Компьютерный скрининг и валидация препаратов Донг для изучения температуры и кашля

Краткое содержание

Здесь мы построили многомерную сеть «компонент-мишень-путь заболевания», интегрируя сетевой фармакологический скрининг, молекулярное докирование и валидацию мышиных моделей, индуцируемых LPS. Устанавливая чёткие ключевые параметры, она позволяет эффективно идентифицировать активные компоненты этнической медицины Тонг — Лэньюсяо Тан, а также проверять повторяемость процесса.

Аннотация

Систематический скрининг и проверка активных компонентов этнической медицины Дун Лэньюсяо Тан (LYXT; Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. и Zingiber officinale Roscoe) для лечения лихорадки и кашля эта схема разработала методологический процесс, интегрирующий прогнозирование фармакологии сети и экспериментальную верификацию. Во-первых, используя базу данных и аналитическую платформу традиционных китайских медицинских систем фармакологии (TCMSP), с пероральной биодоступностью (OB) ≥ 30% и сходством к лекарственному препарату (DL) ≥ 0,18 в качестве критериев в качестве критериев — ключевых активных компонентов LYXT, а связанные мишени для лихорадки и кашля собраны из нескольких баз данных заболеваний. Впоследствии была построена сеть взаимодействия «компонент-мишень-болезнь», и с помощью топологического анализа и генной онтологии (GO) и обогащения путей генов и геномов Киотской энциклопедии (KEGG) были определены основные мишени действия (CYP3A4, POR) и ключевые сигнальные пути (MAPK). Технология молекулярного стыковки была использована для проверки способности связывать ключевые компоненты с основными целями. Наконец, была установлена модель хронического бронхита у мышей путём интраназальной инстилляции липополисахарида (ЛПС), и была подтверждена противовоспалительная эффективность предполагаемых основных активных компонентов in vivo . Результаты показали, что такие компоненты, как β-каротин и сапаренол, открываемые сетевой фармакологией, проявляли разную степень противовоспалительных эффектов в экспериментах на животных, а их механизмы могут включать ингибирование сигнального пути MAPK/p38. Эта схема служит повторяемым примером для скрининга и исследования механизмов активных компонентов в традиционной этнической медицине.

Введение

Медицина Дун — это этномедицинская система в рамках традиционной китайской медицины (ТКМ), практикуемая этнической группой дун в провинциях Гуйчжоу, Хунань и Гуанси. Он представляет их накопленные эмпирические знания, развиваемые на протяжении поколений. Эта система объединяет травяную медицину, акупунктуру, установку костей, массаж, диетическую терапию и духовные практики. Её отличительные черты проистекают из исторической географической изоляции и устной традиции группы, которые способствовали формированию уникальной фармакопеи, основанной на практике, адаптированной к местной среде и культурным убеждениям.

Постоянная лихорадка, состояние, возникающее при неспособности организма контролировать свою температуру, является признаком дисфункциональности организма и жизненно важной функцией самозащиты^{человеческих клеток 1}. Существует множество различных методов лечения нагревающей медицины национальности донг. Среди них лихорадка делится на внутреннюю и внешнюю лихорадку. Внутренняя лихорадка относится к теплу, вызванному внутренними заболеваниями, а наружная — к теплу, вызванному холодом или^{травмой 2}. Экзогенная лихорадка обычно влияет на работу^{желудочно-кишечного тракта 3}. Национальные врачи Донга используют антипиретическую терапию для лечения температуры. Среди различных рецептов лекарств Дун, Lengyuxiao Tang (LYXT) — стандартный напой, используемый при лихорадке и боли, включающий Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. и Zingiber officinale Roscoe, которые регулярно взбивают и смешивают с^{водой 4}. Он в основном используется при лихорадке и головной боли, вызванной простудой.

Однако активные компоненты LYXT и их молекулярные механизмы остаются плохо изученными. Для устранения этого пробела в данном исследовании использовался сетевой фармакологический подход для прогнозирования потенциальных активных ингредиентов и мишеней. Для подтверждения этих прогнозов была выбрана хорошо известная модель воспаления лёгких, индуцированная липополисахаридами (LPS), поскольку она имитирует ключевые воспалительные реакции, связанные с лихорадкой и кашлем, включая инфильтрацию лейкоцитов и провоспалительную выработку цитокинов.

В процессе открытия лекарств различные исследования показали, что соединения могут взаимодействовать с несколькими белковыми мишенями. Таким образом, парадигма «один препарат — одна биологическая мишень» смещается в парадигму фармакологии систем. Соединение, взаимодействующее с несколькими биологическими целевые белками вирусов или бактерий, может обеспечивать полезные^{фармакологические эффекты 5}. Анализ сетевой фармакологии — это возможный и мощный способ смягчить дорогостоящий и продолжительный процесс открытия лекарств. Он может помочь нам лучше понять взаимодействия между лекарствами, предсказать механизмы, вызывающие заболевание, предложить альтернативные представители лекарств для предполагаемых фармакологических эффектов без побочных эффектов и предсказать биоактивность традиционной медицины. Химиоинформатические подходы, молекулярное стыкование и моделирование на основе данных успешно применяются для прогнозирования биоактивности и анализа механизмов. Эти методы способствуют быстрому обнаружению противовирусных и антибактериальных соединений с клиническим потенциалом, а также используются для объяснения эффективности и побочных эффектов^{препаратов 6}. Например, иматиниб мезилат, небольшая молекула, является ингибитором возбуждения при хроническом миелогенном лейкозе — синтезированного белка Bcr-Abl, но также блокирует активность ряда тирозинкиназ, таких как Abl, Kit и PDGFR⁷. Поэтому исследования по выявлению лекарств и их мишеней по-прежнему имеют решающее значение для потенциального лечения заболеваний, что помогает понять механизмы, с помощью которых лекарственные соединения работают для лечения заболеваний на молекулярном уровне. Методы вычислительного моделирования и сетевого анализа позволяют точно открывать потенциальные препараты и мишени, а мультипликативный анализ взаимодействия может стать теоретической основой и практическим руководством для экспериментальной проверки. В этой статье, используя инструмент поиска по ретривалу взаимодействующих генов/белков (STRING), базу данных для аннотации, визуализации и интегрированного открытия (DAVID) и других баз данных, в сочетании с анализом динамической генной онтологии (GO) и анализом путей, были собраны данные об активных ингредиентах и связанных с ними белках действия лекарства Донг LYXT при лихорадке и кашле, а также изучен механизм комбинированного лечения активных компонентов, которая может стать конкретным теоретическим ориентиром для дальнейших исследований лекарства Донг LYXT, предоставляет воспроизводимую стратегию изучения фармакологических механизмов этномедицинских формул и даёт представление о разработке новых противовоспалительных средств.

Протокол

Программа экспериментов на животных была рассмотрена Комитетом по этике экспериментальных животных Ланьчжоуского университета (D2024-292). Она соответствует принципам защиты животных, благополучию животных и этике, а также соответствующим положениям национальной этики по защите животных в области экспериментальных животных.

1. Подготовка базы данных и программного обеспечения

1. Скрининг активных ингредиентов и сбор целевых генов
   1. Получите доступ к базе данных и аналитической платформе фармакологии системы TCM (TCMSP) (https://tcmsp-e.com/) и проведите отдельный поиск по латинским названиям каждой травы в формуле LYXT, а именно Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. и Zingiber officinale Roscoe, в качестве ключевых слов для получения всех химических соединений, связанных с каждой травой.
   2. Применяйте критерии скрининга для фильтрации полученных соединений для каждой травы следующим образом: для Verbena officinalis L. установите пероральную биодоступность (OB) ≥ 30,1% и сходство с лекарством (DL) ≥ 0,12; для официального Зингибера Роско установите OB ≥ 60% и DL ≥ 0,13; для Semen Pharbitidis установите OB ≥ 16,93% и DL ≥ 0,50. Затем объедините списки отфильтрованных соединений из всех трёх трав и удалите дублирующиеся записи на основе уникальных идентификаторов TCMSP, чтобы получить окончательный список активных соединений в LYXT.
   3. Экспортируйте все целевые белки, связанные с этими активными соединениями, из базы данных TCMSP в виде таблицы с идентификаторами соединений и названиями белков, затем импортируйте этот список целевых белков в базу данных UniProt (https://www.uniprot.org/).
   4. Используйте инструмент отображения ID UniProtKB, чтобы преобразовать все имена целевых белков в официальные символы человеческих генов с указанием направления отображения от имени белка к имени, а также удалить все записи без действительного символа гена, чтобы сгенерировать окончательный список целевых генов, связанных с активными компонентами LYXT.
2. Анализ сбора генов мишени заболеваний и анализа перекрытия
   1. Скачайте гены, связанные с лихорадкой и кашлем, из базы данных GeneCards (www.genecards.org), ища по ключевым словам «fever» и «кашель», сохраняйте гены с показателем релевантности ≥ 5 и объединяйте результаты обоих поисков внутри базы данных.
   2. Скачайте гены, связанные с лихорадкой и кашлем, из базы данных терапевтических целей (TTD) (db.idrblab.net/ttd), ища по ключевым словам «fever» и «кашель», скачайте все связанные целевые гены и объедините результаты обоих поисков внутри базы данных.
   3. Скачайте гены, связанные с лихорадкой и кашлем, из базы данных PharmGkb (www.pharmgkb.org), ища отдельно по ключевым словам «fever» и «кашель», скачайте все связанные гены и объедините результаты обоих поисков внутри базы.
   4. Скачайте гены, связанные с лихорадкой и кашлем, из онлайн-базы данных Mendelian Inheritance in Man (OMIM) (www.omim.org), ища по ключевым словам «fever» и «кашель», скачайте все связанные гены и объедините результаты обоих поисков в базе данных.
   5. Скачайте гены, связанные с лихорадкой и кашлем, из базы данных DrugBank (go.drugbank.com)⁸ , ища по ключевым словам «fever» и «кашель», скачайте все связанные гены и объедините результаты обоих поисков в базе данных.
   6. Объединить списки генов, полученные из всех пяти баз данных, в единый комплексный список и удалить дублирующиеся символы генов, чтобы получить окончательный список генов, связанных с лихорадкой и кашлем.
   7. Сравните список целевых заболеваний из шага 1.2.6 с активным компонентом LYXT из шага 1.1.4, чтобы выбрать перекрывающиеся гены, общие для обоих списков, и экспортировать этот перекрывающийся список генов в CSV-файл.
3. Преобразование ID и анализ сечений
   1. Загрузите перекрывающийся список генов с шага 1.2.7 в среду R и получите доступ к сайту DAVID (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp).
   2. Загрузите перекрывающийся список генов в DAVID с видом Homo sapiens и типом списка в символ гена, затем запустите функциональный инструмент аннотации для анализа сечений.
   3. Преобразовать идентификаторы символов пересекающихся белков в ансамблевые идентификаторы с помощью функции преобразования идентификатора гена внутри DAVID, при этом направление преобразования задано от символа гена к идентификатору ансамбля.
   4. Экспортировать конвертированный список идентификаторов ансамбля вместе с оригинальными символами генов в виде CSV-файла для дальнейшего анализа обогащения.

2. Скрининг жизненно важных активных компонентов и целевых белков

1. Построение сети с составными целями
   1. Загрузите пересекающийся список генов из шага 1.2.7 и список активных компонентов LYXT из шага 1.1.4 в среду R, затем проведите сравнительный анализ для выявления соединений, связанных как с целью, так и с пересекающимися генами.
   2. Импортируйте данные о соотношении соединения и мишени в версию Cytoscape 3.8.1 и сгенерируйте сетевую диаграмму «LYXT-Fever and кашель-мишень» для визуализации взаимодействия между активными ингредиентами и их связанными мишеньями.
2. Сбор данных о взаимодействии белков и белков
   1. Импортируйте файл идентификатора гена для пересечения мишеней активного ингредиента LYXT и мишеней для лихорадки и кашля, полученных на шаге 2.1.1, в базу данных STRING на https://stringdb.org/, выберите Homo sapiens как вид и несколько белков в качестве метода обработки данных.
   2. Отфильтруйте взаимодействия между белком и белком, установив порог доверия ≥ 0,90 и изолируя белки с очень низкой корреляцией, затем сгенерируйте TSV-файл с отфильтроваными данными взаимодействия для дальнейшего анализа.
3. Подтверждение анализа пересечения
   1. Используйте язык R для анализа пересечения целевых белков активных ингредиентов и белков-мишень лихорадки и кашля, подтверждая перекрывающийся набор генов, выявленный на шаге 1.2.7.
   2. Подготовьте этот подтверждённый перекрывающийся набор генов для последующего анализа сетей взаимодействия белков и белков (PPI).

3. Скрининг ключевых целевых белков

1. Визуализация сети PPI
   1. Импортируйте отфильтрованные данные взаимодействия с шага 2.2.2 в версию Cytoscape 3.8.1 и используйте инструмент визуализации сети, чтобы нарисовать сетевую схему PPI.
   2. Установите и откройте плагин CytoNCA внутри Cytoscape, затем используйте этот плагин для проведения топологического анализа, вычисляя следующие параметры для каждого узла в сети: центральность степени (DC), центральность между степенями (BC), центральность близости (CC), центральность собственного вектора (EC), центральность сети (NC) и локальная средняя связность (LAC).
2. Идентификация ключевого белка мишени с помощью медианного скрининга
   1. Экспортировать рассчитанную топологическую таблицу параметров из CytoNCA в CSV-файл, содержащий все идентификаторы узлов и соответствующие им значения DC, BC, CC, EC, NC и LAC.
   2. Вычислите медианное значение центральной степени (DC) для всех узлов сети и определите все узлы с DC более чем вдвое превышающей медиану.
   3. Вычислите медианные значения центральности близкости (CC) и центральности промежуточности (BC) по всем узлам сети, затем из узлов, указанных в шаге 3.2.2, сохраняйте только те узлы, которые одновременно удовлетворяют CC больше медианного значения и BC больше медианного значения, следуя подходу скрининга, описанному Кибблом и ^{др. 9}.
3. Финальная компиляция ключевых целей
   1. Скомпилировать идентификаторы сохранённых узлов с шага 3.2.3 в список ключевых целевых белков и экспортировать этот список в CSV-файл.
   2. Применять это правило скрининга на основе медианы (DC больше двух раз медианы, CC больше медианы, BC больше медианы) как единственный критерий идентификации ключевых целей на протяжении всей рукописи, обеспечивая согласованность с единым подходом к скринингу, установленным в протоколе.

4. Анализ обогащения GO и анализ путей KEGG

1. Функциональный анализ обогащения с использованием базы данных DAVID
   1. Следуя методу, описанному Танабэ и ^др.10, загрузите пересекающийся список генов с шага 1.3.4 в формате символов гена в базу данных DAVID в https://david.ncifcrf.gov/, установите вид в Homo sapiens, а тип списка — в генный символ.
   2. Проведите анализ обогащения GO, выбирая GOTERM_BP_DIRECT для биологических процессов, GOTERM_CC_DIRECT для клеточного компонента и GOTERM_MF_DIRECT для молекулярной функции, а также проводите анализ обогащения путей KEGG, выбирая KEGG_PATHWAY.
   3. Установите порог значимости на p < 0,05 и примените коррекцию коэффициента ложного обнаружения (FDR) Бенджамини-Хохберга для множественных тестов, затем скачайте результаты обогащения в виде CSV-файлов с названиями терминов, количеством генов, p-значениями, скорректированными по FDR p-значениями и сопутствующими генами.
2. Генерация пузырьковых диаграмм с помощью облачной платформы OmicShare
   1. Импортируйте результаты обогащения GO из шага 4.1.3 в облачную платформу OmicShare в https://www.omicshare.com/tools и выберите инструмент GO enrichment bubble chart.
   2. Загрузите файл результатов с названиями терминов, количеством генов и p-значениями, затем настройте инструмент так, чтобы отображать топ-20 терминов с наименьшими p-значениями.
   3. Установите ось x для отображения коэффициента обогащения, ось y — для перечисления терминов GO, размер пузыря — для отображения количества генов, а цвет пузыря — для p-значения.
   4. Сгенерируйте пузырьковую диаграмму и скачайте её в виде изображения высокого разрешения.
3. Визуализация пути KEGG с помощью KEGG mapper
   1. Отсортируйте результаты обогащения путей KEGG по p-значениям в порядке возрастания и выберите топ-20 путей с наименьшими p-значениями.
   2. Для каждого выбранного пути получите диаграмму путей в базе данных KEGG в https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html.
   3. Определите целевые белки из пересекающегося списка генов, присутствующих в каждом пути, путём перекрёстного сопоставления с наборами генов путей из результатов обогащения.
   4. Получите доступ к инструменту картографирования KEGG по адресу https://www.kegg.jp/kegg/mapper/, выберите функцию цветного пути , введите список пересекающихся генных символов и идентификатор пути KEGG, а также сгенерируйте цветокодированную схему пути с выделенными белками, выделенными красным цветом.
   5. Скомпилируйте все результаты анализа обогащения, включая CSV-файлы GO для трех категорий: CSV-файл пути KEGG, изображение пузырьковой диаграммы и цветные диаграммы путей для 20 лучших путей, затем экспортируйте эти файлы для дальнейшего анализа.

5. Проверка молекулярного стыковки

1. Скачайте 3D-структуры жизненно важных белков (таких как CYP3A4 и POR, определённые как ключевые цели в сетевом анализе) из базы данных RCSB PDB в https://www.rcsb.org/, выберите структуры с разрешением ≤ 2,5 Å от Homo sapiens , содержащие кокристаллизованный лиганд для определения активного сайта, и скачайте файлы структурных данных активных соединений (включая бета-каротин, спатуленол и бета-ситостерол) из базы данных PubChem в формате SDF.
2. Подготовьте структуры белков с помощью AutoDockTools, удаляя молекулы воды и сокристаллизованный лиганд, добавляя полярные водороды и назначая заряды Gasteiger, затем сохраняйте подготовленные белки в формате PDBQT, конвертируйте соединенные файлы SDF в формат PDB с помощью Open Babel, обнаружите вращающиеся связи для каждого лиганда в AutoDockTools и сохраняйте лиганды в формате PDBQT.
3. Определите коробку стыковочной сетки с размерами 60 × 60 × 60 Å, центрированную по координатам сайта связывания кокристаллизированного лиганда, затем выполните молекулярное стыкование с использованием AutoDock Vina с исчерпывающей точностью 8 и num_modes 10, чтобы создать 10 поз связи для каждой пары лиганд-белок.
4. Импортируйте полученные docking файлы и соответствующие целевые файлы в PyMOL, определите и сохраняйте модель стыковки с наименьшей энергией связи (наиболее отрицательным значением) как репрезентативную позу.
5. Затем отправьте эту модель в базу данных PLIP в https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ для анализа взаимодействий между малыми молекулами и белками, включая водородные связи, гидрофобные взаимодействия, π-stacking и соляные мосты.
6. Рассчитайте и скомпилируйте энергии связывания всех активных компонентов LYXT против целевых белков, связанных с лихорадкой и кашлем, затем создайте сводную таблицу с названиями соединений, целевых белков, энергиями связывания (ккал/моль) и ключевыми типами взаимодействия для представления в разделе результатов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт R, используемый для анализа сетевой фармакологии, доступен в дополнительном файле 1.

6. Эксперимент на животных

1. Экспериментальная хронология
   1. Акклиматизируйте животных в течение 1 недели, затем проводите ЛПС или физиологический раствор в первый день, ежедневно вводите лекарственные процедуры с 7-го по 20-й день в течение 2 недель и проводите эвтаназию с взятием образцов на 21-й день.
2. Приобретение и группировка животных
   1. Купите 60 взрослых самцов мышей C57BL/6 весом 25 ±± 4 г, кормите мышей в течение недели, затем случайным образом разделите их на группу с нормальным физиологическим раствором (6 мышей) и группу с травмами LPS (54 мыши).
   2. На седьмой день перед началом лечения дополнительно случайным образом разделите повреждённую группу ЛПС на семь подгрупп по 6 мышей в каждой: модельная группа, положительная группа (дексаметазон, 50 мг·^кг-1·^d-1), группа лечения LYXT (200 мг·^кг-1·^d-1), бета-каротиновая группа (50 мг·^кг-1·^d-1), группа спатуленола (50 мг·^кг-1·^d-1), и бета-ситостероловой группе (50 мг·^кг-1·^d-1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение лечения и оценка результатов были слепыми.
3. Модель воспаления лёгких, вызванная LPS,
   1. Введите 2% пентобарбитала натрия внутрибрюшнической инъекцией в дозе 60 мг/кг для анестезии. Подтвердите умеренную глубину анестезии при отсутствии реакции с прижимом хвоста. Наконец, исходя из зарегистрированной массы тела, рассчитайте необходимый объём инъекции ЛПС при концентрации 10 мг/мл.
   2. Подготовьтесь к назовому введению, втянув в пипетку точно рассчитанный объём раствора LPS. Крепко держите мышь, сжав основание её хвоста правой рукой, а большим и указательным пальцами левой руки аккуратно закрепляйте голову за уши.
   3. Медленно выводите жидкость, пока на кончике пипетки не образуется небольшая капля (примерно 2 мкл). Аккуратно подведите каплю к правой ноздри мыши, пока она не коснётся. Сразу и быстро поднимите левую руку вверх на 30–40 см, затем аккуратно верните её и мышь в исходное положение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо обращать внимание на ноздри мыши, чтобы поддерживать вверх состояние.
   4. Тем же методом вводите небольшие жидкие капли в левую ноздрю мыши и последовательно добавляйте их в левую и правую ноздри до завершения жидкой инфузии.
   5. Затем отпустите мышь, закрепите её на доске скотчем и держите положение с поднятым животом и головой поднятой более 4 часов. После пробуждения мыши положите её обратно в клетку для наблюдения, следуя методу, описанному Лоренцом и ^{др. 11}.
4. Сбор бронхоальвеолярной жидкости в промывке
   1. Случайным образом разделите мышей с травмированной группой LPS на семь групп: отрицательную контрольную группу, модельную группу, положительную группу (дексаметазон, 50 ^mg.kg-1.d-1), группу лечения LYXT (200 ^mg.kg-1.d-1), бета-каротиновую группу (50 ^mg.kg-1.d-1), спатуленоловую группу (50 ^mg.kg-1.d-1) и бета-ситостероловую группу (50 ^mg.kg-1.d-1), в каждой группе по шесть мышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте LYXT следующим образом: смешайте порошок Pharbitis nil (L.) Choisy, Verbena officinalis L. и Zingiber officinale Roscoe в массовом соотношении 5:3:2.  Смешайте порошок с водой при 1:30 (г/мл) и рефлюкс при 80 °C в течение 2 часов. Фильтруйте и концентрируйте раствор (30 °C, 0,01–0,08 МПа) и растворяйте в воде для получения раствора объемом 2 г/мл. Бета-каротин, бета-ситостерол и спатуленол использовались в качестве эталонных стандартов для экспериментальной валидации. Вводите препараты каждой группе один раз в день в течение 2 недель, начиная с 1 недели после лечения ЛПС. Эвтаназия животных с помощью передозировки тиопентала (100 мг/кг), согласно Jin и др^{. 12}.
   2. Интубировать желудочек канюлей No23. Затем медленно введите 10 мл PBS в ткань лёгких под давлением 25 см H₂O, и повторите этот промыв примерно 6 раз, чтобы получить бронхоальвеолярную жидкость для промывания (BALF), следуя методу, описанному Пинейро и ^{др. 13}.
5. Анализ лейкоцитов и цитокинов в BALF и сыворотке
   1. Центрифугайте собранный BALF при 500 × г в течение 10 минут при 4 °C. Суспензировать клеточную гранулу в 1 мл PBS, разбавить 1:10 трипан-синим и подсчитать полные лейкоциты с помощью гемоцитометра под световым микроскопом при увеличении 400×.
   2. Соберите образцы BALF супернатанта и сыворотки из сердечной пункции.
   3. Измеряйте концентрации TNF-α, IL-1β и IL-18 с помощью коммерческих комплектов ELISA согласно инструкциям производителя, считывая поглощение при 450 нм с помощью считывателя микропластин и рассчитывая концентрации по стандартным кривым. Определите концентрацию белка в BALF с помощью анализа BCA.
6. Валидация активных компонентов с помощью анализа HE и WB
   1. Для выявления активных компонентов, способствующих эффективности LYXT, восстановить модель воспаления лёгких, вызванную LPS, согласно разделу 6.3.
   2. Купите 60 мышей, акклиматизируйтесь на неделю и случайным образом разделите на пять групп (n = по 12 каждая): модельная группа, группа LYXT (200 мг·^кг-1·^d-1), бета-каротиновая группа (50 мг·^кг-1·^d-1), спатуленольная группа (50 мг·^кг-1·^d-1) и комбинированная группа (по 25 мг·^кг-1·^d-1 ).
   3. Проводите ЛПС на 0-й день, а лечение — с 7-го по 20-й день, как описано в шаге 6.3. На 21-й день возьмите^14-ю ткань лёгких.
7. Гистологический анализ
   1. Зафиксируйте левую верхнюю долю лёгких в 4% параформальдегиде на 24 часа, вложите в парафин, вырезайте срезы диаметром 5 мкм и выполните окрашивание гематоксилином и эозином (HE).
   2. Изучайте срезы под световым микроскопом при увеличении 200× и 400× чтобы оценить инфильтрацию воспалительных клеток и утолщение альвеолярных стенок. Захватывайте репрезентативные изображения.
8. Вестерн-блот анализ
   1. Гомогенизировать ткань лёгких в буфере радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA) с помощью ингибиторов протеазы и фосфатазы. Центрифугировать при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C и определить концентрацию белка с помощью анализа на бицинхониновую кислоту (BCA).
   2. Загрузите 30 мкг белка на одну скважину на гели электрофореза с натрием додецилсульфатом и полиакриламидом (SDS-PAGE), перенесите на мембраны поливинилиденфтора (PVDF) и заблокируйте 5% обезжиренным молоком.
   3. Инкубировать первичными антителами против p-p38, p38, TNF-α, IL-1β, IL-18 и β-актина ночью при 4 °C, затем с вторичными антителами, конъюгированными с HRP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление антител приведено в Таблице материалов.
   4. Визуализируйте полосы с использованием подкладки ECL, захватывайте изображения и количественно оценивайте интенсивность с помощью ImageJ. Нормализовать экспрессию целевых белков до β-актина или общего p38.

Результаты

База данных TCMSP использовалась для сбора 409 активных ингредиентов LYXT. Из них 58 ингредиентов были взяты из Verbena officinalis L., 86 — из Semen Pharbitidis, а 265 активных ингредиентов — из Zingiber officinale Roscoe. Двадцать шесть ключевых активных ингредиентов были скринингированы согласно индексу: OB ≥ 30,1% и DL ≥ 0,12 для Verbena officinalis L., OB ≥ 60%, а DL ≥ 0,13 для Zingiber officinale Roscoe, OB ≥ 16,93%, а DL ≥ 0,50 для Semen Pharbit...

Обсуждение

В этой статье успешно выявлено 26 активных ингредиентов и 207 потенциальных мишеней LYXT — традиционного отвара из лекарства Донг, используемого при лихорадке и кашле. Ключевые результаты включают идентификацию CYP3A4 как критического целевого белка с помощью сетевого топологического анализа и экспериментальную валидацию LYXT, бета-каротина и спатуленола как активных соединений с значимыми противовоспалительными эффектами в модели воспаления лёгких, вызванной LPS. Эти результаты были дос...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Анти-IL-18	Proteintech, Ухань, Китай	27095-1-AP	Кролик поликлональный, 1:500
Анти-ИЛ-1 и бета;	Proteintech, Ухань, Китай	66737-1-Ig	Мышиный моноклональ, 1:500
Anti-p38	Proteintech, Ухань, Китай	14064-1-AP	Кролик поликлонал, 1:1000
Anti-p-p38	Proteintech, Ухань, Китай	28796-1-AP	Кролик поликлонал, 1:1000
Анти-TNF и альфа;	Proteintech, Ухань, Китай	80258-6-RR	Моноклональный кролик, 1:500
Анти-и бета;-актин	Proteintech, Ухань, Китай	66009-1-Ig	Мышиный моноклонал, 1:2000
AutoDock Vina	https://vina.scripps.edu/	Версия 1.5.6	Программное обеспечение для молекулярного стыковки
AutoDockTools	https://autodock.scripps.edu/	Версия 1.5.6	Инструмент подготовки молекулярного стыковки
Набор для анализа белков BCA	Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	23225	Для определения концентрации белка
Бета-каротин	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	83-46-5	Стандарт высокой чистоты — >95%.
Бета-ситостерол	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	83-46-5	Стандарт высокой чистоты — >95%.
Мыши C57BL/6	Центр медицинских животных Ланьчжоуского университета	-	Взрослый мужчина, 25 лет и плюс; 4 г
Цитоскейп	https://cytoscape.org/	Версия 3.8.1	Программное обеспечение для визуализации и анализа сетей
Дексаметазон	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	D4902	Положительный контроль
Подложка ECL	MilliporeSigma, Берлингтон, Массачусетс, США	WBKLS0500	Для обнаружения западных блот
Комплекты ELISA
GraphPad Prism	https://www.graphpad.com/	Версия 8.0 или выше	Программное обеспечение для статистического анализа и построения графиков
Гематоксилин и эозин (H& E) Набор для окрашивания	Beijing Solarbio Science & Science Technology Co., Ltd, Пекин, Китай	G1120	Для окрашивания лёгких тканей
Гистология
HRP-конъюгированный антимыши	Proteintech, Ухань, Китай	SA00001-7G	Вторичное антитело, 1:5000
HRP-конъюгированный антикролик	Proteintech, Ухань, Китай	SA00001-7H	Вторичное антитело, 1:5000
Комплект IL-18 ELISA	Beijing Solarbio Science & Science Technology Co., Ltd, Пекин, Китай	SEKH-0016	Для измерения IL-18 в BALF и сыворотке
IL-1 и бета; ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Science Technology Co., Ltd, Пекин, Китай	SEKM-0004	Для измерения IL-1 и бета; в BALF и сыворотке
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/	Версия 1.53	Программное обеспечение для анализа изображений
Липополисахарид (LPS)	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	L2630	From  Escherichia coli  O111:B4
Сырье LYXT	Университет Хуайхуа	-	Порошковая смесь   Pharbitis nil  (Л.) Choisy,  Verbena officinalis L., and  Zingiber officinale  Роско (5:3:2, ж/к/в)
Другие материалы
Пентобарбитал натрий	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	P3761	2% раствор для анестезии
PLIP	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	Профилер взаимодействия белка и лиганда
Мембраны PVDF	MilliporeSigma, Берлингтон, Массачусетс, США	IPVH00010	Для переноса западных блотов
PyMOL	https://pymol.org/	Версия 2.5	Программное обеспечение для молекулярной визуализации
R	https://www.r-project.org/	Версия 4.0 или выше	Программное обеспечение для статистических вычислений и графики
Спатуленол	MedChemExpress, Монмут Джанкшн, Нью-Джерси, США	HY-N1205	Стандарт высокой чистоты — >95%.
СТРУНА	https://stringdb.org/	-	Инструмент поиска взаимодействующих генов/белков
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	База данных фармакологии традиционных китайских медицинских систем
Тиопентал	Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США	T102	Для эвтаназии
TNF и альфа; ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Science Technology Co., Ltd, Пекин, Китай	SEKM-0034	Для измерения TNF-и альфа; в BALF и сыворотке
UniProt	https://www.uniprot.org/	-	База данных белковых последовательностей и аннотаций