Лизосомное профилирование с помощью LysoTracker для количественной оценки клеточного старения у фибробластов человека

Краткое содержание

В этой статье представлен протокол LysoTracker с живыми клетками для измерения ремоделирования лизосомных изменений во время старения в фибробластах IMR-90 человека.

Аннотация

Клеточное старение — это стабильное состояние остановки клеточного цикла, связанное с характерными фенотипами, включая увеличенную морфологию клеток, изменённую секреторную сигнализацию и выраженное лизосомное ремоделирование. Стареющие клетки обычно демонстрируют расширение кислого эндо-лизосомного компартмента, сопровождаемое изменениями световой кислотности и деградационной способности, что создаёт возможность для простых живых показаний ремоделирования органелл, связанных с старением. В данной работе описывается протокол живой клеточной визуализации, использующий LysoTracker Deep Red — ацидотропный флуоресцентный краситель — для создания косвенного, pH-зависимого прокси для кислого органеллового компармента в качестве коррелята стареющей нагрузки. Метод продемонстрирован на фибробластах лёгких IMR-90, проходящих репликационное старение в ходе серийного перехода. Протокол подробно описывает культивирование клеток и отслеживание прохождения, окрашивание LysoTracker, флуоресцентную визуализацию и количественное определение интенсивности сигнала лизосомы и положительной площади на клетку. Окрашивание, связанное с старением β-галактозидазой (SA-β-Gal), на параллельных культурах включено как необязательный подтверждающий маркер, а не как эталонный стандарт. Репрезентативные результаты показывают более высокий сигнал ацидотропного флуоресцентного красителя и более крупные лизоположительные участки в поздних культурах, чем в ранних контрольных системах, что соответствует расширению кислого органеллового компартмента во время старения. Поскольку показатель зависит от объёма компартмента, градиента протонов и доступности красителей, его лучше интерпретировать как косвенную корреляцию лизосомного ремоделирования, а не как прямую меру количества лизосом или биогенеза. Протокол прост в принятии и может адаптироваться к другим типам клеток или стрессам, вызывающим старение, обеспечивая практическое количественное дополнение к традиционным анализам конечных точек.

Введение

Клеточное старение — это устойчивая программа остановки клеточного цикла, активируемая различными стрессами и триггерами, связанными с ^{возрастом} 1,2,3,4. Стареющие клетки классически идентифицируются по созвездию маркеров, поскольку ни один маркер не является полностью специфичным. Характерные признаки включают увеличенную, уплощенную морфологию клеток, активность β-галактозидаз, ассоциированную с возрастанием (SA-β-Gal), формирование очагов повреждения ДНК и провоспалительный секреторный профиль (SASP^)2,4,5. Среди этих признаков лизосомное ремоделирование выделяется как заметная и функционально значимая черта^{старения 6,7}. Стареющие клетки демонстрируют глубокие лизосомные изменения, включая резкое увеличение размера и количества лизосом, а также изменённую функцию (часто с частичной нейтрализацией pH лизосомы и накоплением неразлагаемого материала)6,7,8,9. Это лизосомное расширение способствует увеличению активности SA-β-Gal — установленного маркера старения, отражающего повышенную лизосомную β-галактозидазную активность в стареющих^{клетках} 10,11,12. Действительно, окрашивание SA-β-Gal использует это явление, используя субоптимальную pH (6.0) инкубацию для селективного осаживания красителя в лизосомах стареющих клеток, которые накопили фермент и демонстрируют более высокий pH, чем молодые^клетки 10,12,13.

Лизосомы играют центральную роль в обороте белков и сигнализации, и их нарушение регуляций теперь считается отличительной чертой старения^и старения 1,2,4,6. Стареющие клетки часто проявляют лизосомную дисфункцию, о чём свидетельствуют повышенные люминальные pH, изменённая активность ферментов и накопление липофусцина (аутофлуоресцентного пигмента окисленных макромолекул)^6,14. Лизосомный биогенез часто повышается или изменяется через координированную лизосомную сеть экспрессии и регуляции (CLEAR) под контролем транскрипционного фактора EB (TFEB) и связанных^{факторов 6,7,15}. Этот процесс может увеличивать лизосомную массу у стареющих клеток по мере их адаптации к стрессу путём расширения деградирующего^{компартмента 6,7,10}. В то же время стареющие клетки могут испытывать снижение функционирования лизосомы (например, снижение кислотности), что может влиять на такие процессы, как аутофагия, и обеспечивать устойчивость к определённым стрессам, включая ферроптотическую^{клеточную смерть 6,8}. Измерение содержания и функции лизосом, таким образом, является ключевым для понимания и идентификации старения ^6,16.

LysoTracker Deep Red — это мембранно-перимесцентный флуоресцентный зонд, который избирательно накапливается в кислых органеллах через протонирование, вызванное протонированием, через лизосомную^{мембрану 16,17}. Полученный сигнал отражает совокупный объём кислотного компартмента, силу градиента протона и локальную доступность красителя, а не лизосомную массу, и может смещаться с изменениями pH или состояния мембраны лизосомы, которые происходят независимо от общего количества^{лизосом 6,16}. В контексте клеточного старения клетки демонстрируют расширенные и более интенсивно маркированные LysoTracker-положительные компартменты по сравнению с предшественными^{аналогами 9}, что соответствует расширению кислого органельного компартмента и увеличению лизосомного биогенеза, описанного в биохимических и ультраструктурных^{исследованиях 6,7,10}. Этот подход с живыми клетками обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционным окрашиванием конечных точек SA-β-Gal: он позволяет проводить количественный и пространственно разрешённый анализ отдельных клеток, может комбинироваться с другими флуоресцентными репортерами, не требует фиксации и фиксирует гетерогенность за счёт отчёта непрерывных признаков, а не бинарной конечной^{точки 6,16}. На протяжении всего этого протокола сигнал LysoTracker используется как индикатор кислотного органелла в живых клетках, и зависящие от состояния изменения интерпретируются соответственно, а не рассматриваются как абсолютная мера количества^{лизосомы 6,16}.

Этот протокол подробно описывает использование LysoTracker Deep Red для профилирования лизосомных изменений в IMR-90 фибробластах, проходящих репликационное старение. IMR-90 — это нормальная человеческая диплоидная фибробластная линия (женского происхождения, лёгкие плода), широко используемая в исследованиях старения; как и другие первичные фибробласты (например, WI-38), клетки IMR-90 переходят в старение после ~50–60 удвоения популяции (предел Хейфлика) из-за укорачивания теломер и повреждения ДНК, сигнализирующих ^18,19. Протокол описывает, как культивировать клетки IMR-90 для индуцирования старения посредством серийного проходжения, проверять старение по морфологии и окрашиванию SA-β-Gal, а также окрашивать живые культуры с помощью LysoTracker Deep Red для флуоресцентной^{визуализации} 5,10,12,13. Включены получение и анализ изображений, с количественными показаниями, такими как количество лизосомных на клетку, общая площадь лизосомы на клетку и средняя интенсивность флуоресценции. Особое внимание уделяется экспериментальному контролю и вопросам безопасности, включая аккуратное обращение с красителями и фиксаторами, минимизацию фототоксичности во время визуализации и учет клеточной аутофлуоресценции в старых клетках. Метод продемонстрирован с помощью репликативного старения, но может быть адаптирован к другим моделям, включая лекарственно-индуцированную старение (например, лечение доксорубицином или этопозидом) или стресс-индуцированное преждевременное старение (SIPS) окислителями 2,3,4,19,20. В каждом случае показания на базе LysoTracker следует сравнивать с соответствующими контролями (пролиферирующие или спокойные клетки) и, по возможности, перекрёстно валидировать хотя бы одним традиционным маркером старения (например, экспрессией SA-β-Gal или p16INK4a)3,5,12,13.

Профилирование лизосомного профилирования живых клеток заполняет практический пробел в тестах старения, обеспечивая воспроизводимое, одноклеточное измерение разрешения ключевого фенотипа органеллы — расширения лизосом, напрямую связанного с функцией стареющих клеток (например, повышенной деградационной способности и секреторной активности)2,3,4,6 . Поскольку окрашивание LysoTracker совместимо с высокопроизводительной визуализацией и проточной цитометрией, протокол можно масштабировать для таких применений, как скрининг лекарств (например, тестирование сенолитиков или модуляторов лизосомной функции)^2,3,6. В будущем лизосомные особенности на клетку, генерируемые этим протоколом, будут поддаваться следующим методам классификации, включая модели машинного обучения; Обучение и валидация таких классификаторов выходят за рамки данного протокола. В целом, этот метод (рисунок 1) позволяет визуализировать и количественно оценивать лизосомное измерение биологии старения, предоставляя представление о том, как лизосомный биогенез и морфология меняются при старении или стрессе, а также предоставляя платформу для тестирования вмешательств, направленных на лизосомы в стареющих клетках. Рабочий процесс анализа изображений, используемый для сегментирования ядер, определения областей, связанных с клетками, определения порогов и количественной оценки особенностей LysoTracker, а также воспроизведения анализов по яме и по ячейке, представленных здесь, реализован как открытый дополнительный пакет (SenTrackLite v0.5.0), предоставляемый как дополнительный файл 1 и архивированный с постоянным DOI для цитирования и повторного^{использования 21}.

Рисунок 1: Обзор анализа лизосомного старения живых клеток. (A) Экспериментальный рабочий процесс. Клетки окрашиваются в живом виде с помощью LysoTracker Deep Red и ядерного красителя, снимаются стандартной флуоресцентной микроскопией и по желанию обрабатываются параллельно для окрашивания SA-β-Gal для валидации. (B) Измерения по ячейкам, полученным на основе изображения. Ядерный канал используется для идентификации отдельных клеток, а расширение, закреплённое к ядру, определяет область для каждой клетки для извлечения измерений, связанных с лизосомами, из канала LysoTracker. Репрезентативные измерения на клетку включают площадь лизосом, среднюю интенсивность LysoTracker и количество лизосом. Окрашивание SA-β-Gal может использоваться в качестве дополнительной валидационной метки при генерации или подтверждении эталонных наборов данных. (C) Количественная оценка и результаты. Индивидуальные лизосомные измерения объединяются в единую оценку старения на клетку или вероятность с помощью простого подхода к оценке. Выходные данные включают значения на клетки и сводки по уровням или состоянию нагрузки старения, которые можно сравнивать между условиями индуционирования старения или сенолитической обработки. Создано вместе с BioRender.com
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Протокол

Клетки IMR-90 являются устоявшейся линейкой фибробластов человека и не являются исследовательской деятельностью на людях. Этическое одобрение или информированное согласие не требовалось. Все процедуры проводились в соответствии с рекомендациями по биобезопасности Университета в Олбани, Государственном университете Нью-Йорка, при работе с клеточными линиями, полученными от человека, в условиях уровня биобезопасности 2 (BSL-2).

1. Общая подготовка и обзор рабочих процессов

1. Определите экспериментальную цель как анализ профилирования лизосомного профилирования живых клеток с использованием окрашивания LysoTracker Deep Red и живого ядерного красителя для количественной оценки лизосомного ремоделирования как непрерывного измерения старения в клетках IMR-90. Определим первичное биологическое сравнение как одну из следующих конструкций:
   1. Индукция старения против согласованного неиндуцированного контроля.
   2. Состояния старения с высоким уровнем и низким уровнем старения по дозе или временному ряду.
   3. Состояние с высоким уровнем старения, лечимое сенолитиком против Обработанная автомобильной старением — высокий контроль.
   4. Серии обработки сенолитиками включают как группу с низким уровнем старения, так и группу с высоким уровнем старения.
2. Установить минимальную структуру контроля для всех экспериментов.
   1. Включите контрольную группу с низким уровнем старения, соответствующую плотности покрытия, времени окрашивания и настройкам визуализации.
   2. Включайте группу с высоким уровнем старения, порождённую определённым триггером старения или поздним репликационным старением.
   3. Включайте биологические реплики по каждому состоянию и проводите окрашивание и визуализацию с одинаковым временем в разных условиях.
3. Определите анализные показания как прямые изображения измерения лизосомного ремоделирования:
   1. Измеряйте среднюю интенсивность LysoTracker на ячейку внутри лизоположительной маски, используя стабильный порог интенсивности в качестве основного показания анализа. На уровне одной клетки эта метрика отделяет условия старения с низким уровнем от условий с высоким уровнем старения с наибольшим размером эффекта и нечувствительна к плотности ядра на уровне поля (дополнительный рисунок 1).
   2. Записывайте следующие данные как вторичные показания, которые документируют расширение компартмента, но более чувствительны к выбору сегментации или плотности ядра на уровне поля: площадь с лизосомой на ячейку и интегрированная интенсивность LysoTracker на ядро на уровне поля. Интегрированная интенсивность на ядро информативна в хорошо населённых полях, но становится нестабильной, когда поле содержит небольшое количество ядер, поскольку нормализация на ядро становится доминирующей отдельными клетками.
   3. Записывайте опциональные метрики количества пунктов и размера лизосом, когда разрешение изображения поддерживает различение пункта.
4. Используйте окрашивание, ассоциированное со старением β-галактозидазой (SA-β-Gal), как необязательный этап валидации, выполняемый на параллельных скважинах или сопоставленных образцах, в зависимости от экспериментальных ограничений. Используйте это подтверждение, чтобы подтвердить, что посева с поздним переходом демонстрируют повышенную позитивность к SA-β-Gal по сравнению с ранними переходными культурами.
5. Стандартизируйте анализ между условиями, фиксируя следующие переменные перед сбором данных:
   1. Рабочая концентрация LysoTracker (75 нм) и продолжительность окрашивания (30 мин).
   2. Идентичность ядерного красителя и рабочий диапазон концентрации (например, Hoechst 33342 при 1 мкг/мл до 2 мкг/мл).
   3. Параметры изображения, включая увеличение объектива, время экспозиции, интенсивность освещения, биннинг и стратегию фокусировки.
   4. Формат тарелки и конфигурация изображения (тарелки с прозрачным дном или чаши с стеклянным дном), включая повторение расположения скважин.
   5. Пороговый выбор и нормализация интенсивности.
      1. Примените единый фиксированный порог интенсивности к каналу LysoTracker во всех скважинах эксперимента, чтобы определить лизоположительную маску.
      2. Выберите порог один раз во время установки теста с помощью калибровочного набора полей, охватывающих ожидаемый диапазон интенсивности (например, два поля с низким уровнем старения и два поля с высоким уровнем старения), и удержите его постоянным на всех скважинах в этой сессии; Разрешение вариации порога для каждой скважины вводит круговую зависимость между измерением и результатом.
      3. Для сравнения кросс-экспериментов получите все условия за одну сессию при одинаковых настройках мощности лазера, экспозиции и усиления и указывайте эти параметры в легенде рисунка.
      4. Если требуется сравнение абсолютной интенсивности между сессиями, включите люминесцентный эталонный стандарт (например, эталонную пластину с шариками или фиксированную опорную яму) и соответственно нормализуйте измеренные интенсивности.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не сравнивайте значения интенсивности по сессиям без одинаковых настроек получения или нормализации на основе референсов.
   6. Нормализация ядерной плотности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку стареющие культуры обычно демонстрируют сниженную пролиферацию и меньшую ядерную плотность при сопоставимом времени посева7,10, метрики на уровне поля, основанные на абсолютном количестве пикселей (например, общая лизоположительная площадь), могут зависеть от количества ячеек на поле.
      1. Сообщать как натуральные, так и нормированные значения на ядро (исходное значение, делённое на количество сегментированных по Хёхста ядер).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация на ядро контролирует замешательства, связанные с плотностью, и является подходящим сравнением для интерпретации на клетку. Для показаний по площади нормализованное значение служит основной метрикой, а ненормированное общее число сохраняется для полноты.
6. Создавайте изображения в условиях, которые сохраняют качество живого сигнала и минимизируют техническую вариабельность. Храните ранние и поздние проходящие пластины от света при окрашивании и транспортировке, а также минимизируйте время вне контролируемых культурных условий во время визуализации.
7. Сохраняйте флуоресцентные изображения как одноплоские, одноканальные, безпотерянные TIFF-файлы. Используйте последовательную схему именования, которая сохраняет сочетание между ядерными и LysoTracker изображениями и сохраняет прослеживаемость к пластинам, скважине, кондиционированию и репликации. Используйте общее базовое имя с суффиксами каналов (например, _Hoechst.tif и _Lyso.tif). Сохраняйте изображения в отдельной папке, организованной по экспериментам, с подпапками по мере необходимости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Практический момент паузы — после установления ранних и поздних когорт и подтверждения того, что культуры позднего прохода демонстрируют замедленный рост и морфологию, похожую на старение.
8. (По желанию) Включать кислород в качестве экспериментальной переменной путём поддержания согласованных когорт IMR-90 в условиях окружающей среды и низкого содержания кислорода. Обрабатывайте все группы одинаково.

2. Культивирование клеток и индукция репликативного старения

1. Разморозить фибробласты лёгких IMR-90 согласно стандартным практикам культивирования клеток и расширить клетки в минимально необходимой среде (MEM), дополненной сывороткой из 10% плода бычьего скота. Добавьте пенициллин-стрептомицин в дозе 1%, если это соответствует лабораторной практике и дизайну экспериментов. Поддерживайте клетки при 37 °C при 5% CO₂.
2. Поддерживайте культуры в логарифмическом росте и проходе до слияния от 70% до 80%. Используйте последовательные графики обработки и подачи материалов для снижения вариативности между экспериментальными сериями. Заменяйте полную культурную среду каждые 2–3 дня между отрывками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте среде оставаться неизменным дольше 72 часов, так как истощение питательных веществ и накопление секретируемых факторов могут способствовать стресс-индуцированному фенотипам, которые мешают репликационному старению.
3. Определите группу старения с низким базовым уровнем как активно размножающиеся культуры IMR-90, поддерживаемые при условиях, сохраняющих нормальное поведение роста. Сопоставьте плотность и обработку пластины со всеми экспериментальными группами.
4. Сгенерировать группу с высоким уровнем старения с помощью одного из следующих подходов, выбранных на основе экспериментальных целей.
   1. Индуцировать репликативное старение путём серийного пассажа с отслеживанием удвоения популяции до тех пор, пока не появятся замедления пролиферации и морфология, ассоциированная с старением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень удвоения популяции (PDL) и количество проходов — это отдельные показатели, которые отслеживаются отдельно. PDL относится к накопленным удвоениям после оттаивания и рассчитывается в каждом отрывке как:
      PDL_i = PDL_i-1 + log₂ (клетки собраны / засеяны)¹⁸,
      в то время как номер прохода учитывает количество субкультур с момента оттепели. Поскольку культуры обычно делятся 1:4 при примерно 70%–80% слиянии, каждый пассаж вносит примерно два удвоения популяции, поэтому количество пассажа и накопленный PDL не взаимозаменяемы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Культуры с высоким уровнем старения обычно наблюдаются на продвинутых уровнях удвоения популяции, когда пролиферация замедляется и становится очевидной морфологией, связанной с старением. Точные пороги следует определять эмпирически для каждого партии IMR-90, так как PDL различаются у разных поставщиков.
   2. Старение, вызванное стрессом, путём применения определённого триггера старения и обеспечения соответствующего фенотипического окна развития.
   3. Старение, вызванное лечением, путём подвержения клетки воздействию исследуемого состояния, когда цель — проверить, вызывает ли это старение.
5. Подтвердить, что выбранный подход приводит к фенотипу с высоким уровнем старения, используя как минимум одно ортогональное измерение, выполненное на параллельных скважинах. Проведите окрашивание SA-β-Gal как необязательный метод валидации и задокументируйте долю положительных клеток по каждому состоянию при включении.
   1. Культура считается с высокой старением, если как минимум 50% клеток демонстрируют однозначное синее перинуклеарное окрашивание SA-β-Gal после 12–16 часов инкубации при pH 6.0, тогда как соответствующий контроль с низким уровнем старения показывает не более 10% положительных клеток при идентичных условиях^{окрашивания 13}.
   2. Значения за пределами этих границ указывают на неполную индукцию старения или повышенный фон и требуют повторной оптимизации перед переходом к визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пауза после установления когорт с низким уровнем старения и высокого возраста и подтверждения явного фенотипического различия по морфологии и необязательному валидационному окрашиванию.
6. Опционально: Конструкция сенолитичной обработки
   1. Условия старения пластин — низкое и высокое старение в репликационных колодцах, позволяющие клеткам прилипать и восстанавливаться до лечения.
   2. Обрабатывайте скважины с высоким уровнем старения сенолитическими соединениями и включайте транспортный контроль с высоким уровнем старения.
   3. Включать группу с низким уровнем старения, обработанную тем же носителем и, при необходимости, той же концентрации соединений для мониторинга чувствительности к нестареющему организму.
   4. Переходите к LysoTracker и ядерному окрашиванию в постоянное время после обработки при любых условиях.
7. Следите за культурами в позднем переходе или в процессе лечения, а также документируйте морфологию и модели роста. Идентифицировать стареющие культуры по замедленной пролиферации, увеличенной и уплощенной морфологии, а также увеличению цитоплазматической гранулярности. Когда наблюдается остановка роста, поддерживайте культуру как когорту с высоким старением для окрашивания и визуализации, а не дальше.
8. Минимизируйте мешающие стрессоры во время поддержания культуры, используя регулярную подготовку среды, регулярные графики кормления и длительное обращение вне инкубатора. Рассматривайте колебания температуры, длительное время вне контролируемого CO₂ и непоследовательное нагревание среды как источники избежаемых технических изменений.
9. Опционально: Поддерживайте согласованные культуры под окружающим кислородом и низким содержанием кислорода. Поддерживайте культуры ниже 21% O₂ и ниже 5% O₂ как отдельные когорты и поддерживайте каждую когорту в назначенном условии кислорода во время рутинной обработки культуры, когда это возможно. Ограничить воздействие окружающего кислорода во время переносов и подготовки к визуализации для когорт с низким содержанием кислорода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Практический момент паузы — после определения и стабилизации ранних и поздних когорт и подтверждения того, что культуры позднего прохода демонстрируют устойчивое замедление роста и морфологию, связанную с старением.

3. Лизосомное и ядерное окрашивание живыми клетками с помощью LysoTracker Deep Red и ядерного красителя

1. Ячейки с пластинами IMR-90 для всех экспериментальных условий в пластинах с прозрачным дном или стеклянных антеннах. Включить условие контроля с низким уровнем старения и хотя бы одно состояние с высоким уровнем старения, возникающее выбранным триггером, а также включить биологические реплики для каждого состояния.
2. Семенные клетки, чтобы получить субконфлюентный монослой в день окрашивания. Запишите плотность посева и время между нанесением и окрашиванием для каждого эксперимента, чтобы подтвердить сопоставимость между посевами.
3. Прогрейте полную культуру до 37 °C. Приготовьте рабочее раствор LysoTracker Deep Red при температуре 75 нМ в подогретой среде и защитите его от света. Рабочий раствор готовится путём разбавления 1 мМ запаса LysoTracker Deep Red (поставляемого производителем в DMSO) 1:13 333 в подогретой полной культурной среде (например, 0,75 мкл 1 мл запаса на 10 мл нагретой среды).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поздние переходные и вызванные стрессом стареющие клетки накапливают липофусцин и другой неспецифический аутофлуоресцентный материал, который излучается в широких диапазонах длин волн и может способствовать явному сигналу LysoTracker в неокрашенных^{контролях 14}. Чтобы оценить вклад автофлуоресценции в данный эксперимент, включите хотя бы одну неокрашенную скважину в каждом случае и получите её при одинаковых условиях визуализации. Вычтите средний сигнал неокрашенной скважины из измерений окрашенной скважины или покажете как исходные, так и фоновые значения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На практике неокрашенный сигнал канала LysoTracker в культурах IMR-90 невелик по сравнению с окрашенным стареющим сигналом (примерно от 5% до 10% от среднего окрашенного стареющего сигнала в данном наборе данных), но вклад увеличивается с количеством проходов и может быть значительным (более 20%) в глубоко стареющих или онкоген-индуцированных стареющих^{культурах 6,14}. Всегда проверяйте величину автофлуоресценции при внедрении этого протокола для нового типа клеток или модели старения-индуции.
4. Подготовьте достаточное рабочее решение LysoTracker для всех скважин, которые будут окрашиваться в процессе работы. Смешайте рабочий раствор мягким инверсией и защищайте его от света до использования.
5. Аспирируйте расходуемое среднее количество из каждой скважины. Аккуратно нанесите рабочее раствор LysoTracker вдоль стенки скважины, чтобы не нарушать монослой и поддерживать равномерный объём окрашивания в колодцах.
6. Инкубировать клетки с помощью LysoTracker в течение 30 минут при 37 °C при 5% CO₂. Поддерживайте все экспериментальные группы при одинаковой продолжительности и температуре инкубации.
7. Добавьте живой ядерный краситель в последние 10 минут инкубации LysoTracker. Добавьте Hoechst 33342 непосредственно в среду, содержащую LysoTracker, в рекомендованной производителем рабочей концентрации, например, от 1 мкг/мл до 2 мкг/мл, и перемешайте путём аккуратного покачивания пластины.
8. Удалите окрашивающую среду в конце инкубации. Прополосните клетки один раз предварительно нагретым фосфат-буферным физиологическим раствором, чтобы уменьшить фоновый флуоресцентный раствор.
9. Сразу после промывания добавьте предварительно подогретый фермент без фенола или буфер для визуализации. Переходите непосредственно к живой съёмке и поддерживайте единое время между обменом буфером и получением изображений во всех скважинах эксперимента.
10. Защитите пластины от света во время переноса и установки изображения. Минимизировать время, проведённое вне контролируемой температуры и CO₂ при обработке и получении изображений.
    ВНИМАНИЕ: Используйте флуоресцентные красители с помощью перчаток и защиты глаз. Утилизировать жидкости, содержащие красители, и загрязнённые расходные материалы в соответствии с институциональными процедурами химической безопасности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте точку паузы после шага 3.9 , если для визуализации требуется этапирование нескольких пластин. Держите пластины защищёнными от света при 37 °C и возобновляйте обследование как можно скорее, чтобы ограничить смещение пятен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если в экспериментальной конструкции используется кислород как переменная, поддерживайте каждую когорту в заданном кислородном состоянии во время окрашивания и инкубации и фиксируйте время обработки вне назначенного условия.

4. Окрашивание SA-β-Gal для валидации (по желанию)

1. Используйте окрашивание SA-β-Gal как дополнительный этап валидации, чтобы подтвердить, что состояние с высоким старением демонстрирует повышенную активность SA-β-Gal по сравнению с контролем с низким уровнем старения. Проведите валидацию на параллельных скважинах, обработанных в том же формате пластин и в той же графике обработки, что и сважины для изображения.
2. Завершите живую визуализацию для валидационных колодцев перед фиксацией. При сопоставлении необходимы сравнения одного и того же поля до и после фиксации (рисунок 2), записывайте координаты ступеней при получении, вручную переместите каждое поле после фиксации и окрашивания, а также визуально проверяйте точковое положение ядра и морфологию клеток, чтобы убедиться, что совпадающие поля соответствуют перед включением их в дальнейший анализ.
3. Фиксируйте клетки с помощью фиксационного раствора, входящего в набор для окрашивания SA-β-Gal, подготовленного в рекомендованной рабочей концентрации 1x, содержащей 2% формальдегида и 0,2% глутаральдегида. Инкубировать 10–15 минут при комнатной температуре. Для справки: фиксационный раствор содержит 2% (w/v) формальдегида и 0,2% (w/v) глутаральдегида в фосфатно-буферном физиологическом растворе. Раствор окрашивания SA-β-Gal при pH 6,0 содержит 1 мг/мл X-гал (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-D-галактопиранозид), растворённый в диметилформамиде непосредственно перед использованием, буфер лимонной кислоты/фосфата натрия с концентрацией 40 мМ при pH 6,0, 5 мМ ферроцианида калия, 5 мМ феррицанида калия, 150 мМ NaCl и 2 мМ MgCl^₂12,13. Коммерческие наборы, соответствующие этим спецификациям, могут использоваться взаимозаменяемо, при условии, что pH буфера окрашивания подтвержден на уровне 6.0.
4. Снимите фиксирующее средство и дважды промывайте колодцы физиологическим раствором, содержащим фосфат. Добавьте раствор для окрашивания SA-β-Gal при pH 6.0, содержащий субстрат X-gal, в каждую скважину.
5. Запечатайте пластину, чтобы ограничить испарение во время инкубации. Поставьте пластину в инкубатор с температурой 37 °C без CO₂ на 12-16 часов.
6. Осмотрите скважины с помощью микроскопии Brightfield и задокументируйте узор окрашивания. Получите репрезентативные изображения для каждого состояния и сообщайте о доли SA-β-Gal-положительных клеток на одну скважину при проверке результатов.
   ВНИМАНИЕ: Формальдегид и глутаральдегид токсичны и летучие. Подготовьте и используйте фиксационный раствор в вытяжке с химическим паром, а также наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, защиту для глаз и лабораторный халат.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если окрашивание SA-β-Gal показывает высокий фон в старении — низкий контроль или слабое окрашивание при состоянии старения, повторная валидация после корректировки плотности покрытия, длительности фиксации, продолжительности инкубации и температурной стабильности при сохранении pH буфера на уровне 6,0.

Результаты

Применение этого протокола к фибробластам IMR-90 в условиях с низким уровнем старения и с высоким уровнем старения даёт количественные лизосомные показатели, которые можно суммировать на уровне одной клетки и, при необходимости, на уровне всего поля.

Репрезентативный набор данных, показанный на рисунках и таблицах, основан на одном биологическом эксперименте, сравнивающем культуры IMR-90 на проходе 13 (P13; минимальная старение, ~PDL 26) и пассаже 23 (P23; выс...

Обсуждение

Этот протокол описывает рабочий процесс изображения живых клеток, который измеряет старение с помощью лизосомного ремоделирования и даёт количественные данные нагрузки старения на клетку и на каждую скважину. Несколько шагов особенно важны для получения надёжного анализа. Во-первых, сама биологическая модель должна быть хорошо контролируема. Индукция репликативного старения в фибробластах IMR-90 требует тщательного отслеживания удвоения популяций и параллельного поддержания ранних проход...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
24-лунковый планшет для культивирования тканей (плоское дно, обработка ТК)	CellTreat Scientific Products	229124	Любой прозрачный многоячеечный планшет для культивирования, совместимый с изображением флуоресценции живых клеток (например, 6-, 12- или 24-лунковые полистирольные планшеты с обработкой ТК; для высокоразрешающей съемки могут предпочтительны стеклянно-днищевые планшеты).
Комплект для окрашивания бета-галактозидазой (анализ старения)	Cell Signaling Technology	9860	Любой коммерческий комплект SA-β-галактозидазой с проверенным буфером окрашивания при pH 6,0. Для справки, раствор для фиксации содержит 2% формальдегид и 0,2% глутаральдегид в PBS, а раствор для окрашивания содержит 1 мг/мл X-гал в DMF, 40 мМ цитрат/фосфат pH 6,0, 5 мМ калия ферроцианид, 5 мМ калия феррицианид, 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2.
BioRender (программное обеспечение для научной иллюстрации)	BioRender	N/A — веб-приложение	Используется для создания схематических фигур (рисунки 1–3). https://www.biorender.com
Газ углекислый (CO2), сжатый в баллоне	Airgas (или аналогичный поставщик)	N/A	Медицинский углекислый газ используется для поддержания 5% атмосферы в инкубаторе для культивирования клеток и в камере для съемки на сцене.
Теплоинактивированная фетальная сыворотка быка (FBS)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10082147	Любая сыворотка быка для культивирования клеток, теплоинактивированная при 56 °C; используется на 10% объема в полной среде культивирования.
Флуоресцентный микроскоп с возможностью работы с живыми клетками	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	Любой широкополосный или конфокальный флуоресцентный микроскоп с контролем температуры и CO2 для живых клеток, наборами фильтров для дально-красных (возбуждение ~647 нм / испускание ~670 нм) и DAPI/Hoechst (возбуждение ~405 нм / испускание ~460 нм) каналов и объективом 20×-40× с достаточной числовой апертурой для разрешения лизосомальных структур. В данном исследовании использовалась система изображений EVOS M7000.
Ядерная окраска Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570	Клеточная проницаемая ДНК-окраска для окрашивания ядра живых клеток (синяя флуоресценция, возбуждение ~405 нм). Не является заменителем DAPI, который не является проникающим в клетку при физиологических условиях.
Программное обеспечение для анализа изображений	Python Software Foundation	N/A	Любая среда научных вычислений, поддерживающая сегментацию ядер, расширение области ядра к клетке, порог интенсивности и базовую статистику изображений (например, Python с scikit-image, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). Для этого исследования разработана программа SenTrack (см. Дополнительный файл S1).
ИМР-90 человеческие фибробласты легких (клеточная линия)	ATCC	CCL-186	Нормальная диплоидная фибробластическая клеточная линия человеческой легочной плода, используемая для моделирования репликативного старения; может быть заменена любой аналогичной характеризованной человеческой фибробластной линией.
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	L12492	Ацидотропный флуоресцентный краситель для окрашивания живых клеток кислых органелл; поставляется в виде 1 мМ концентрации в DMSO. Рабочая концентрация составляет 75нМ в готовой среде для культивирования клеток.  Дально-красное испускание (возбуждение 647 нм / испускание 668 нм) минимизирует перекрытие с аутофлуоресценцией липофуксина, но не исключает его.
Минимальная необходимая среда (MEM)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	11-095-080	Базальная среда для культивирования фибробластов ИМР-90; дополнена 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин. Может быть заменена любой стандартной формулировкой Eagle's минимальной необходимой среды с солями Эрла и L-глутамин.
Решение пенициллина-стрептомицина (100×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140122	Антибиотическая добавка для полной среды культивирования; используется на 1% объема (конечная концентрация 100 U/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицин). Может быть заменена любым стандартным решением пен-стреп.
Среда для изображений без фенолфталеина	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	A1896701	Среда DMEM или HBSS без фенолфталеина, используемая для изображений живых клеток для уменьшения фона флуоресценции при получении изображений. FluoroBrite DMEM является одним из часто используемых вариантов; может быть заменена любой безфено