Разработка модели каудального сплавления крыс и хвоста: пилотное исследование осуществимости

Краткое содержание

Это исследование продемонстрировало техническую осуществимость пилотной модели каудального сращения между телами крыс с использованием фиксации задней клетки и пластин. Гистоморфометрический анализ на 12-й неделе подтвердил непрерывное соединение костей и выраженные паттерны созревания костей внутри клетки. Эта техническая модель служит предварительной основой для будущих крупномасштабных исследований.

Аннотация

Хвостовые позвонки крыс широко используются в исследованиях регенерации костей и сращения позвоночника как удобные площадки для тестирования материалов и имплантатов. Ранее модели сращения хвоста крысы достигали межпозвоночного сращения с помощью удаления дисков и костной трансплантации, либо с помощью внешних фиксационных устройств. Тем не менее, не было разработано ни одной модели мелких животных, использующей межтелесную клетку, аналогичную клинический. Была выдвинута гипотеза, что оценительная среда для сращения костей может быть создана без неврологических осложнений путём проведения заднего вставления в клетку, имитирующую клинические процедуры, с фиксацией пластин в хвостовых позвонках крысы. Это предварительное пилотное исследование (n = 1) было разработано для оценки технической осуществимости. Был разработан хирургический подход, при котором миниатюрная титановая клетка была точно вставлена в резецированное пространство диска между соседними хвостовыми позвонками, что сильно повторяет хирургическую процедуру человека. Титан был выбран для клетки из-за его широкого клинического применения и биосовместимости. Первоначальные результаты продемонстрировали техническую осуществимость этого подхода. Имплантированная клетка сохраняла высоту диска и выравнивание позвоночника. Наблюдалось прогрессирующее прорастание костей через клетку, что завершилось подтверждением непрерывного костного моста через межпозвоночное пространство через 12 недель после операции. Наличие непрерывной трабекулярной структуры и отсутствие промежуточной фиброзной ткани были подтверждены радиологически и гистологически. В целом, эта модель слияния крысиных хвостов в клетках предоставляет перспективную платформу для оценки новых биоматериалов и изучения механизмов слияния межпозвоночных костей. Однако отсутствие контрольной группы и статистического анализа, из-за односубъектного дизайна, ограничивает обобщимость этих результатов и требует дальнейшей проверки.

Введение

Межкорпусное сращение — это проверенное хирургическое лечение различных заболеваний позвоночника, включая нестабильность, спондилолистез и дегенеративные заболевания; Примечательно, что она эволюционировала примерно за 70 лет как стандартная процедура ^1,2. Процедура включает удаление межпозвоночного диска и установку клетки или костного трансплантата для стимулирования твердого сращения соседних^{позвонков 3,4}. Кроме того, добавление задних инструментов с клетками снижает частоту псевдартроза и расширяет клинические^{показания 5}. Тем не менее, осложнения, такие как псеудартроз и просадка клетки, остаются значимыми клиническими вызовами, требующими надёжной доклинической модели для оценки новых материалов и факторов, способствующих^{слиянию 6,7}.

Крысы широко используются в исследованиях спинального сращения благодаря экономической целесообразности, быстрому размножению, быстрому заживлению и лёгкости обращения^{с ними 8,9}. Тем не менее, существующие модели межтелесного слияния крыс имеют значительные ограничения. В частности, передний поясничный межкорпусный сращение (ALIF) у крыс требует манипуляций крупными сосудами брюшной полости и органами, что приводит к высокой хирургической инвазивности и значительному риску^{осложнений 10,11}. Метод заднего поясничного сращения (PLIF) связан с неизбежным риском неврологических повреждений из-за крайне узких спинномозговых каналов и нейронных элементов, что делает нейронное втягивание практически^{невозможным 12}. В результате большинство исследований крыс ограничивались постеролатеральным сращением (PLF), которое структурно не исследует механизмы сращения костей внутри клетки, что является критически важным аспектом в^{клинических условиях 13}. Кроме того, хотя существуют каудальные модели, им не хватает системы оценки, интегрирующей клиническую межтелесную клетку с фиксацией задней пластины.

Хвостовой позвоночник крыс обладает уникальными преимуществами в исследованиях межтелесного сращения. Хвостовые диски демонстрируют сильное геометрическое, композиционное и механическое сходство с поясничными дисками человека, что делает их всё более популярными в исследованиях^{дисков 14,15}. Кроме того, операция на хвостовом позвоночнике обеспечивает лёгкий доступ к хирургии, экономичность и быстрое послеоперационное восстановление по сравнению с поясничными^{методами 16}. Однако на сегодняшний день ни одно исследование не сообщало об успешном установке задней клетки в хвостовом позвоночнике крысы с детальной гистологической оценкой образования костей внутри и вокруг клетки.

Гистологическая оценка, особенно недекальцифицированной гистоморфометрии костей, остаётся золотым стандартом для оценки оссеоинтеграции и костного^{слияния 17,18}. В частности, он позволяет количественно анализировать критические параметры формирования костей, включая объём кости/ткань (BV/TV), трабекулярное число и толщину трабекуляров, а также качественно оценивать зрелость костей, отличая тканую от ламеллярной^{кости 19,20}. Такая детальная гистоморфометрическая оценка может выявить пространственные и временные остеопроводительные паттерны внутри клетки и на границах клетка-позвонки ^21,22. Тем не менее, комплексная гистоморфометрическая оценка остеопроводимости в клетках в моделях крыс отсутствует.

Целью данного исследования было разработать пилотную модель сращения хвостового сращения крыс с использованием заднего вставления в клетку и дополнительной фиксации пластин для демонстрации технической осуществимости. В данном исследовании представлена подробная хирургическая техника и комплексная гистологическая оценка образования костей внутри клетки и на границах позвоночных концов. Была выдвинута гипотеза, что оценительная среда для сращения костей может быть создана без неврологических осложнений путём проведения заднего вставления в клетку, имитирующую клинические процедуры, с фиксацией пластин в хвостовых позвонках крысы. Эта модель предоставляет эффективную платформу для оценки материалов для межтелесного синтеза и, согласно существующей литературе, представляет собой первоначальное техническое исследование успешного размещения задней клетки с использованием гистоморфометрической оценки остеопроводимости в модели крыс.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утверждёнными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Цзикей (номер одобрения 2023–034C1). Это исследование было разработано как пилотное исследование осуществимости. Для оценки технической жизнеспособности этой крайне деликатной и новой установки задней клетки в хвостовом позвоночнике крысы перед масштабной валидацией было использовано одно животное (n = 1), согласно этическим нормам, чтобы минимизировать использование животных при первоначальной технической оценке. Самцы крыс Спраг-Доули (SD) были выбраны в качестве стандартного штамма для исследований спинального сращения. Критерии включения включали здоровых самцов в возрасте 8–10 недель, весом от 200 до 250 г, чтобы обеспечить совместимость высоты межпозвоночного диска (1,8–2,2 мм) с клеткой 2 мм. Животные, демонстрировавшие > 10% потери веса в период акклиматизации, снижение активности или видимые деформации хвоста, были исключены. Для этого исследования был использован самец крысы Спраг–Доули (8 недель, вес 221,8 г; Japan SLC, Сидзуока, Япония) использовалась. Животное содержалось в контролируемой среде при 25°C и относительной влажности 50% (допустимый диапазон 30–70%) с 12-часовым циклом свет/тьма, и ему предоставлялся импровальный доступ к воде и стандартный рацион грызунов. Крыс содержались в клетках с твёрдым дном, снабжённых гнездовыми материалами и жевательными палочками для обогащения окружающей среды. Перед операцией был введён трёхдневный период акклиматизации. Чтобы предотвратить грызание хвостовых имплантов клетками, крысу содержали в условиях одного содержания на протяжении всего исследования, что было ключевым фактором в этом экспериментальном дизайне.

Подготовка винтов и пластин

Материалы для внутренней фиксации были подготовлены перед хирургической процедурой. Коммерчески доступные винты из нержавеющей стали (оригинальный диаметр: 1,2 мм, длина: 14 мм) вырезали до точной длины 6 мм с помощью резка для проволоки (рисунок 1A). Эти винты стерилизовались стандартным паровым автоклавом при 121 °C в течение 20 минут. В внутренней фиксационной пластине полиоксиметилена (POM) (длина 18 мм, ширина 3 мм, толщина 1 мм) отверстия диаметром 1,2 мм просверливались с интервалом 12 мм с помощью ручного сверла (рисунок 1B–D). Впоследствии углы пластин POM были округлены с помощью проволочного резака, чтобы минимизировать раздражение окружающих мягких тканей (рисунок 1E). Пластины стерилизовались с использованием плазмы газа этиленоксида (EtO) или газовой плазмы перекиси водорода, учитывая термическую чувствительность полимера. Титановая клетка имеет взаимосвязанную решётчатую структуру с продольные каналы диаметром 300–500 мкм. Её поверхность была подготовлена с использованием технологии Lamellar 3D Titanium для достижения микроповерхностной шероховатости 3–5 мкм, что способствует прямому росту костных частиц.

Анестезия и хирургическое вмешательство

Предоперационное голодание не проводилось для предотвращения ненужного метаболического стресса. Анестезия была индуцирована с помощью тройной анестезиологической смеси, состоящей из медетомидина (0,15 мг/кг), мидазолама (2 мг/кг) и буторфанола (2,5 мг/кг), которая вводилась подкожным вводом в спину с помощью иглы 25^{калибра 23}. Адекватная хирургическая плоскость анестезии оценивалась каждые 15 минут путём подтверждения потери отмены педального рефлекса (защемление пальца ног), поддержания розовой слизистой оболочки и контроля частоты дыхания (70–110 вдохов/мин). Впоследствии была проведена хирургическая процедура по межкорпусному сращению хвостовых позвонков. Животное было помещено в положение лежа (рисунок 2A), а весь хвост дезинфицирован по трёхраундному чередующемуся процедуре скрабирования (70% этанола, повидон-йодной очистки и 70% этанола) для обеспечения стерильного поля. Для идентификации целевого позвонка была проведена ручная пальпация, начиная с крестца дистально. Первое подвижное соединение было идентифицировано как крестцовое соединение с Co1, а сегмент, непосредственно отдалённый, был обозначен как Co2, определяя целевой участок CO2–Co3. Продольный разрез примерно 2 см был сделан на дорсальной стороне, простирающийся от второго до третьего хвостового позвонка (CO2–Co3) (рисунок 2B), чтобы открыть заднюю поверхность каждого позвонка. Во время экспозиции были осторожны для выявления и предотвращения повреждений дорсальной хвостовой вены; Для управления незначительными кровотечениями использовались тупая диссекция и биполярная электрокоагуляция. Для подготовки места сплавления фиброзное кольцо между позвонками CO2 и Co3 было вырезано с помощью скальпеля (рисунок 2C). Фиброзное кольцо и пульпозное ядро затем тщательно удалялись с помощью кюретажа с помощью кюрета и маленьких щипцов (см. рисунок 2D). Этот этап выполнялся при мощном хирургическом увеличении (≥3,5x). Полнота удаления объективно определялась визуальным подтверждением пунктатного кровотечения (знак «кровавого конца») и полным отсутствием остаточных мягких тканей. Недопустимое повреждение концевой пластины определялось как глубокая эрозия, охватывающая > 25% общей площади или проникновение в уравновешенную кость > 0,5 мм. Титановая клетка (сечение 2 × мм, высота 2 мм) (рисунок 2E) затем была вставлена глубоко в межпозвоночное пространство до достижения физической остановки и визуального подтверждения полного контакта с обеими торцевыми пластинами, что создало прочную интерференционную посадку (рисунок 2F, 2G).

Фиксация и закрытие раны

Для облегчения фиксации пластин костная поверхность вокруг назначенных отверстий в позвонках CO2 и Co3 была сплющена с помощью электрического портативного фрезера, работающего на скорости 7 800 об/мин, оснащённого сферическим напильником диаметром 2,0 мм (рисунок 2H). Костные отверстия были индивидуально просверлены с интервалами, соответствующими отверстиям для винтов пластиковой внутренней фиксирующей пластины, с помощью ручного сверла с сверлом диаметром 1,2 мм (рисунок 2I). Два винта из нержавеющей стали были предварительно вставлены в отверстия. пластиковой пластины (рисунок 2J). Винты вставлялись под углом 90° на стандартизированную глубину 5 мм с расстоянием между центрами 12 мм (рисунок 2K). Наконец, разрез кожи был закрыт 4-0 нейлоновыми швами, а хвост снова продезинфицирован 70% этанолом для завершения процедуры.

Послеоперационное лечение и эвтаназия

Во время фазы немедленного восстановления (0-й день) животное контролировали каждые 15 минут, при этом температура ректальной кишки поддерживалась до полного лечения грудины и целенаправленной ходьбы. Для долгосрочной оценки (1–12 недели) была введена ежедневная система оценки, основанная на Body Condition Score (BCS), состоянии груминга и общей активности, а также ежедневный мониторинг хирургического места на наличие инфекции или дегисценции. Влажная еда обеспечивалась на полу клетки в течение первых 48 часов. Вес тела измерялся еженедельно. Гуманные конечные показатели ранней эвтаназии строго определялись так: потеря веса ≥20%, BCS ≤2.0, постоянная невозможность добраться до пищи и воды > 12 часов, признаки сильной боли/одышки или тяжёлые осложнения в месте операции (например, некроз). Животные, соответствующие этим критериям, гуманно усыплялись в течение 24 часов. Послеоперационный уход включал введение цефалексина (15 мг/кг) внутримышечно сразу после операции и через 24 часа после операции для предотвращения инфекции. При обезболивании карпрофен (2 мг/кг) вводился подкожно сразу после операции и через 12, 24 и 48 часов после операции, всего четыре дозы. Через 12 недель после имплантации крысу усыпили с помощью передозировки изофлураном. Сегмент от второго по третий хвостовой позвонки затем был собран по всему блоку и закреплен в 70% этаноле.

Рекомендации по обучению, устранение неисправностей и размер выборки. Для успешного внедрения этого требовательного протокола новым операторам необходимо выполнить 3–5 тренировочных процедур на трупах крыс, достигая квалификации при трёх последовательных установках без рентгенологических ошибок. Распространённые методы устранения неполадок включают предварительное измерение высоты диска с помощью рентгена для оптимизации выбора размера клетки и повторную проверку плоскости дорсальной кости для предотвращения миграции клетки. Если покупки винта недостаточно, рекомендуется использовать более низкие скорости сверления. Для будущих валидационных исследований рекомендуется минимальный размер выборки n = 6–10 на группу (с дополнительными 10–20% для утраты) для достижения достаточной статистической мощности. Кроме того, будущие исследования должны включать контрольные группы (например, пустую клетку или автотрансплантат) для подтверждения эффективности биоматериала.

Рентгенографический и гистологический анализ

Микрокомпьютерная томография (КТ) и цифровая рентгенография проводились с использованием микрокомпьютерной томографической системы с напряжением трубки 80 кВ и током 0,1 мА. При получении использовался алюминиевый фильтр толщиной 1,0 мм, чтобы минимизировать артефакты затвердевания пучка, вызванные титановым имплантатом. Для продольной оценки в организме проводили in vivo визуализацию через 1 и 4 недели после операции с размером вокселей 120 мкм. Ex vivo визуализация проводилась через 12 недель после операции с использованием держателя для образца диаметром 24 мм с размером вокселя 24 мкм. КТ-данные и рентгенографические изображения были воссозданы с помощью стандартного алгоритма фильтрованной обратной проекции и проанализированы с помощью просмотрщика DICOM. Были определены количественные критерии для оценки сращения костей. С радиологической точки зрения успешное слияние было подтверждено, когда на микро-КТ была обнаружена непрерывная трабекулярная структура, соединяющая краниальные и хвостовые концевые пластины позвоночника. При сегментации изображения был установлен глобальный порог в 700 единиц Хаунсфилда (HU). С гистоморфометрической точки зрения соотношение БВ/ТВ в клетке считалось порогом физического пространственного удовлетворения и слияния. Гистологически костное соединение определялось полным костным мостом между черепной и хвостовой сторонами без вмешательства волокнистой ткани. Для гистологического анализа последовательное маркирование флуорохромом проводилось с помощью подкожной инъекции кальцеина (8 мг/кг) за 2 дня до эвтаназии с целью определения пространственного распределения активной минерализации в конечной 12-недельной точке. Вырезанные хвостовые позвонки фиксировались в 70% этаноле в течение 7 дней и окрашены в целом костной окрашенностью Вильянуэва. Образцы были обезвожены с помощью восходящих сортов этанола, помещались в смолу метилметакрилата и в средне-сагиттальном разрезе в точном геометрическом центре клетки, как было определено с помощью предварительного секционного микро-КТ с помощью алмазного микротома. Недекальцифицированные измельчённые образцы (толщиной 5 мкм) были подготовлены в Институте гистоморфометрии костей Ито (Ниигата, Япония). Изображения были получены с помощью яркопольного микроскопа и конфокального лазерного сканирующего микроскопа для флуоресцентного слияния. Дальнейшее исследование проводилось под поляризованным световым микроскопом, а гистоморфометрический анализ — с помощью компьютерного анализатора изображений. Область интереса (ROI) определялась как общий внутренний объём клетки, исключая металлические стойки, и делилась на черепные и каудальные внутриклеточные ROI. Костная ткань была идентифицирована по фиолетовому/пурпурному цвету под окрашиванием Вильянуэва. Ламеллярная кость (Lm.V) отличалась своей высокоорганизованной параллельно-ламеллярной структурой при поляризованном освещении, тогда как плетёная кость (Wo.V) имела неорганизованные узоры волокон.

Результаты

Вес тела (таблица 1)

Массу тела измеряли до 12 недель после операции, что демонстрировало устойчивый рост (с 221,8 г до 346,8 г), что указывало на физиологический гомеостаз и косвенно подтверждало отсутствие тяжёлого хронического дискомфорта. Это подтверждалось ежедневными мультимодальными оценками, подтверждающими нормальную активность и неосложнённое заживление раны.

Рана (Рисунок 3) ...

Обсуждение

Здесь была установлена новая модель межтелесного слияния хвостового позвоночника крысы. Эта модель предполагает вставку титановой клетки с помощью заднего подхода, усиленного фиксацией с пластинами и винтами. Впоследствии образование костей внутриклетки оценивалось с помощью детального гистоморфометрического анализа. Отличительные особенности этой модели включают три аспекта: 1) она близко имитирует клиническое заднепоясничное спондияльное сращение или трансфораминальное спондияльное сра...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
4-0 nylon sutures	Natsume	ER-25-30N2
Bright-field microscope	Keyence. (Osaka, Japan)	BZ-X800
Butorphanol	FUJIFILM	021-19001
Calcein	FUJIFILM	76082
Carprofen	FUJIFILM	037-19761
Cefalexin	FUJIFILM	036-11051
Computerized image analyzer	System Supply Co. (Nagano, Japan)	Histometry RT CSS-840
Confocal laser-scanning microscope for fluorescence merging	Carl Zeiss. (Jena, Germany)	LSM 980
Curette	Natsume	E-8-00
Diamond saw microtome	Leica. (Wetzlar, Germany)	SP1600
Electric drill	TAMIYA	N/A	https://www.amazon.co.jp /%E3%82%BF%E3%83% 9F%E3%83%A4-%E3% 82%AF%E3%83%A1% E3%83%8F%E3%83% 88%E3%83%84%E3% 83%BC%E3%83%AF%E3% 82%B7%E3%83%89%E3% 83%AB%E3%82%B7%E3%83% AA%E3%83%89%E3% 82%BA-No-42-%E9%9B% BB%E5%8B%95%E3%83% 83%8F%E3%83%B3%E3% %83%87%E3%82%A1%E3% 83%AA%E3%83%A5%E3%83% %8B%E3%83%BC-%E3% 83%9F%E3%83%A9%E3% 83%A1%E3%83%87%E3% 83%AB%E7%94%A8%E5%85% B7%A5%E5%85%B7/dp/B 01LZ05WWY/ref=sr_1_2?ad grpid=54785347873&dib=eyJ 2IjoiMSJ9.f61YHQv80N0nxws VOdlrIFtTsQoJICvSb4t4rVt97 FEBWkOo4ilX5O2lZH-5vADU HT9CRXO308QpVFqdBNli0C osd4iBSfSzEcKxP9HMX4DhiI S-Qko5ix33W7FjPQqpgTWbj3 CV_vBytnvfqvSyoGN9IB8445o 5Kc0pjeKPG-SRR3Ixpqr2-FT_ ZgUyWstoyQVFTcv_Rq_K4-E OWnuT41BBYtBh757EOAoBe z2lkCd6Psz99wZxfUuvzRUAH Ecq9QV6EmiT9LAY8dYYq08k aLt7Klqx2k-MdV8XbWRxgKk. 7TWzXBGA1PeNmB4me_Cz4 mMFAKBAv5H3YXAw_HPuLd E&dib_tag=se&hvadid=651687 588880&hvdev=c&hvexpln=0& hvlocphy=1009309&hvnetw=g& hvocijid=5538300633798619650 --&hvqmt=e&hvrand=55383006 33798619650&hvtargid=kwd-33 4267191534&hydadcr=4289_13 319726&jp-ad-ap=0&keywords= %E3%82%AF%E3%83%A4%E3% 83%8B%E3%83%A0%E3%83% 95%E3%83%A9%E3%83%8F%E3% 83%89%E3%83%A9%E3%83% 87%E3%83%89%E3%83%8A%E3% 83%A5%E3%83%8A%E3%83% 80%E3%83%87%E3%82%A3%E3% 83%AB&mcid=6b8ff8c984ba3d45 be477b407ef2d1ba&qid=1767395 580&sr=8-2
hand drill	VEAGIA	N/A	https://www.amazon.co.jp/dp/B0D2 9B4W18/ref=sspa_dk_detail_5?pd _rd_i=B0D29B4W18&pd_rd_w=xe kNz&content-id=amzn1.sym.f293b e60-50b7-49bc-95e8-931faf86ed1e &pf_rd_p=f293be60-50b7-49bc-95e8 -931faf86ed1e&pf_rd_r=HPW6B367R QC0VPB7WTTS&pd_rd_wg=E8mAS &pd_rd_r=dbeb0aa7-1bea-4f40-99dd -38bcb05c8234&sp_csd=d2lkZ2V0T mFtZT1zcF9kZXRhaWw&th=1
Medetomidine	FUJIFILM	135-17473
Midazolam	FUJIFILM	135-13791
Pin vise	ANEX	N/A	https://www.amazon.co.jp/%E3%82% A2%