Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Визуализация в реальном времени реакции на стресс, вызванный хозяином, в агрегатах Pseudomonas aeruginosa

173 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70682

⸱

15 мая 2026 г.

 , 
1Department of Molecular Medicine, University of South Florida

В этой статье

Краткое содержание

Агрегаты Pseudomonas aeruginosa демонстрируют повышенную толерантность к антибиотикам и иммунным клеткам. Роль целостности мембраны в выживании совокупности в настоящее время недостаточно изучена. В данном исследовании демонстрируется метод количественной оценки динамики динамики клеточной мембраны в агрегатах P. aeruginosa, чтобы понять, как целостность клеток может влиять на общую жизнеспособность агрегата.

Аннотация

Хронические инфекции, такие как при муковисцидозе (КФ), поддерживаются небольшими, высокотолерантными агрегатами Pseudomonas aeruginosa , которые сохраняются несмотря на иммунное и терапевтическое давление. В отличие от классических биопленок, эти агрегаты представляют собой отдельную патогенную единицу — микромасштабные, пространственно организованные сообщества, которые сохраняют структурную целостность и физиологический гомеостаз под стрессом, вызванным хозяином. Однако механизмы, позволяющие агрегатам оставаться целостными в таких условиях, и возможность выборочного нарушения этих гомеостатических процессов остаются слабо определены. Ключевым препятствием для устранения этого разрыва стало отсутствие инструментов, способных фиксировать динамические, пространственно разрешённые процессы, связывающие физиологический стресс с структурной стабильностью и коллапсом в реальном времени. В данном исследовании представлен интегрированный рабочий процесс визуализации и аналитики для количественной оценки агрегированных реакций на стрессоры, релевантные для хозяина. С помощью чувствительного к напряжению красителя DiBAC4(5) деполяризация мембран была измерена как ранний индикатор физиологического нарушения в агрегатах, образованных в синтетической среде мокроты муковисцидоза (SCFM2). Высококачественная конфокальная микроскопия с таймлапсом позволяет визуализировать агрегаты как в стабильных, так и в стресс-индуцированных состояниях, а сегментация изображений и анализ на основе вокселей обеспечивают количественное картирование пространственной гетерогенности целостности мембраны и разборки агрегата с разрешением одной клетки. Этот рабочий процесс создаёт воспроизводимую и адаптируемую платформу для связи физиологического стресса со структурными результатами в многоклеточных бактериальных агрегатах. Позволяя количественно анализировать процессы, сохраняющие — или нарушающие — целостность агрегата, этот подход создаёт критически важную основу для выявления и целенаправленного выявления гомеостатических механизмов, лежащих в основе устойчивости агрегатов, продвигая новые стратегии для нарушения этого клинически значимого способа бактериальной устойчивости.

Введение

Хронические бактериальные инфекции часто поддерживаются не крупными поверхностно прикреплёнными биопленками, а небольшими многоклеточными агрегатами, формирующимися в средах, связанных с хозяином. При муковисцидозе (CF) и других хронических заболеваниях дыхательных путей Pseudomonas aeruginosa обычно встречается в виде взвешенных агрегатов, встроенных в слизь или мокроту, а не как классические биопленки, прикреплённые к эпителиальной поверхности. Эти агрегаты представляют собой особый способ роста, характеризующийся микромасштабной пространственной организацией, выраженной физиологической гетерогенностью и исключительной толерантностью к иммунным и антимикробнымстрессорам 1,2,3,4. Несмотря на клиническую значимость, механизмы, управляющие устойчивостью агрегата, которые в данном протоколе определяются как способность сохранять целостность мембраны и пространственную организацию при таких стрессовых факторах, остаются плохо изученными, при этом предыдущие исследования больше сосредотачивались на компонентах матрицы, поддерживающих образование поверхностно прикреплённойбиопленки 5,6 .

Основным препятствием для изучения событий, способствующих дестабилизации агрегатов, таких как изменения мембранной деполяризации и архитектуры агрегата, является отсутствие экспериментальных рабочих процессов, фиксирующих динамические, физиологические и структурные изменения в реальномвремени 7,8. Традиционные массовые анализы и методы конечной визуализации не могут определить, как возникают стрессовые реакции внутри агрегатов, как эти реакции распределены пространственно или как физиологическое ослабление, такое как деполяризация мембраны и потеря ионного гомеостаза, приводит к ранним признакам клеточного стресса и последующему физическому коллапсу. Хотя конфокальная микроскопия широко применяется к поверхностно прикреплённым биопленкам, меньше подходов интегрируют временно-разрешённую визуализацию с количественным анализом, который напрямую связывает клеточную физиологию с архитектурой агрегата и активностью мембран.

Изменения потенциала бактериальных мембран служат ранним и чувствительным индикатором клеточного стресса и потери гомеостаза. Чувствительные к напряжению красители, такие как бис-(1,3-дибутилбарбитуровая кислота), пентаметин оксонол (DiBAC4(5)), накапливаются в деполяризованных клетках и обеспечивают неразрушительное, флуоресцентное измерение целостности мембраны. Хотя красители DiBAC использовались для оценки деполяризации мембран в планктонных культурах и поверхностно прикреплённыхбиопленках 9,10, их применение к многоклеточным агрегатам, особенно при физиологически значимых условиях роста и таймлапс-визуализации, было ограниченным.

Здесь мы представляем интегрированный процесс визуализации и аналитики, который позволяет в реальном времени визуализировать и количественно оценивать деполяризацию мембраны и структурные разрушения в агрегатах P. aeruginosa. Заполнители образуются в синтетической среде мокроты муковисцидозного (SCFM2) — химически определённой среде, которая повторяет ключевые питательные и ионные особенности дыхательных путей CF и поддерживает самопроизвольное формирование агрегата без наложенных поверхностей илипотока 11,12. В таких условиях P. aeruginosa образует взвешенные агрегаты размеров и структурной гетерогенности, сопоставимых с теми, что наблюдаются в образцах мокроты и дыхательных путей CF, что обеспечивает физиологически значимую платформу для изучения поведенияагрегатов 13 .

Используя таймлапс-конфокальную лазерную сканирующую микроскопию при контролируемой температуре и влажности, этот рабочий процесс фиксирует как стабильные агрегатные состояния, так и стресс-индуцированные состояния, отмеченные усиленной мембранной деполяризацией и потерей клеточного гомеостаза в течение длительного периода визуализации. Объединяя отчётность о мембранном потенциале на основе DiBAC с высокоразрешающей z-стековой визуализацией, этот метод позволяет количественно оценивать флуоресценцию DiBAC₄(5) на уровне одной ячейки, при этом значения отображаются и анализируются в пространственном контексте отдельных агрегатов. Сегментация изображений на основе вокселей позволяет параллельно количественно оценивать изменения в архитектуре агрегата и деполяризации мембран.

Важно, что хотя этот протокол демонстрируется на агрегатах P. aeruginosa , сформированных в SCFM2, рабочий процесс в целом обобщается. Стратегия визуализации, физиологические показания на основе красителей и аналитическая основа легко адаптируются к другим видам бактерий, средам, способствующим агрегированию, и стрессорам, включая антимикробные агенты, иммунные эффекторы или возмущения окружающей среды. Таким образом, такой подход предоставляет переносимую и воспроизводимую платформу для изучения стабильности бактериальных сообществ в различных экспериментальных контекстах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Вся работа с P. aeruginosa должна проводиться при соответствующих условиях содержания BSL-2 и институциональных одобрениях по биобезопасности. Реагенты и оборудование, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Образование агрегатов Pseudomonas aeruginosa в синтетической среде мокроты муковисцидоза (SCFM2)

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается подготовка культур P. aeruginosa и формирование подвешенных многоклеточных агрегатов в физиологически значимых условиях, имитирующих среду дыхательных путей муковисцидозии.

  1. Подготовка бактериальных культур
    1. За день до эксперимента инокулировать дикий тип Pseudomonas aeruginosa PAO1, несущий плазмиду pMRP9-1 (GFP)14 , из замороженных глицероловых запасов в лизогенный бульон (LB) объемом 5 мл.
    2. Добавьте карбенициллин (300 мкг/мл) для поддержания отбора плазмид.
    3. Выращивайте культуры за ночь при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин.
  2. Обратное разбавление и подготовка к образованию заполнителя
    1. В день эксперимента ночные культуры с обратной разбавкой 1:5 (1 мл за ночь: 4 мл фунтов. На этом этапе антибиотики не добавляются повторно; остаточная переноска минимальна и не влияет на рост).
    2. Выращивайте культуры в течение ~2 часов при 37 °C с встряхиванием (200 об/мин) до логарифмической фазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки обычно находятся в ранней экспоненциальной фазе после ~2 часа в таких условиях. Кроме того, клетки затем промываются перед прививкой в SCFM2, чтобы минимизировать остаточный перенос антибиотиков.
  3. Подготовка и уравновесение SCFM2
    1. Примерно за 30 минут до окончания периода обратного разбавления предварительно подготовленный SCFM2 в стерильные трубки нагрейте до 37 °C.
    2. Для съёмки в оптической антенне со стеклом и 4 лунками выделяйте 500 мкл SCFM2 на каждую яму. Подготовьте избыточный объём с учётом ошибок пипетирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: SCFM2 хранится при 4 °C. Предварительное прогревание минимизирует температурный шок и улучшает воспроизводимость образования заполнителей.
  4. Промывка и стандартизация инокуля
    1. Культивирование гранул центрифугированием при 4200 г в течение 4 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуются расчеты на обороты, радиус ротора для вращающегося ротора ковша составляет 172 мм.
    2. Удалите супернатант и ревзуспензуйте гранулы в 3 мл стерильного PBS (pH 7.0).
    3. Повторите этапы мытья ещё дважды (всего три раза).
    4. Измерьте OD₆₀₀ и рассчитайте объём, необходимый для инокуляции SCFM2 до начального OD₆₀₀ 0,05.
    5. Кратковременное вихрь для гомогенизации клеток и инокуляции каждой ямы с 500 мкл SCFM2.
  5. Образование заполнителей в статических условиях
    1. Инкубировать SCFM2 статически при 37 °C в течение 4 часов для формирования агрегата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 4-часовая инкубация воспроизводимо даёт взвешенные агрегаты размерами и гетерогенностью, сопоставимыми с теми, что наблюдаются в образцах мокроты и дыхательных путей CF, при этом минимизируя созревание на поздних стадияхбиопленки 1,15.

2. Подготовка иммунно-ассоциированного стрессора (эластазы нейтрофилов человека)

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается подготовка стрессора, полученного от хозяина, используемого для индуцирования клеточного стресса и дестабилизации бактериальных агрегатов.

  1. Восстановление и хранение эластазы человеческих нейтрофилов (HNE)
    1. Восстановить эластазу человеческих нейтрофилов в соответствии с рекомендациями производителя с использованием ацетата натрия 50 мм, 200 мМ NaCl и стерильной воды.
    2. Приготовьте раствор запаса 50 мкг/л и простерилизуйте фильтром с помощью фильтра 0,2 мкм.
    3. Аликвот в объёмах 50 мл и хранение при −20 °C.
    4. Накануне использования разморозите аликвот при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Алицитирование минимизирует циклы замораживания и оттаивания, что может снизить ферментативную активность и ввести изменчивость. Аликвоты стабильны при 4 °C примерно в течение месяца.

3. Подготовка и применение DiBAC4(5) для сообщения о деполяризации мембраны

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается подготовка и использование чувствительного к напряжению красителя для визуализации деполяризации мембраны внутри агрегатов.

  1. Подготовка и хранение DiBAC4(5)
    1. Начните с приготовления стандартного раствора DiBAC4(5). Восстановить порошокDiBAC 4(5) в безводном DMSO до 1 мг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ВосстановлениеDiBAC 4(5) в DMSO следует стандартным рекомендациям производителя.
    2. Аликвот в объёме 100 мкл и хранится при −20 °C, защищённый от света.
    3. Используйте каждую аликвоту не более двух раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DiBAC4(5) функционально эквивалентен DiBAC4(3), но здесь выбран для соответствия спектрам возбуждения/излучения GFP. В этом протоколе DiBAC4(3) используется только для дополнительного окрашивания, обсуждаемого в разделе результатов. Основным красителем, используемым в этом протоколе, является DiBAC4(5).

4. Таймлапс-конфокальная визуализация мембранной деполяризации в агрегатах P. aeruginosa

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап описывает получение высококачественных, временно разрешенных конфокальных изображений для фиксации динамических, физиологических и структурных изменений в агрегатах.

  1. Микроскоп и подготовка камеры в окружающей среде
    1. Установите нагреваемую вставку для микропластин или камеру окружающей среды на стадии конфокального микроскопа.
    2. Включите контроль температуры и влажности минимум за 1 час до съёмки и установите на 37 °C.
    3. Во вкладке Acquisition найдите вкладку Laser и примерно за час до начала включите необходимые лазеры для достаточного разогрева (аргоновый лазер для GFP; DPSS 561-10 для DiBAC4(5)) (дополнительный рисунок 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильный контроль окружающей среды снижает дрейф фокуса и сохраняет целостность агрегата во время экспериментов с длительным таймлапсом.
  2. Применение иммунного стрессора
    1. После 4 часов формирования заполнителя добавляют HNE в экспериментальные скважины до конечной концентрации 20 мкг/л 16.
    2. Оставляйте контрольные скважины без обработки.
    3. Перенесите антенну с четырьмя ядрами на стадию микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HNE был приготовлен в физиологически значимых концентрациях (мкг/л) на основе заявленных уровней в индуцированной мокроте, а не в виде концентрированного бульона. Концентрации, использованные для этого исследования, можно найти у McGarvey et al.16 при IS (индуцированной мокроте), NE-AAT (комплекс NE/a1-антитрипсинов), HV (здоровый доброволец).
  3. Определение агрегированных областей интереса
    1. Используя вкладку Locate и объектив 20×, включите Пропускаемый свет для выявления областей, богатых агрегированными с помощью ярких изображений (дополнительный рисунок 1B).
    2. При использовании яркой визуализации перейдите на вкладку «Получение» и сохраните координаты x-, y- и z-координаты с помощью модуля «Позиции» (дополнительный рисунок 1C).
    3. Повторяйте это для нескольких технических репликий на одну скважину.
  4. Высокоразрешённое z-стек и временные ряды
    1. Переместитесь в сохранённую позицию и переключитесь на объектив с погружением в масло 63×.
    2. Нанесите погружное масло перед тем, как разместить блюдо.
    3. Во вкладке Acquisition настройте каналы с помощью Smart Setup (дополнительный рисунок 1D): GFP (488/509 нм) – назначить зелёный,DiBAC 4(5) (591/615 нм) – назначить красный.
    4. Перейдите в режим Live View, затем с помощью модуля Z-stack определите нижнюю часть скользящего покрытия, отрегулировав тонкий фокус, и установите его как первую z-позицию, нажав Set First (дополнительный рисунок 1E).
    5. Двигайтесь вверх, пока диапазон не покажет 60 мкм, и установите конечную z-позицию, нажав Set Last (дополнительный рисунок 1E).
    6. Отключите Live View и активируйте Definite Focus. Выберите «Найти поверхность», а затем выберите «Сохранить фокус» только после того, как статус покажет «Обнаружен рефлекс» (дополнительный рисунок 1F).
    7. Повторяйте калибровку фокуса для каждой сохранённой позиции с помощью модулей Z-стека и Definite Focus .
    8. Настройте получение временных серий так, чтобы каждое положение снималось каждые 3 минуты в течение 6 часов (дополнительный рисунок 1G).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол здесь можно приостановить для размораживания, добавления и инкубации красителяDiBAC 4(5), и его можно возобновить после инкубационного периода.
    9. Выберите «Начать эксперимент».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трёхминутные интервалы балансируют временное разрешение с аспектами фототоксичности и фотоотбеливания.
  5. Сложение и инкубация DiBAC4(5)
    1. ДобавьтеDiBAC 4(5) в каждую скважину до конечной концентрации 5 мкг/мл 9.
    2. Инкубировать в темноте 30 минут, прежде чем начать таймлапс-съёмку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инкубация позволяет уравновесить краситель, минимизируя фоновую флуоресценцию.

5. Количественный анализ изображений структуры агрегата и ко-локализацииDiBAC 4(5)

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается количественный рабочий процесс, связывающий мембранную деполяризацию с архитектурой агрегата и дестабилизацией.

  1. Импорт изображений и разделение каналов
    1. Загружайте изображения (.czi или эквивалент) в программу Imaris x64 версии 10.2.0 или выше.
    2. Проверьте калибровку вокселя, проверив, что размеры пикселей x, y и z (размер вокселя) в метаданных изображения точно отражают параметры конфокального захвата (объектив, зум, размер z-step). Неправильная калибровка приведёт к ошибкам в пространственных и объемных измерениях.
  2. Поверхностное рендеринг бактериальных агрегатов и сигналаDiBAC 4(5)
    1. Используйте модуль Surfaces для рендеринга агрегатов P. aeruginosa :
      1. В разделе «Настройка сегментации» выберите канал GFP (дополнительный рисунок 2A).
      2. Выберите включить разделённые касающиеся объекты (Region Growthing) и отрегулировать порог интенсивности для полного захвата агрегатов (дополнительный рисунок 2B).
      3. В модуле Фильтр Seed Points измените тип фильтра на Количество вокселей Img = 1 и установите на 90% (Дополнительный рисунок 2C).
      4. После обработки рендеринга установите поверхности на 100% (дополнительный рисунок 2D).
    2. Завершить рендеринг и назначить зелёную окраску поверхностям бактерий (дополнительный рисунок 2E).
    3. Повторите рендеринг для каналаDiBAC 4(5) и назначите красный цвет.
  3. Ко-локализация и количественная оценка на основе объёма
    1. Выберите поверхностный рендерингDiBAC 4(5) (дополнительный рисунок 3A) и определите, в какой временной точке будет проводиться анализ ко-локализации.
    2. Перейдите к вкладке Статистика > Подробная вкладка > Конкретные значения (дополнительный рисунок 3B).
    3. Определите ко-локализацию, выбрав объекты с наименьшим расстоянием до поверхностей бактерий 0,00 (дополнительный рисунок 3B).
    4. Найти Редактировать, затем дублировать эти объекты, чтобы создать поверхность, перекрывающуюся с DiBAC с ячейками (дополнительный рисунок 3C). Обязательно переименуйте эту поверхность, чтобы подчеркнуть её перекрывающиеся качества.
    5. Во вкладке «Подробнее» в разделе «Средние значения» запишите суммированные значения объёма в каждом выбранном времени для: (1) Общий сигнал DiBAC4(5) (дополнительный рисунок 3D); (2) Ко-локализованный сигнал DiBAC4(5) (дополнительный рисунок 3E).
    6. Вычислите процент пересечения следующим образом:
      figure-protocol-1
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процентное перекрытие отражает долю сигнала DiBAC₄(5), ассоциированного с клетками, внутри агрегатов, отражая деполяризацию мембраны в определённый момент времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя этот рабочий процесс демонстрируется с использованием агрегатов P. aeruginosa в SCFM2 и подвержен нагрузке HNE, он в целом адаптируется к другим бактериальным видам, средам, поддерживающим агрегаты, флуоресцентным репортёрам и стрессорам, включая антимикробные агенты или возмущения окружающей среды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В описанном выше протоколе приведён метод отслеживания изменений в динамике мембран агрегатов P. aeruginosa, смоделированных в среде лёгких с муковисцидозом (рисунок 1). С помощью дикого типа штамма PAO1 с плазмидой pMRP9-1 (GFP) (рисунок 1A), HNE для имитации иммунного стресса и мембранного красителяDiBAC 4(5) (рисунок 1C) были количественно оценены изменения в ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мембранный потенциал служит чувствительным, ранним показателем клеточного стресса и нарушенного гомеостаза. Внутри многоклеточных бактериальных агрегатов эти физиологические изменения происходят до и могут вызывать последующую структурную дестабилизацию. Здесь мы представляем рабочий процесс на основе визуализации, который использует медленно откликающийся, потенциально чувствительный краситель бис-(1,3-дибутилбарбитуровая кислота) пентаметин оксонол (DiBAC4(5)) для отслеживан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

S.E.D поддерживается стартовыми средствами, предоставленными кафедрой молекулярной медицины Университета Южной Флориды, а также исследовательскими грантами от Фонда муковисцидоза (CFF) (DARCH19G0, DARCH22P0, DARCH25G0).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,3-дибутилбарбитуровая кислота) пентаметин оксонол (DiBAC4(3))AAT Bioquest21411  липофил, анионная молекула и bbsp;
1,3-дибутилбарбитуровая кислота) пентаметин оксонол (DiBAC4(5))AAT Bioquest21410  липофил, анионная молекула и bbsp;
Карбенициллин  Международные исследовательские продукты  C46000-5.0используется для отбора GFP, экспрессирующих штамм PAO1
Cellvis с 4-камерным стеклянным дном 35 ммФишерNC0600518Стеклянная камера позволяет использовать взвешенные заполнители в растущих средах, при этом изображение и БСП;
ЦентрифугаBeckman Coulter Life Sciences B06320в паре с вращающимся ковшовым ротором Beckman Coulter Life Sciences SX4400 (номер детали B01425)
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM)ZeissLSM 880модель CLSM, используемая для экспериментов, описанных в этом протоколе, больше недоступна, но LSM 900 является обновлённым эквивалентным вариантом 
Культивные трубкиДженеси21-130стерильный; полипропилен 
DAPIТермо Фишер62248используется для предлагаемых будущих применений для окрашивания нейтрофилов с помощью DiBAC4(5)
Одноразовые кюветы Технология бренда759086D1,5 мл, полумикро
DMSOМиллипор-Сигма276855-100МЛиспользовался для восстановления DiBAC4(3,5)
DRAQ5Термо Фишер65-0880-92используется для предполагаемых будущих применений для окрашивания нейтрофилов с помощью DiBAC4(3)
Экологическая палата для CLSMPECONLSM 880эта система была создана исключительно для продукции Zeiss и обычно называется «Инкубационная система S», и все компоненты можно заказывать через Zeiss в качестве дополнения к системе LSM 880 (или аналогичной)
Гентамицин сульфат ФишерBP918-1используется для выбора RFP, экспрессирующих штамм PA1633
Glycerol Дженеси18-205используется для замораживания штаммов при длительном хранении при -80  ° C
Человеческая нейтрофильная эластаза (HNE)Миллипор-Сигма324681-50UGпосле восстановления он стабилен в течение 1 месяца на 4  ° C или 1 год в 20  ° C
Программное обеспечение Imaris x64Oxford Instruments Версия 10.2.0
Погружное масло  Электронная микроскопия Scienes 16919-12не высыхающий; стандартизирован на 37  ° C
Incubator Benchmark ScientificH1001-Mспособен трясти
Лизогенный бульон (LB)Дженеси11-118Микс Миллер
mCherry plasmid получено от коллабуратора и nbsp;
PA1633 транспозонный мутантный штамм  получено от коллабуратора и nbsp;
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Термо Фишер3002pH 7.0
Ацетат натрияТермо ФишерAM97403M; pH 5,5; Без РНазы
Хлорид натрияFisher S271-500использовался для реорганизации HNE
Спектрофотометр VWR634-0882используется для измерения плотности клеток при инокуляции PAO1/PA1633 в SCFM2
Стерильный .22µ m ФильтрДженеси25-244использовался для очистки восстановленного HNE
Стерильные микроцентрифугальные трубкиДженеси24-272LR0,6 мл
Стерильный шприцФишер14955459использовался для очистки восстановленного HNE
SX4400 — качающийся ковш-ротор и nbsp;Beckman Coulter Life Sciences B01425в паре с центрифугой Beckman Coulter Life Sciences (номер детали B06320)
Синтетическая мокроточная среда при муковисцидозе (SCFM2)SyntheBiome10002-500Партия #: 001-CF2-0724
Ультра Чистая ВодаДженеси18-195использовался для восстановления HNE
Дикий тип Pseudomonas aeruginosa PAO1 с pMRP9-1 Plasmid Эта плазмида pMRP9-1 содержит GFP и экспрессирует резистентность к карбенициллину 
ZEN Black Edition 2.3, программное обеспечение Zeiss Imaging  Zeissсовместим с LSM 880

Ссылки

  1. Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. mBio. 8 (2), e00240-17(2017).
  2. Rada, B. Interactions between neutrophils and Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis. Pathogens. 6 (1), 10(2017).
  3. Kragh, K. N., Tolker-Nielsen, T., Lichtenberg, M. The non-attached biofilm aggregate. Commun Biol. 6 (1), 898(2023).
  4. Gannon, A. D., Matlack, J., Darch, S. E. Exploring aggregation genes in a P. aeruginosa chronic infection model. J Bacteriol. 207 (1), e00429-24(2025).
  5. Melaugh, G., et al. Distinct types of multicellular aggregates in Pseudomonas aeruginosa liquid cultures. npj Biofilms Microbiomes. 9 (1), 52(2023).
  6. Letizia, M., Diggle, S. P., Whiteley, M. Pseudomonas aeruginosa: Ecology, evolution, pathogenesis and antimicrobial susceptibility. Nat Rev Microbiol. 23, 701-717 (2025).
  7. Andersen, J. B., et al. Identification of small molecules that interfere with c-di-GMP signaling and induce dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 59(2021).
  8. Andersen, J. B., et al. Induction of native c-di-GMP phosphodiesterases leads to dispersal of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 65 (4), e02431-20(2021).
  9. Lee, W., Woo, E. R., Lee, D. G. Phytol exhibits antibacterial activity by inducing oxidative stress in Pseudomonas aeruginosa. Free Radic Res. 50 (12), 1309-1318 (2016).
  10. Shirazi, F., et al. Biofilm filtrates of Pseudomonas aeruginosa inhibit preformed Aspergillus fumigatus biofilms via apoptosis. PLoS One. 11 (3), e0150155(2016).
  11. Palmer, K. L., Mashburn, L. M., Singh, P. K., Whiteley, M. Cystic fibrosis sputum supports growth and key physiological traits of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (15), 5267-5277 (2005).
  12. Turner, K. H., et al. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  13. Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools for real-time assessment of a Pseudomonas aeruginosa infection model. J Vis Exp. (170), e62420(2021).
  14. Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
  15. Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4779-4784 (2018).
  16. McGarvey, L. P. A., et al. Cytokine concentrations and neutrophil elastase activity in bronchoalveolar lavage and sputum in cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 1 (4), 269-275 (2002).
  17. Adams, D. S., Levin, M. Measuring resting membrane potential using fluorescent voltage reporters. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 459-464 (2012).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  19. Lagendijk, E. L., et al. Genetic tools for tagging Gram-negative bacteria with mCherry for visualization. FEMS Microbiol Lett. 305 (1), 81-90 (2010).
  20. Meylan, S., et al. Carbon sources tune antibiotic susceptibility in Pseudomonas aeruginosa via TCA cycle control. Cell Chem Biol. 24 (2), 195-206 (2017).
  21. Wickremasinghe, H., et al. Polymyxin B and meropenem synergistically kill multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and reduce biofilm formation. Antibiotics (Basel). 10 (4), 405(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.