Методическая статья

Непрерывное культурное миллифлюидное устройство для изучения Escherichia coli в условиях низкого содержания и колебаний питательных веществ

DOI:

10.3791/70652

⸱

7 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, Institute of Environmental Engineering, ETH Zurich, 2Department of Mechanical Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), 3Department of Plant and Environmental Sciences, Institute of Life Sciences, The Hebrew University of Jerusalem, 4Department of Water Resources and Drinking Water, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology (Eawag)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол для устройства для миллифлюидного непрерывного культивирования (MCCD), который позволяет выращивать бактериальные популяции в условиях постоянного низкого содержания питательных веществ (до сотен наномолярных концентраций) или временных флуктуаций питательных веществ в минимальное время.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микробные среды обитания в природе часто характеризуются низкой концентрацией смешанных питательных веществ, пространственной гетерогенностью и временными колебаниями. Однако традиционные методы лабораторного культивирования не способны воспроизвести эти условия. Пакетные культуры не могут поддерживать рост в условиях с низким содержанием питательных веществ, тогда как хемостатики поддерживают устойчивый рост с помощью одного ограничивающего питательного вещества, но их сложно реализовать, когда цель — поддерживать определённые низкие концентрации питательных смесей или внедрять быстрые колебания. Микрофлюидные системы создают динамические среды, но дают недостаточную биомассу для омических анализов на уровне популяции. Для устранения этих ограничений мы представляем устройство для миллифлюидного непрерывного культивирования (MCCD) — универсальную платформу для изучения микробных реакций на стабильные и колеблющиеся условия питательных веществ. MCCD содержит бактериальные популяции внутри фильтра Sterivex (пористая фильтрующая мембрана 0,45 мкм поливинилиденфторида [PVDF]), где непрерывный поток среды поддерживает стабильные условия культуры, предотвращая истощение питательных веществ. Трёхкомпонентная система соленоидных клапанов, управляемая с помощью индивидуального программного обеспечения Matlab, обеспечивает точные, микроскопические флуктуации питательных веществ. Этот протокол предоставляет пошаговое руководство по работе MCCD в двух режимах: (1) при постоянных условиях с низким содержанием питательных веществ и (2) условиях с флуктуативными питательными веществами. Используя эту систему, Escherichia coli выросла экспоненциально в смеси аминокислот и нуклеобаз, присутствующих в концентрациях от десятков до сотен наномоляров, достигая концентраций клеток порядка 109 клеток/мл. Воссоздавая ключевые особенности природных микробных местообитаний, MCCD позволяет изучать рост и физиологию бактерий в контролируемых, но экологически значимых условиях у E. coli и других микробных видов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактерии в естественных средах обитания сталкиваются с питательным ландшафтом, который часто варьируется как по составу, так и по концентрации, и может колебаться в широком диапазоне временныхмасштабов 1, 2, 3, 4. В таких средах, как океан5,почва 3 икишечник 6, рост микроорганизмов часто ограничен одним или несколькими необходимыми питательными веществами, а доступность питательных веществ может изменяться под воздействием физических, химических и биологическихпроцессов 4. Эти питательные смеси и их колебания определяют микробные стратегии выживания и роста, формируя реакции на разных уровнях биологическойорганизации 4.

Микробные адаптации к динамике питательных веществ происходят на уровне сообщества, популяции и отдельных клеток. На уровне сообщества колебания могут способствовать сосуществованиювидов 7, координировать состав сообщества и метаболическую активность с временнойвариацией 8, а также создавать возможности для колонизации новыхвидов 9. На уровне популяции изменение условий питательных веществ может ускорить эволюцию, отбирая для генетическихизменений 10 или вызывать фенотипическую вариабельность, включая стратегии хеджирования11, которые улучшают выживаемость в непредсказуемых условиях. На уровне одной клетки бактерии корректируют свою физиологию в ответ на питательнуюсреду 12,13. Одним из недавно опубликованных примеров является специфическая физиология, которая даёт бактериям преимущество в росте при колебаниях14. Поскольку бактерии часто сталкиваются с ограничением питательных веществ, изучение их реакции на условия с низким уровнем и переменными питательными веществами — как в отдельных клетках, так и внутри популяций или сообществ — крайне важно для понимания их поведения в естественной среде.

Хемостатики хорошо подходят для изучения роста при ограничении одним питательным веществом, но их сложно использовать, когда цель — контролировать концентрацию множества питательных веществ в смесях с низкой концентрацией. Хемостатики стали ценными инструментами для изучения адаптации бактерий к ограничению питательных веществ, обеспечивая хорошо контролируемую и устойчивую среду. Однако их работа по своей сути ограничивает их условиями, при которых рост ограничен одним важным питательным элементом. В хемоостате скорость разбавления корректируется так, чтобы клеточный рост уравновешивает запас одного ограничивающего питательного вещества, тем самым фиксируя скорость роста, а не концентрацию отдельныхпитательных веществ 15. Эта структура не обобщается на среды, содержащие смеси замещаемых питательных веществ — например, несколько источников углерода — поскольку скорость разбавления контролирует только общий темп роста, а не концентрацию каждого компонента всреде 16,17. В результате концентрации отдельных питательных веществ и их совместное использование формируются за счёт микробного использования, а не назначаются извне16,17.

Кроме того, хотя флуктуации питательных веществ могут быть вызваны в хемостатах, быстрые флуктуации или одиночные сдвиги в масштабе минут трудно достичь из-за обычно больших объёмов культуры. Микрофлюидные устройства стали мощными инструментами для создания точных сред с низкой концентрацией и изменяющимися питательнымивеществами 14. В сочетании с видеомикроскопией они позволяют измерять рост отдельных клеток. Хотя микрофлюидные системы позволяют количественно оценивать экспрессию выбранных белков с помощью флуоресцентных репортеров, в отличие от хемостатов, типичные микрофлюидные устройства слишком малы для получения биомассы, необходимой для омических анализов, например, для изучения протеома бактериальной популяции. Чтобы преодолеть этот разрыв, мы разработали устройство для миллифлюидной непрерывной культуры (MCCD).

MCCD обеспечивает рост бактерий при контролируемых условиях питательных веществ, включая постоянные условия с низким содержанием питательных веществ с минимальным или отсутствующим истощением, а также изменяющиеся условия питательных веществ, используя систему непрерывного потока культуры, способную генерировать достаточную биомассу для дальнейших анализов. MCCD использует PVDF-фильтр 0,45 мкм в качестве сосуда для культуры, в котором среда постоянно пополняется перистальтическим насосом, подающим свежую среду из резервуара (рисунок 1A). Пористая мембрана фильтра удерживает бактерии, одновременно обеспечивая заданный поток питательных веществ, что предотвращает их истощение даже при низкой концентрации питательных веществ (сотни нанмоляров и микромоляров). Поскольку биомасса сохраняется, пока свежая среда непрерывно проходит через устройство, MCCD имеет сходство с ретентостатами18, в которых клетки сохраняются, а среда обновляется. Однако MCCD отличается от классических ретентостатов своей архитектурой и способом подачи питательных веществ. Ретентостат обычно работает как перемешиваемый оптовый реактор, где клетки взвешены в хорошо смешанном объёме культуры. В таких условиях доступность питательных веществ зависит от баланса между смешиванием, диффузией и клеточным поглощением, и может возникать локальное истощение или градиенты, особенно при низких концентрациях питательных веществ и высокой плотности клеток. В отличие от этого, в MCCD клетки собираются непосредственно на мембране внутри малого объёма картриджа Sterivex, образуя слои толщиной всего в несколько клеток, которые постоянно подвергаются воздействию текущей среды. Внутри картриджа не проводится активное смешивание; вместо этого среда гомогенизируется выше по течению и подаётся непрерывным потоком. Питательные вещества поставляются за счёт конвективного транспорта через тонкие клеточные слои, и из-за малого расстояния диффузии и высокой скорости расхода локальные градиенты питательных веществ минимизируются. В результате условия питательных веществ, испытываемые популяцией, в первую очередь определяются составом входящей среды, что позволяет создавать более последовательные и чётко определённые условия с низким содержанием питательных веществ, чем это возможно в системах удержания с перемешиванием.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Устройство для миллифлюидной непрерывной культуры (MCCD) для бактериальных культур в условиях низкой концентрации или колебаний питательных веществ.(A) Схема MCCD для условий постоянных питательных веществ. Перистальтический насос подаёт поток свежей среды из резервуара через фильтр PVDF диаметром 0,45 мкм, содержащий бактериальные клетки. Пористая мембрана в фильтре удерживает бактерии, позволяя среде проходить сквозь неё. Непрерывный поток среды поддерживает постоянные условия питательных веществ внутри фильтра, даже при очень низкой концентрации. (B) Схема MCCD для колебаний условий питательных веществ. Программно управляемый трёхклапанный соленоидный клапан выше перистальтического насоса чередует приток среды между двумя резервуарами (например, с высокой концентрацией питательных веществ, CHigh, C Low, C Low). Программное обеспечение управляет положением поршня клапана, чтобы определить активный источник поступления. (C) Флюидная сборка для постоянных условий питательных веществ. Крышка с тремя силиконавыми трубками, проходящими через неё, герметизирует бутылку с свежим материалом. Одна трубка подключается к вентиляционному фильтру для аэрации, а две другие несут среду к фильтрам. Фитинги Barb-to-Male Luer соединяют эти трубки с перистальтической трубкой и подключают каждую перистальтическую трубку к одностороннему обратному клапану, который служит входной точкой фильтра. Выход фильтра также оснащён односторонним обратным клапаном. На изображении показаны два образца, каждый из которых находится в одном фильтре. (D) Флюидная сборка для изменяющихся условий питательных веществ. Металлическая платформа содержит микроконтроллер и электронные компоненты, управляющие двумя соленоидными клапанами с помощью специализированного программного обеспечения MATLAB. Резьбовые фитинги соединяют как входы, так и выходы электромагнитных клапанов с трубой. Каждый клапан имеет два входа для двух альтернативных сред, здесь — среда с высокой концентрацией питательных веществ, трубки CHigh, с красной маркировкой, и среду с низкой концентрацией питательных веществ — C Low, трубки с синей маркировкой. Материалы содержатся в бутылках с крышками и вентиляционным фильтром, как в (C). Выходы из соленоидных клапанов соединяются с фильтрами через перистальтическую трубку, как в стационарном узле (C). На изображении показаны два образца, каждый из которых находится в одном фильтре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Кроме того, установка программно управляемого трёхклапанного соленоидного клапана выше фильтра Sterivex позволяет пользователю переключать поток среды между двумя носителями, содержащимися в разных резервуарах (рисунок 1B). В результате устройство может использоваться для изучения реакции бактерий либо на стабильную среду при постоянном (включая низкой концентрации) условии питательных веществ, либо на флуктуации питательных веществ с временными интервалами колебаний в несколько минут и более.

Этот протокол описывает сборку и работу MCCD для изучения бактерий как в условиях с низким содержанием питательных веществ, так и при флуктуативном содержании. Например, этот протокол предоставляет пошаговое руководство по проведению эксперимента по росту с использованием NCM3722 Escherichia coli в двух режимах работы MCCD: при постоянном низком содержании питательных веществ и с колебаниями условий питательных веществ. Система MCCD легко адаптируется к другим питательным условиям и микробным видам, что делает её универсальной платформой для изучения бактериальной физиологии в питательных средах, типичных для природы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Рост бактерий в условиях постоянных питательных веществ

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает процедуру проведения кривой роста E. coli NCM3722 в условиях очень разбавленной среды с определённым богатым уровнем ("низкий RDM"). Эта кривая роста длится 12 часов, при этом один образец собирается каждые 2 часа (всего 6 точек времени). Ключевой принцип этого протокола заключается в том, что каждая временная точка соответствует одному фильтру Sterivex (далее — 0,45 мкм PVDF-фильтр). Для сбора образца культура внутри фильтра извлекается центрифугой вверх ногами, номер ячейки измеряется, и фильтр выбрасывается. Каждый PVDF-фильтр 0,45 мкм даёт только один образец. Подготовка эксперимента требует определения трёх ключевых экспериментальных параметров: расхода перистальтического насоса, продолжительности эксперимента и желаемого количества образцов (то есть количества PVDF-фильтров 0,45 мкм). Установите начальный расход на 2 мл/мин. Корректируйте этот параметр по мере необходимости (например, увеличивайте расход для поддержания подачи очень разбавлённого питательного вещества).

  1. Подготовка среды и материалов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку каждый фильтр соответствует одной выборке временной точки, экспериментальное время работы каждого PVDF-фильтра размером 0,45 мкм варьируется в зависимости от времени сбора (например, 2 часа для первой точки, 4 часа для второй точки времени и так далее).
    1. Оцените необходимый объём посевной среды с помощью формулы
      figure-protocol-1,
      где n — количество образцов (0,45 мкм PVDF-фильтров), Q — скорость потока (в мл/мин), а ti — экспериментальное время работы (в минутах) для каждого образца.
    2. Умножьте на 1,2, чтобы добавить дополнительный объем на 20% для учёта колебаний расхода. В этом примере вычислите
      figure-protocol-2
    3. Округлите рассчитанный объём вверх (например, подготовьте 6 200 мл в этом примере).
    4. Подготовьте материал для стерилизации (см. Таблицу 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте и стерилизуйте материалы за день до эксперимента, чтобы обеспечить готовность и минимизировать задержки. Автоклав — эти материалы, кроме односторонних клапанов Люэра; Простерилизуйте клапаны с помощью 70% этанола.
      1. Соедините оба конца шести силиконовых перистальтических трубок с пластиковыми фитингами «Male Luer to Barb», вставив конец фитинга в трубку. Накройте мужские концы Luer алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить загрязнение.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Шесть перистальтических трубок подготовлены, потому что эксперимент использует шесть PVDF-фильтров 0,45 мкм. Позже все трубки будут установлены на одну и ту же перистальтическую головку насоса, чтобы все фильтры получали одинаковый поток.
      2. Поместите трубку в закрытый, стерилизируемый контейнер.
      3. Поместите вентиляционные фильтры внутри закрытого, стерилизируемого контейнера.
      4. Поместите крышки бутылок с помощью силиконовой трубки, проходящей через крышки, внутри закрытого, стерилизируемого контейнера.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Трубчатые крышки бутылок, используемые в этом протоколе, оснащены тремя трубками, проходящими через колпачки: двумя трубками равного диаметра для подачи среды к PVDF-фильтрам 0,45 мкм и третьей трубкой с более широким диаметром. Эти трубки надёжно крепятся к крышкам и не могут быть сняты.
      5. Погрузите 12 односторонних обратных клапанов Luer в раствор этанола 70% и оставьте их на ночь для стерилизации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) Стерилизованные материалы можно хранить под водой и герметизировать при комнатной температуре до 24 часов до начала эксперимента. Перед использованием снимите клапаны с этанола и прополосните стерильной ультрачистой водой, чтобы удалить остатки этанола. В качестве альтернативы обратные клапаны могут быть напечатаны на 3D-принтере с использованием автоклавируемых материалов, чтобы обеспечить стерилизацию с помощью автоклавирования вместо обработки этанолом.
    5. Автоклавуйте перистальтические трубки, вентиляционные фильтры, крышки бутылок, градуированные цилиндры и бутылки с использованием стандартных лабораторных настройок.
    6. Подготовьте 6 200 мл низкобогатых сред (RDM; см. Таблицу материалов) путём смешивания реагентов, перечисленных в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте среду в день эксперимента, в течение примерно 5 часов ожидания после начала предварительной культуры (см. шаг 1.2.1). Это сохраняет среднюю свежесть и минимизирует риск загрязнения.
  2. Подготовка бактериальной предкультуры
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте прекультуру в экспоненциальной фазе для начала эксперимента. В этот период бактерии растут с постоянной скоростью, синтезируя клеточные компоненты сбалансированным образом и делясь при определённой клеточной массе. Используйте экспоненциально-фазные клетки для минимизации вариабельности и стандартизации исходного физиологического состояния.
    1. За день до эксперимента подготовьте ночную (ON) культуру следующим образом: Инокулируйте 3 мл полного RDM с замороженной глицероловой NCM3722 E . coli в стерильной пробирке объемом 15 мл. Инкубировать культуру ночью (~16 часов) при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин в встряхивающем инкубаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) После того как культура ON находится в инкубаторе, в этот день дальнейших действий не выполняется. На следующий день возобновите протокол, перейдя к шагу 1.2.2.
    2. В день эксперимента подготовьте прекультуру следующим образом: добавьте 6 мкл культуры ON к 6 мл полного RDM. Разделите их поровну на две пробирки по 15 мл и маркируйте трубки как A и B. Инкубировать обе трубки при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Докультивирование обычно требует примерно 5 часов, чтобы достичь экспоненциальной фазы (OD 600 ≈ 0,5). Используйте этот период для приготовления свежей среды (см. шаг 1.1.6). Не переходите к шагу 1.2.3, покаOD 600 не достигнет примерно 0.5.
    3. Мониторинг оптической плотности (OD) на 600 нм с помощью трубки B. Продолжите эксперимент, когдаOD 600 достигнет примерно 0,5, что указывает на экспоненциальный рост полного RDM для E. coli NCM3722 (см. раздел 1.4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начните эксперимент с экспоненциально-фазных клеток для повышения воспроизводимости и стандартизации начальных условий.
  3. Подготовка эксперимента в MCCD с условиями постоянных питательных веществ
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 1.3.1–1.3.5 внутри стерильного шкафа для биобезопасности сразу после того, как предкультура начнёт рост.
    1. Выделяйте общий средний объём на каждую бутылку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте бутылки как средние резервуары. Используйте крышки для бутылок с двумя трубками средней подачи, каждая из которых подаёт среду к одному PVDF-фильтру диаметром 0,45 мкм. Общий объём среды (подготовленный на шаге 1.1.6) распределён между бутылками в зависимости от количества, необходимого каждому образцу временной точки (то есть каждому фильтру PVDF 0,45 мкм) в ходе эксперимента.
      1. Используйте формулу, приведённую на шаге 1.1.1, чтобы определить объём среды, необходимый для каждого PVDF-фильтра 0.45 мкм. Например, используя следующие термины:
        figure-protocol-3
        Общее количество средних объёмов, необходимых для каждой временной точки, в хронологическом порядке: 288, 576, 864, 1152, 1440 и 1728 мл.
      2. Распределите рассчитанные объёмы среды по бутылкам, сгруппируя объёмы, необходимые для двух временных точек, в одну бутылку. Например: ~900 мл в одной бутылке по 1 л (для точек 1 и 2), ~2 100 мл в одной бутылке на 2,5 л (для точек времени 3 и 4), ~3200 мл среды в одной бутылке на 4 л (для точек 5 и 6).
    2. Запечатайте каждую бутылку трубочными крышками (рисунок 1C). Плотно затяните крышки, чтобы предотвратить протечки.
    3. Подключите вентиляционный фильтр диаметром 0,2 мкм к самой широкой силиконовой трубке, выступающей от трубчатой крышки бутылки (рисунок 1C). Это обеспечивает стерильный обмен воздухом во время эксперимента.
    4. Прикрепите один конец каждой перистальтической трубки (с уже прикреплёнными фитингами; см. раздел 1.1.4 о подготовке материала) к силиконовым трубкам меньшего диаметра, выходящим от трубчатых крышек бутылок (рисунок 1C). Обеспечивайте надёжные соединения для поддержания стерильности. Оставьте крышку из алюминиевой фольги на свободном мужском замке Luer до начала эксперимента, чтобы предотвратить загрязнение.
    5. Поместите бутылки с собранной трубкой и перистальтическим насосом в инкубатор, настроенный на 37 °C. Закрепите трубку в каналах перистальтической головки насоса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все перистальтические трубки установлены на одной головке насоса, что и один перистальтический насос, так что все PVDF-фильтры 0,45 мкм получают среду от одного насоса. Использование одного насоса обеспечивает одинаковый расход между фильтрами и предотвращает вариативность, которая может возникнуть из-за различий между насосами.
  4. Протокол эксперимента в MCCD с условиями постоянных питательных веществ
    1. Разведите предкультуру (OD = 0,5) в 1:10, добавив 600 мкл предкультуры к 5,4 мл свежего низкого RDM.
    2. Используя пипетку объемом 1 мл, вводите по 1 мл разбавленной предварительной культуры в каждый из шести PVDF-фильтров по 0,45 мкм.
    3. Прополосните односторонние обратные клапаны автоклавированной ультрачистой водой и подключите по одному к каждому концу каждого PVDF-фильтра с размером 0,45 мкм.
    4. Снимите алюминиевые фольгированные крышки с перистальтических фитингов трубок.
    5. Подключите каждый из шести PVDF-фильтров 0,45 мкм к мужскому фитингу Люра на перистальтической трубке (рисунок 1C).
    6. Установите расход на перистальтическом насосе на 2 мл/мин и запустите поток. Определите этот момент как время 0.
    7. Поставьте контейнер для отходов под фильтрами PVDF 0,45 мкм для сбора расхода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2A показана полная сборка эксперимента внутри коробки инкубатора.
  5. Сбор образцов
    1. Через 2 часа отключите один из двух PVDF-фильтров с разрешением 0,45 мкм, подключённых к баллончику на 1 л.
    2. Открутите односторонние обратные клапаны и вставьте PVDF-фильтр 0,45 мкм в трубку центрифугы объемом 50 мл с входом, направленным вниз.
    3. Центрифугировать центрифугу в центрифугной трубке с PVDF-фильтром 0,45 мкм на 2000 × г в течение 2 минут.
    4. С помощью труборезка приложите мягкое давление на пластиковый корпус в самом конце выхода, чтобы открыть PVDF-фильтр 0,45 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием продезинфицируйте труборез (например, протирая 70% этанолом), чтобы избежать загрязнения при открытии фильтра PVDF с толщиной 0,45 мкм.
    5. Освободите внутренний цилиндр, содержащий пористую мембрану, и уберите участок фильтра, который удерживает мембрану.
    6. Промыйте внутренние стенки оболочки фильтра PVDF диаметром 0,45 мкм (перпендикулярные направлению потока) культурной средой, собранной в центрифугной трубке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап гарантирует, что все клетки, застрявшие на стенках во время центрифугирования, будут собраны.
    7. Измерьте общий собранный объём с помощью серологической пипетки объемом 5 мл.
    8. В последующие временные точки (4 ч, 6 ч, 8 ч, 10 ч и 12 ч) отключите соответствующие PVDF-фильтры 0,45 мкм и повторите шаги 1.5.2–1.5.6. Следуйте этому конкретному порядку:
      1. Через 4 часа отключите второй PVDF-фильтр 0,45 мкм, подключённый к баллону на 1 л.
      2. Через 6 и 8 часов отключите PVDF-фильтры 0,45 мкм, подключённые к баллону на 2,5 л.
      3. Через 10 и 12 часов отключите PVDF-фильтры 0,45 мкм, подключённые к баллончику на 4 л.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте этому порядку, чтобы сопоставить точки времени дискретизации с объёмами среды, распределёнными в шаге 1.3.1.
  6. Анализ на последующих этапах
    1. Возьмите три аликвота по 100 мкл из каждого образца и закрепите глутаральдегидом до конечной концентрации 1,5%.
      ВНИМАНИЕ: Глутаральдегид токсичен, сильный раздражитель и потенциальный сенсибилизатор. Держать его внутри капюшона с химическим паром, надевая соответствующие средства индивидуальной защиты (лабораторный халат, нитриловые перчатки и защитные очки). Избегайте контакта кожи и вдыхания. Утилизировать отходы, содержащие глутаральдегид, в соответствии с институциональными нормативами по опасным химическим отходам.
    2. Используйте фиксированные образцы, чтобы подсчитать количество клеток на микролитр с помощью проточной цитометрии после маркировки флуоресцентным красителем ДНК.
      ВНИМАНИЕ: Флуоресцентные красители ДНК могут быть мутагенными. Надевайте перчатки и утилизируйте отходы, содержащие красители, в соответствии с институциональными нормами биобезопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы окрашиванию ДНК и потоковой цитометрии плотность клеток можно оценить, покрывая небольшой объём образца на агар-пластины богатой среды (например, LB агар) и подсчитывая колониообразующие единицы (CFU).
    3. Умножьте количество ячеек на микролитр на общий объём, измеренный в шаге 1.5.7, чтобы вычислить общее количество ячеек в фильтре PVDF с размером 0.45 мкм.
    4. Центрифугуйте оставшийся объём в микроцентрифугных трубках объемом 1,5 мл при 10 000 × г в течение 4 минут.
    5. Удалите супернатант.
    6. Храните гранулы клеток при -80 °C для будущих анализов (например, транскриптомики).

figure-protocol-4
Рисунок 2: Экспериментальная сборка MCCD. (A) Фотография установки MCCD при постоянных условиях питательных веществ. Установка размещается в инкубаторном ящике для поддержания постоянной температуры, при этом отходной резервуар собирает проточную среду. (B) Фотография установки MCCD для изменяющихся условий питательных веществ. Бутылка с маркировкой красной ленты содержит среду с высокой концентрацией питательных веществ (CHigh), а бутылка с маркировкой синей лентой содержит среду с низкой концентрацией питательных веществ (CLow). Металлическая платформа в центре поддерживает компоненты, контролирующие флуктуацию питательных веществ, соответствующие тем, что описаны на рисунке 1D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

2. Рост бактерий в условиях флуктуационного содержания питательных веществ

  1. Сборка контроллера для соленоидного клапана
    ПРИМЕЧАНИЕ: Управление трёхклапанным соленоидным клапаном с помощью микроконтроллерной коммутационной схемы, подключённой к компьютеру с пользовательским интерфейсом (GUI), разработанным в MATLAB.
    1. Соберите схему управления электромагнитным клапаном (рисунок 3A).
      1. Подключите цифровой выходной вывод микроконтроллера к основанию NPN-транзистора через резистор мощностью 1 кОм.
      2. Подключите коллектор транзистора к отрицательному выводу электромагнитного клапана.
      3. Подключите эмиттер транзистора к земле.
      4. Подключите положительный вывод электромагнитного клапана к внешнему источнику питания постоянного тока, совместимому с напряжением клапана.
      5. Поставьте диод на терминалы соленоидов. Соедините полосатую сторону диода с положительной линией подачи.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Диод подавляет скачки напряжения, возникающие при выключении соленоида.
    2. Прикрепите пластиковые фитинги «Резьба к барбу шланга» к клапанам соленоида, чтобы конец шипа выходил наружу.
    3. Установите MATLAB R2022b или более поздний компьютер с USB-соединением.
    4. Установите пакет поддержки MATLAB, необходимый для последовательной связи с оборудованием микроконтроллера.
    5. Подключите плату микроконтроллера к компьютеру с помощью USB-кабеля для установления последовательной связи.
    6. Откройте графический интерфейс на базе MATLAB, используемый для генерации колебаний питательных веществ в MCCD (доступен по ссылке https://github.com/juanitaLara/MCCD).
    7. Проверьте соединение между соленоидными клапанами и платформой GUI MATLAB:
      1. Откройте GUI-платформу в Matlab и нажмите кнопку Connect (рисунок 3B). Ждите, пока сообщение о успешном подключении контроллера появится в окне команд.
      2. Введите значение для временного шага (например, 5 с для высокой и низкой фаз) в автоматизированной панели операций .
      3. Наблюдайте за соленоидными клапанами и прислушивайтесь к щелчкам , который они создают при переключении между двумя носителями.
      4. С помощью часов убедитесь, что электромагнитные клапаны переключаются точно в указанный интервал (например, каждые 5 секунд).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите эту проверку перед каждым экспериментом для подтверждения связи и корректировки переключения клапанов. (ТОЧКА ПАУЗЫ) После проверки работы соленоидного клапана система может оставаться собранной внутри инкубатора несколько часов перед началом эксперимента.
  2. Подготовка носителей и материалов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предусматривает череду условий питательных веществ между низким и высоким RDM с периодом 1 час (30 минут при высоком RDM, затем 30 минут при низком RDM). Эксперимент длится три часа колебаний, при этом были собраны два образца: (1) на 3 часа 1 мин (фаза высокого RDM, сразу после перехода с низкого на высокое) и (2) на 3 часа 31 минуте (фаза низкого RDM, сразу после перехода с высокого на низкое).
    1. Оценить необходимые объёмы культурных медиа по экспериментальным этапам.
      1. Сначала рассчитайте объёмы, необходимые для первых 3 часа (три полных периода колебаний):
        низкий объем RDM =1,2 × 2[мл/мин] × 90[мин] × 2[0,45 мкм PVDF-фильтры] = 432[мл]
        высокий объем RDM = 1,2 × 2[мл/мин] × 90[мин] × 2[0,45 мкм PVDF-фильтры] = 432[мл]
      2. Рассчитайте объём, необходимый для финальной 30-минутной фазы:
        высокий объём RDM = 1,2 × 2[мл/мин] × 30[мин] × 1[0,45 мкм PVDF-фильтры] = 72[мл]
      3. Округлите объёмы до удобных значений (например, 500 мл низкого RDM и 600 мл высокого RDM).
    2. Подготовьте материалы для стерилизации автоклава (см. Таблицу 3), следуя шагам 1.1.4–1.1.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте и стерилизуйте материалы за день до эксперимента, чтобы обеспечить готовность и минимизировать задержки в день эксперимента (шаги 2.2.3 и 2.2.4). Такая конструкция, по сравнению с экспериментами с постоянным питанием, требует дополнительной трубки для прямого соединения бутылок с медиа к электромагнитному клапану (рисунок 1B,D). Для этих трубок требуется только один фитинг «Barb to Male Luer», так как фитинги соленоидных клапанов предварительно собраны. Закройте концы этих трубок алюминиевой фольгой перед автоклавированием.
    3. Стерилизуйте подготовленную перистальтическую трубку, вентиляционные фильтры, крышки, градуированный цилиндр и бутылки в автоклаве.
    4. Погрузите 4 односторонних обратных клапана Luer в раствор этанола 70% и оставьте их на ночь для стерилизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) Стерилизованные обратные клапаны могут оставаться погружёнными в этанол на ночь и храниться при комнатной температуре до 24 часов. Перед использованием прополосните клапаны стерильной водой Milli-Q.
    5. Очистите и стерилизуйте соленоидные клапаны, промывая их 70% этанолом 3–5 раз, затем сверхчистой водой 3–5 раз.
    6. В день эксперимента, в течение примерно 5-часового периода ожидания после предварительной подготовки (см. шаг 2.3), подготовьте 500 мл низкого RDM и 600 мл высокого RDM, смешивая реагенты, указанные в таблице 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка среды в день эксперимента обеспечивает свежесть и минимизирует риски загрязнения.
  3. Подготовка бактериальной предкультуры
    1. Следуйте шагам, описанным в шаге 1.2.
  4. Подготовка эксперимента в MCCD с изменяющимися питательными условиями
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 2.4.1–2.4.4 внутри стерильного шкафа для биобезопасности сразу после начала роста прекультуры.
    1. Поместите каждую среду в бутылку на 1 литр.
    2. Запечатайте бутылки с помощью заранее собранных крышек, оснащённых тремя портами и предварительно установленной силиконовой трубкой. Плотно затяните крышки, чтобы предотвратить протечки.
    3. Подключите вентиляционный фильтр диаметром 0,2 мкм к широкой силиконовой трубке, выходящей из одного из портов на каждой крышке бутылки.
    4. Соедините «впускную трубку» (показаную на рисунке 1D) с силиконавыми трубками, выходящими от крышек бутылок с трубками, а затем подключите её к клапанам электромагнита:
      1. Прикрепите один конец силиконовой трубки (с одним креплением соединения) к трубке, выходящей от низкой крышки бутылки RDM.
      2. Оставьте крышку из алюминиевой фольги на свободном штуцере замка Male Luer, пока бутылки не будут доставлены в инкубатор, чтобы предотвратить загрязнение.
      3. Повторите шаг 2.4.4.1 для бутылки с высоким RDM.
    5. Поместите бутылки с собранной «впускной трубкой», перистальтическим насосом и соленоидными клапанами с контроллером внутри инкубатора, установленного на 37 °C.
    6. Подключите «впускную трубку» (прикреплённую в шаге 2.4.4) к входам электромагнитных клапанов следующим образом:
      1. Соедините две трубки от баллона с низким RDM к одному из двух входов в каждом электромагнитном клапане (трубки маркированы синей лентой на рисунке 1D).
      2. Соедините две трубки от баллона с высоким RDM к одному из двух входов в каждом электромагнитном клапане (трубки маркированы красной лентой на рисунке 1D).
    7. Подключите к выходу каждого электромагнитного клапана силиконовую трубку, совместимую с перистальтическим насосом (с одним фитингом). Оставьте алюминиевую фольгированную крышку на свободном мужском фитинге замка Luer, пока эксперимент не начнёт поддерживать стерильность.
  5. Протокол эксперимента в MCCD с флуктуационными условиями питательных веществ
    1. Проверьте связь между соленоидными клапанами и программным обеспечением Matlab, выполнив шаг 2.1.7.
    2. Введите нужные значения временных шагов для флуктуаций в платформу Matlab GUI: введите временные шаги 1800 с в High RDM (30 мин) и 1800 с в Low RDM (30 мин).
    3. Выберите «Низкий » в меню «Старт», чтобы начать в состоянии Low RDM (рисунок 3).
    4. Засейте два PVDF-фильтра с размером 0,45 мкм, как описано на шаге 1.4.
    5. Начинайте эксперимент.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2B изображена полная флюидическая сборка для этого эксперимента.
  6. Сбор образцов
    1. Собирайте образцы, как в шаге 1.5. Собрать первый PVDF-фильтр 0,45 мкм через 3 часа 1 минута, а второй — через 3 часа 31 минуту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала отключите любой из фильтров; Оба фильтра питаются одним и тем же носителем.
  7. Анализ на последующих этапах
    1. Следуйте шагам, описанным в шаге 1.6, чтобы подсчитать количество клеток с помощью потоковой цитометрии, а также обработать и сохранить образцы для дальнейших анализов (например, транскриптомики).

figure-protocol-5
Рисунок 3: Контроллер электромагнитных клапанов для создания колебаний питательных веществ. (A) Схема электропроводки электронной цепи, используемой для управления электромагнитным клапаном. Схема состоит из платы микроконтроллера, транзистора, используемого в качестве коммутационного элемента, резистора, соединённого с базой транзистора, и диода обратной связи, расположенного на клапане электромагнита для защиты цепи от скачки напряжения, возникающих при переключении ламп. Микроконтроллер управляет транзистором, который, в свою очередь, переключает питание на электромагнитный клапан. Адаптировано с разрешения ссылки 20 . (B) После подключения платы микроконтроллера к компьютеру с графическим интерфейсом и источником питания с напряжением, необходимым для электромагнитных клапанов, связь устанавливается нажатием кнопки Connect . Клапаны можно управлять вручную с помощью панели ручного управления , где пользователь выбирает средний воздух для запуска (например, «Высокий» или «Низкий»). Альтернативно, панель автоматических операций позволяет пользователю указать начальную среднюю и временные шаги (в секундах) для каждой фазы (высокая и низкая), а также начать операцию, нажав кнопку Старт . Монитор реального времени отображает пошаговую функцию (0 = Low, 1 = High) со временем, указывая, какая среда проходила через электромагнитные клапаны к фильтрам в течение предыдущих секунд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы использовали MCCD для количественной оценки скорости роста NCM3722 E. coli при постоянных условиях с низким содержанием питательных веществ при трёх концентрациях RDM. Эти концентрации были получены из формулы богато определённой среды (RDM), описанной вНейдхардте 19, при этом аминокислотные и нуклеобазовые добавки были разбавлены до 0,5%, 0,25% и 0,01% от исходной формулы соответственно.

В каждой среде п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы бактериального культивирования, отражающие питательную сложность природных сред, необходимы для продвижения изучения микробной физиологии за пределами упрощённых лабораторных условий. Природные экосистемы содержат смеси питательных веществ в широком диапазоне концентраций, которые часто не поддерживают максимальные темпыроста 1,3,4,21,22,23.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы с благодарностью выражаем финансирование от премии исследователя инициативы Фонда Гордона и Бетти Мур в рамках инициативы Symbiosis in Aquatic Systems (GBMF9197; https://doi.org/10.37807/GBMF9197), сотрудничества Фонда Саймонса через принципы микробных экосистем (PriME) (грант 542395FY22) и гранта Швейцарского национального научного фонда 205321_207488 для R.S. K.S.L. признаёт поддержку Корейского института фундаментальных наук (Национальный центр исследовательских объектов и оборудования; Грант No RS2025-00554860) и Национального исследовательского фонда Кореи (NRF; Грант No RS2025-23523643), оба финансируются правительством Кореи (MSIT) и из Исследовательского фонда 2025 года (1.260002.01) UNIST.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1К Ом резисторBC RoboticsELC-021Номинальная мощность: 1/6 Вт
1N4001 диодBC RoboticsELC-001Обратное напряжение постоянного тока: 50 В; Средний прямоточный ток: 1 А
3-х ступенчатый платино-отвержденный силикагелевый перистальтический шлангInnofluidSE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8Внутренний диаметр 0,8 мм; внешний диаметр 2,4 мм; совместим с используемым перистальтическим насосом
3-х путевые электромагнитыEmerson Electric Co. 0055A301L0T00F312 В постоянного тока, 1 Вт
Алюминиевая фольгаПригоден для автоклавирования
Arduino Uno Rev4ArduinoSKU ABX00173
АвтоклавSystecD-200Или другая компания
Крышка с тремя портами – для бутылок 1 и 2 лNalgene2162-0531Или другая компания (убедитесь, что они подходят для выбранных бутылок)
Крышка с тремя портами – для бутылки 4 лNalgene2162-0830Или другая компания (убедитесь, что они подходят для выбранных бутылок)
Конденсационный метр плотности клеток CO8000WPA biowaveОД-метр
ЦентрифугаEppendorf5804RЦентрифуга, подходящая для 50 мл пробирок Falcon
ЦентрифугаEppendorf5424RЦентрифуга, подходящая для 1,5 и 2 мл пробирок eppendorf
Коническая центробежная пробирка - 50 млFischer Scientific10788561Пробирка Falcon
Культуральные пробирки (14 мл, стерильные)Greiner bio-oneКультуральные пробирки
ЭтанолSigma Aldrich493511Разбавить до 70%
ЦитометрBeckmanC09756CYTOFlex
Глутаральдегид 25%Sigma AldrichG5882Или другая компания
Мерный цилиндр - 500 млNalgene3662-0500 Или другая компания
ИнкубаторИндивидуальный инкубатор – для деталей конструкции обращаться к соответствующим авторам
ЛабV1 интеллектуальный перистальтический насос с низким расходомInnofluidSE-LABV1-AMC12(10)Доступен в Darwin Microfluidics
Мужской Luer-к-шлицевой фитингAldrichZ277142Мужской Luer-к-шлицевой адаптер, совместимый с 0,8 мм ID трубками (см. Рисунок 1C)
Мужской Luer-к-резьбовой фитингAldrichZ277142Используется для соединения электромагнита с "входящей трубкой" (см. Рисунок 1D)
MatlabMathworksR2022b или более новыйПрограммное обеспечение для запуска пользовательского программного обеспечения для электромагнитных клапанов
MOPS EZ Rich Defined Medium KitTeknovaM2105MOPS среда для Enterobacteria
Односторонний Luer клапанMasterflex30505-92Предотвращает обратный поток в резервуары среды
Резак для труб - 0-37 ммKS Tools2222051Или другая компания
Набор пипетокFisher Scientific05-403-151Или другая компания
Платино-отвержденный силикагелевый шланг - 1/16 дюймаNalgene8060-0020Внутренний диаметр 1/16 дюйма (1,6 мм); используется для экспериментов с флуктуирующими питательными веществами
Платино-отвержденный силикагелевый шланг - 1/8 дюймаNalgene8060-0030Внутренний диаметр 1/8 дюйма (3,2 мм); используется для экспериментов с флуктуирующими питательными веществами
Полипропиленово-кополимерная бутылка - 1 лNalgene2126-1000Или другая компания
Полипропиленово-кополимерная бутылка - 2 лNalgene2126-2000Или другая компания
Полипропиленово-кополимерная бутылка - 4 лNalgene2126-4000Или другая компания
Серологическая пипеточка - 5 млCorningCLS4487Или другая компания
Паянный макетBC RoboticsPROTO-001
Стерильный фильтр-HV - 0,45 мкм PVDFMilliporeSVHV01015
SYBR Green I Nucleic Acid Gel StainInvitrogenS7563Стаин нуклеиновых кислот для подсчета клеток в цитометре
TIP120 Дарлингтон транзисторBC RoboticsTRN-005
Трубки - 1,5 млEppendorf3810XТрубки для центробежного отделения клеточных культур и хранения пеллет
Вентиляционный фильтрMillexSLFG050000,2 мкм гидрофобный вентиляционный фильтр
Ёмкость для отходов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
  2. Vorholt, J. A. Microbial life in the phyllosphere. Nat Rev Microbiol. 10 (12), 828-840 (2012).
  3. Or, D., et al. Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media: a review. Adv Water Resour. 30 (6–7), 1505-1527 (2007).
  4. Nguyen, J., et al. Environmental fluctuations and their effects on microbial communities, populations and individuals. FEMS Microbiol Rev. 45 (1), (2021).
  5. Moore, C. M., et al. Processes and patterns of oceanic nutrient limitation. Nat Geosci. 6 (9), 701-710 (2013).
  6. Doranga, S., et al. Nutrition of Escherichia coli within the intestinal microbiome. EcoSal Plus. 12 (1), eesp-0006(2024).
  7. Rodríguez-Verdugo, A., et al. The rate of environmental fluctuations shapes ecological dynamics in a two-species microbial system. Ecol Lett. 22 (5), 838-846 (2019).
  8. Thaiss, C. A., et al. Transkingdom control of microbiota diurnal oscillations promotes metabolic homeostasis. Cell. 159 (3), 514-529 (2014).
  9. Kearney, S. M., et al. Orthogonal dietary niche enables reversible engraftment of a gut bacterial commensal. Cell Rep. 24 (7), 1842-1851 (2018).
  10. Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation. Nat Rev Genet. 4 (6), 457-469 (2003).
  11. Beaumont, H. J. E., et al. Experimental evolution of bet hedging. Nature. 462 (7269), 90-93 (2009).
  12. Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced growth of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
  13. Ballesta, J. P. G., Schaechter, M. Effect of shift-down and growth inhibition on phospholipid metabolism of Escherichia coli. J Bacteriol. 107 (1), 251-258 (1971).
  14. Nguyen, J., et al. A distinct growth physiology enhances bacterial growth under rapid nutrient fluctuations. Nat Commun. 12 (1), (2021).
  15. Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112 (2920), 715-716 (1950).
  16. Egli, T., Lendenmann, U., Snozzi, M. Kinetics of microbial growth with mixtures of carbon sources. Antonie Van Leeuwenhoek. 63 (3-4), 289-298 (1993).
  17. Lendenmann, U., Snozzi, M., Egli, T. Kinetics of the simultaneous utilization of sugar mixtures by Escherichia coli in continuous culture. Appl Environ Microbiol. 62 (5), 1493-1499 (1996).
  18. Tappe, W., et al. Cultivation of nitrifying bacteria in the retentostat, a simple fermenter with internal biomass retention. FEMS Microbiol Ecol. 19 (1), 47-52 (1996).
  19. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
  20. Controlling a solenoid valve with Arduino. , Available from: https://bc-robotics.com/tutorials/controlling-a-solenoid-valve-with-arduino/ (2015).
  21. Egli, T. The Ecological and Physiological Significance of the Growth of Heterotrophic Microorganisms with Mixtures of Substrates. Advances in Microbial Ecology. , Plenum Press. New York. (1995).
  22. Koch, A. L. Oligotrophs versus copiotrophs. BioEssays. 23 (7), 657-661 (2001).
  23. Muenster, U. Concentrations and fluxes of organic carbon substrates in the aquatic environment. Antonie Van Leeuwenhoek. 63 (3-4), 243-274 (1993).
  24. Murugan, A., et al. Roadmap on biology in time varying environments. Phys Biol. 18 (4), (2021).
  25. Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Bacterial mechanosensors. Annu Rev Physiol. 80 (1), 71-93 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

233233

Похожие статьи