонках согласно инструкциямпроизводителя 8. Элютная ДНК в буфере элюции 15–20 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность и выход ПЦР могут снижаться из-за низкого качества шаблона ДНК, концентрации или неоптимальных условий реакции. Если выход ампликона низок, проверьте целостность шаблона ДНК с помощью электрофореза агарозного геля, а также концентрацию и чистоту с помощью спектрофотометра. Температуры отжига ПЦР и концентрации праймеров также должны быть оптимизированы для используемых пар праймеров, а количество цикла ПЦР по мере необходимости увеличивать.

4. Подготовка библиотеки к секвенированию длинного чтения

  1. Ремонт концов и dA-tailling
    1. Разморозьте все реагенты и тщательно перемешайте с помощью вихря. Разведите контрольный образец ДНК с помощью буфера элюции 10,5 мкл только при первом использовании и храните его на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда тщательно прорабатывайте магнитные шарики вихря перед каждым использованием.
      ВНИМАНИЕ: Не закручивайте смесь ферментов для подготовки к концу; Аккуратно перемешайте пипеткой.
    2. Пипетте по 200 фмоль (~130 нг для фрагмента 1 кб) каждого образца ДНК в ПЦР-пробирки объёмом 0,2 мл и регулируйте объём до 11,5 мкл с использованием безнуклеазной воды.
    3. Добавьте 1 мкл разбавлённого контрольного образца ДНК в пробирку и перемешайте с помощью пипетирования 10–20 раз.
    4. Приготовьте мастер-смесь для конечной подготовки для каждого образца, содержащая 1,75 мкл реакционного буфера и 0,75 мкл ферментной смеси (включая 5% избытка).
    5. Добавьте 2,5 мкл мастер-микса в каждый образец, аккуратно перемешайте и ненадолго прокрутите вниз.
    6. Инкубировать в тепловом циклере при 20 °C в течение 5 минут, затем при 65 °C в течение 5 минут.
  2. Очистка конечно подготовленной ДНК
    1. Перенесите реакцию 15 мкл в микроцентрифугную трубку с низким содержанием 1,5 мл.
    2. Добавьте 15 мкл перевзвешенных магнитных шариков, аккуратно перемешайте и коротко покрутите.
    3. Инкубировать образцы на ротаторном миксере в течение 5 минут при комнатной температуре.
    4. Приготовьте свежий 80% этанол для стирки.
    5. Поместите трубки на магнитную решетку, пока шарики не сломаются, и аккуратно снимите супернатант.
    6. Мойте шарики дважды с 200 мкл 80% этанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте шарикам полностью размножиться, затем аккуратно удалите этанол.
    7. Бусины на воздухе в течение ~30 с; Избегайте чрезмерного высыхания, чтобы избежать трещин.
    8. Суспензировать шарики в воде без нуклеазы 10 мкл и инкубировать 2 минуты при комнатной температуре.
    9. Поместите трубки на магнитную стойку и перенесите 10 мкл в чистую микроцентрифугу с низким уровнем связывания ДНК.
    10. Измерять концентрацию ДНК с помощью 1 мкл на спектрофотометре.
  3. Родное штрихкодирование
    1. Мастер-микс Thaw Blunt/TA Ligase, EDTA, буфер коротких фрагментов (SFB) и родные штрихкоды (NB01–NB24).
    2. Присваивать отдельные штрихкоды образцам 1–24.
    3. Собрать реакцию штрих-кодирования из 7,5 мкл ДНК, подготовленной на конце, 2,5 мкл родного штрих-кода и 10 мкл Blunt/TA Ligase Master Mix
    4. Тщательно перемешивайте, пипетируя 10–20 раз.
    5. Инкубировать 20 минут при комнатной температуре и завершить реакцию с помощью 4 мкл ЭДТА, тщательно перемешать с помощью пипетирования и ненадолго открутить вниз.
    6. Сгруппировать штрих-коды образцов в микроцентрифугную трубку с низким содержанием ДНК объёмом 1,5 мл. Добавьте магнитные шарики с размером 0,4× общий объём образца (например, добавьте 230 мкл шариков к 575 мкл объединённой ДНК). Тщательно перемешайте с помощью пипетки, затем инкубуйте на ротаторном миксере при комнатной температуре в течение 10 минут.
    7. Промой шарики 700 мкл буфера коротких фрагментов (SFB). Щёлкните бусинами, чтобы они подвесили, затем опустите пробу вниз, затем верните образец на магнитную стойку и дайте шарикам рассеяться. Снимите буфер с помощью пипетки, затем выбросьте его.
    8. Повторите предыдущий шаг.
    9. Закрутите трубку вниз и поставьте трубку обратно на магнитную стойку. Уберите остатки буфера.
    10. Снимите трубку с магнитной стойки и снова подвесьте гранулу в воде без нуклеазы 35 мкл, аккуратно щелкнув.
    11. Инкубировать при 37 °C в течение 10 минут с периодическим смешиванием, затем перенести элуат в чистую микроцентрифугу с низким уровнем связывания ДНК.
  4. Лигирование адаптеров и очистка библиотеки
    1. Собрать реакцию лигации с 30 мкл объединённой штрихкодированной ДНК, 5 мкл нативного адаптера, 10 мкл буфера лигации (5×) и 5 мкл T4 ДНК-лигазы.
    2. Тщательно перемешайте реакцию, аккуратно пипетирая и ненадолго вращая вниз. Инкубировать реакцию в течение 20 минут при комнатной температуре.
    3. Добавьте в реакцию 20 мкл вновь суспензированных магнитных шариков и перемешайте с помощью пипетки. Инкубировать на ротаторном миксере 10 минут при комнатной температуре.
    4. Прокрутите образец и шарики на магнитной стойке. Держите трубку на магните, а пипетку — на супернатанте.
    5. Промывайте бусины, добавив 125 мкл Short Fragment Buffer (SFB). Щёлкните бусинами, чтобы они снова подвесили, затем опустите трубку, затем верните трубку на магнитную стойку и дайте бусинам рассеяться. Удалите супернатант с помощью пипетки, затем сбросьте его.
    6. Повторите предыдущий шаг.
    7. Вращайте трубку вниз и возвращайте трубку на магнит. Пипетки с любого остаточного супернатанда. Вынимите трубку из магнитной стойки и снова подвесите гранулу в 15 мкл элюсионного буфера (EB).
    8. Опустите вращение и инкубировать 10 минут при 37°C. Перемешивайте образец каждые 2 минуты, аккуратно перелистывая 10 секунд, чтобы стимулировать элюцию ДНК.
    9. Нанесите шарики на магнит, пока элюат не станет прозрачным и бесцветным, не менее 1 минуты.
    10. Удалить и удерживать 15 мкл элуата с библиотекой ДНК в чистой микроцентрифуге с низким уровнем связывания ДНК объемом 1,5 мл.
    11. Количественно определите итоговую библиотеку с помощью спектрофотометра.

5. Подготовка потоковых элементов и секвенирование нанопор

  1. Подготовка потоковых элементов
    1. Осмотрите потоковую ячейку и подтвердите наличие ≥80 активных пор.
    2. Приготовьте грунтовую смесь, смешав 117 мкл раствора промывки с 3 мкл раствора троса в микроцентрифуге для общего объёма 120 мкл. Аккуратно перемешайте пипеткой, чтобы избежать появления пузырьков воздуха. Медленно загружайте всю смесь для запуска 120 мкл в порт проточной ячейки, чтобы при загрузке не появлялись пузырьки воздуха.
  2. Загрузка и секвенирование библиотеки
    1. Подготовьте микс секвенирования, объединив 15 мкл буфера секвенирования (SB), 10 мкл библиотечных шариков (LIB) и 5 мкл библиотеки ДНК. Аккуратно перемешивайте, поднимая и опуская 3–5 раз, чтобы избежать появления пузырей. Полученная смесь секвенирования 30 мкл готова к загрузке или может быть отрегулирована до 45 мкл при необходимости.
    2. Медленно загружайте 30–45 мкл секвенирующей смеси в порт образца потоковой ячейки, заливая раствор по капле.
      ВНИМАНИЕ: Избегайте появления пузырьков воздуха и не позволяйте кончику пипетки касаться мембраны. Плотно закройте порт загрузки после разлива.
    3. Начните секвенирование с включённым вызовом баз в реальном времени и отслеживайте активность пор.
    4. Продолжайте секвенирование до достижения ≥500× покрытия на ампликон (рекомендуемое ≥1000×), чтобы обеспечить достаточную глубину считывания для точного вызова базы, надёжную генерацию консенсусных последовательностей и уверенное обнаружение низкочастотных вариантов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если заметно низкое покрытие секвенирования, обеспечьте высококачественный вход ампликонов при необходимой концентрации, достаточные поры активных потоковых ячеек и продлите секвенирование для достижения рекомендуемого покрытия.

6. Обработка данных и анализ вариантов

  1. Вызов баз и демультиплексирование
    1. Выполнять высокоточный вызов баз с использованием программного обеспечения для вызова баз, связанного с платформой, с настройками высокой точности по умолчанию для генерации файлов FASTQ на выборку. Демультиплекс читает по штрихкоду и сохраняет только чтения, проходящие фильтры контроля качества.
  2. Отображение чтения и обработка BAM
    1. Скачайте эталонную сборку генома Toxoplasma gondii GCF_000006565.2 (TGA4) из базы данных геномов Национального центра биотехнологической информации (NCBI). Экстракт хромосомы VIII (NC_031476.1) для анализа SAG2 и хромосомы XII (NC_031480.1) для анализа SAG3 . Индексируйте эталонные последовательности с помощью SAMtools и генерируйте индекс выравнивания с помощью конструктора индексов выравнивания длинного чтения.
    2. Map считывается в индексируемый эталонный геном с помощью алгоритма выравнивания с длинным чтением, оптимизированного для данных секвенирования нанопор (например, предустановленный для отображения с длинным чтением; -ax map-ont).
    3. Преобразуйте вывод выравнивания в формат BAM, сортируйте и индексируйте BAM-файлы с помощью SAMtools. Добавляйте информацию о группе чтения в каждый файл BAM с помощью инструментов Picard. Рассчитывайте среднее покрытие на локус с помощью статистики глубины и генерируйте статистику картирования с помощью метрик flagstat.
  3. Генерация консенсусной последовательности
    1. Генерировать консенсусные последовательности на ампликон с помощью алгоритма полировки консенсуса на основе нейронных сетей с параметрами по умолчанию. Экспорт консенсусных последовательностей в формате FASTA для дальнейшего анализа.
    2. Выполнять выравнивание на основе справок и сравнительный анализ последовательностей с использованием общедоступных геномных баз данных. Визуализируйте выравнивания и полиморфные позиции с помощью программного обеспечения для визуализации генома.
  4. Вариантные вызовы
    1. Выполнять обнаружение вариантов с помощью алгоритма вызова вариантов на основе консенсуса. Отделить однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и события вставки/удаления (INDEL) с помощью инструментов выбора вариантов (Дополнительный файл 1).
    2. Применяйте пороги фильтрации качества. Для SNP — варианты фильтров, например, с QD < 2.0, FS > 60.0 или MQ < 40.0. Для INDEL — варианты фильтров, например, с QD < 2.0 или FS > 200.0.
    3. Сжимайте и индексируйте VCF-файлы с помощью стандартных инструментов обработки VCF. Генерируйте вариантную статистику с помощью сводных утилит VCF.
  5. Присвоение генотипов
    1. Извлекать специфические для локуса варианты из областей SAG2 и SAG3 и сравнивать полиморфные профили для эталонных последовательностей штаммов с целью присвоения генотипов T. gondii .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Геномная ДНК Toxoplasma gondii была успешно амплифицирована с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленной на два генетических маркера: SAG2 и SAG3 (рисунок 2). После очистки продукты ПЦР выявили чёткие полоски ожидаемых размеров при электрофорезе агарозного геля, соответствующие 639 бп (SAG2) и 1158 бп (SAG3). Ясность и последовательность этих полос подтвердили успешную амплификацию и целостность целев...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это исследование демонстрирует полезность секвенирования длинного чтения Oxford Nanopore в сочетании с целевым многолокусным подходом для быстрого и надёжного генотипирования Toxoplasma gondii. Сосредотачиваясь на двух хорошо охарактеризованных поверхностных антигенных локусах, SAG2 и SAG3, мы подтверждаем концепцию многолокусного секвенирования на основе Oxford Nanopor посредством сравнительного анализа штаммов RH (тип I) и ME49 (тип II), демонстрируя способно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Министерством высшего образования и научных исследований Египта, представленным Египетским бюро по культурным и образовательным вопросам в Лондоне, и UKRI MRC (MR/X502947/1). Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Агарозный порошокThermo Fisher Scientific16500100Для гель-электрофореза
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065Среда клеточной культуры
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)Oxford Nanopore Technologies, UKN/ANextflow workflow для обработки и анализа данных секвенирования ампликонов нанопор; для воспроизводимого анализа данных MinION использовалась версия 1.2.1.
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)Oxford Nanopore Technologies, UKN/ANextflow workflow для выравнивания читаний секвенирования нанопор к ссылочно-следовательным данным и интегрированной визуализации с использованием IGV; для воспроизводимого анализа данных MinION использовалась версия 1.2.3.
Этиловый спирт, чистыйMerck Life Science51976-500ML-FДля очистки жемчужин
Фетуальная сыворотка быка (FBS)Sigma-AldrichMFCD00132239Добавка для клеточной культуры
Набор для промывания потокового каналаOxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004Промывка потокового канала
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)Thermo Fisher ScientificSM1331Подтверждение размера
Линии клеток фибробластов HFF-1 из кожичек человеческого плодаAmerican Type Culture Collection (ATCC)SCRC-1041Человеческие дермальные фибробласты, изолированные из кожичек новорожденного; используется для размножения паразита
Поточный канал MinION (R10.4.1)Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114Поточный канал для секвенирования
Последовательное устройство MinION Mk1BOxford Nanopore Technologies, UKMIN-101BНанопорный секвенатор; секвенирование проводилось с использованием программного обеспечения MinKNOW (версия 25.09.16) для управления устройством и вызова баз в режиме реального времени.
Программное обеспечение MinKNOWOxford Nanopore Technologies, UKN/AПрограммное обеспечение, используемое для управления устройством MinION Mk1B, реального секвенирования и вызова баз; версия 25.09.16.
Комплект для нативного баркодирования 24 V14Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24Баркодирование для множественных образцов
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNew England BiolabsM0367Лигирование ДНК
NEBNext Quick Ligation ModuleNew England BiolabsE6056Лигирование адаптеров
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×)New England BiolabsB6058Используется при лигировании ДНК
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BiolabsE7546Подготовка библиотеки
Безнуклеазная водаThermo Fisher ScientificR0581Град молекулярной биологии
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel740609.5Пурификация продукта ПЦР
Пениллин-стрептомицин (1%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15140-122Антибиотическая смесь
Фосфатно-буферный раствор (PBS)Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023Промывочный буфер
Q5 High-Fidelity 2× Master MixNew England BiolabsM0492SПолимераза высокой точности
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen69504Экстракция ДНК
Quick T4 DNA LigaseNew England BiolabsM2200Фермент лигирования адаптеров
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102Краситель для окрашивания ДНК
TriTrack DNA Loading Dye (6×)Thermo Fisher ScientificR1161Загрузка образцов в гель
Трипсин-ЭДТА (0,25%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)25200056Для пассажирования HFF
1× TAE или 1× TBE буфер——Рабочий буфер
2× ПЦР премикс——Готовая смесь для ПЦР

Ссылки

  1. Uzelac, A., Djurkovic-Djakovic, O. Isolation, genotyping and phenotyping Toxoplasma gondii in Europe - A critical perspective. Food Waterborne Parasitol. 40, e00279(2025).
  2. Yaman, Y., Bay, V., Kişi, Y. E. Discovery of host genetic factors through multi-locus GWAS against toxoplasmosis in sheep: addressing one health perspectives. BMC Veterinary Research. 21 (1), 263(2025).
  3. Khedr, A. A., et al. Exploring the role of chitosan and curcumin-loaded chitosan nanoparticles against chronic Toxoplasma infection in experimental mice. Scientific Reports. 15 (1), 41765(2025).
  4. Joeres, M., et al. Genotyping of European Toxoplasma gondii strains by a new high-resolution next-generation sequencing-based method. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 43 (2), 355-371 (2024).
  5. Gohar, Y., et al. Intra-strain genetic heterogeneity in Toxoplasma gondii ME49: Oxford Nanopore long-read sequencing reveals copy number variation in the ROP8-ROP2A locus. BMC Genomics. 26 (1), 1094(2025).
  6. Koutsogiannis, Z., Denny, P. W. Rapid genotyping of Toxoplasma gondii isolates via Nanopore-based multi-locus sequencing. AMB Express. 14 (1), 68(2024).
  7. DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , QIAGEN. (2023).
  8. User manual PCR clean-up and Gel extraction. , MACHEREY-NAGEL. (2024).
  9. Karst, S. M., et al. High-accuracy long-read amplicon sequences using unique molecular identifiers with Nanopore or PacBio sequencing. Nature Methods. 18 (2), 165-169 (2021).
  10. Yu, P. -L., et al. Next-generation fungal identification using target enrichment and Nanopore sequencing. BMC Genomics. 24 (1), 581(2023).
  11. Vilares, A., et al. Towards a rapid sequencing-based molecular surveillance and mosaicism investigation of Toxoplasma gondii. Parasitology Research. 119 (2), 587-599 (2020).
  12. Fazaeli, A., Ebrahimzadeh, A. A new perspective on and re-assessment of SAG2 locus as the tool for genetic analysis of Toxoplasma gondii isolates. Parasitology Research. 101 (1), 99-104 (2007).
  13. Targa, L. S., et al. Toxoplasma gondii SAG2, SAG3 and GRA6 alleles and single nucleotide polymorphism in congenital infections with known parasite load and clinical outcome. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 65, e8(2023).
  14. Rico-Torres, C. P., et al. Can cloning and sequencing help to genotype positive Toxoplasma gondii clinical samples? Results and validation using SAG3 as a model. Infect Genet Evol. 101, 105283(2022).
  15. Sanchez, S. G., Besteiro, S. The pathogenicity and virulence of Toxoplasma gondii. Virulence. 12 (1), 3095-3114 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Процедура генотипированияэкстракция геномной ДНКлокус-специфическая амплификацияген SAG2ген SAG3однонуклеотидный полиморфизмвыравнивание последовательностей
Многолокусное секвенирование для типирования штаммов Toxoplasma gondii
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.