Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка оксигенации и сосудистой перфузии в доклинических моделях рака и заживления ран с использованием OS-DCE OAI

276 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70689

⸱

7 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Physics, University of Wisconsin, 2University of Texas MD Anderson Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол проведения кислородно-чувствительной оптоакустической визуализации с улучшенным контрастом (OS-DCE OAI) для оценки доклинических моделей рака и заживления ран. OS OAI может визуализировать окси- и дезоксигемоглобин, картируя оксигенацию тканей. DCE-OAI может визуализировать фармакокинетику экзогенного контрастного агента, тем самым картируя сосудистую перфузию.

Аннотация

Кислородочувствительная оптоакустическая визуализация (OS OAI) и динамически контрастно-усиленная оптоакустическая визуализация (DCE OAI) обеспечивают дополняющие, неинвазивные данные физиологии тканей. OS OAI использует мультиспектральное обнаружение эндогенного оксигемоглобина и дезоксигемоглобина для создания карт насыщения крови кислородом (%sO₂), в то время как DCE OAI отслеживает in vivo фармакокинетику ближнего инфракрасного абсорбера для количественной оценки сосудистой перфузии и проницаемости. Цель этого протокола — представить единый рабочий процесс OS-DCE OAI, позволяющий одновременно оценивать оксигенацию и перфузию в двух широко используемых доклинических условиях: ортотопных опухолях рака молочной железы и кожных ранах полной толщины.

В этом протоколе мы продемонстрировали OAI мышиных моделей рака груди или раны от разрыва. Для OS OAI многосрезовые мультиспектральные сканирования получаются на 700–875 нм, что позволяет спектральное разведение и оценку %sO₂. Для DCE OAI повторные заборы с временным разрешением ≤5-с проводятся до и после внутривенного болюсного введения индоцианина зелёного (ICG), используя либо мультиспектральное отбор с частотой 700-875 нм, либо отбор с одной длиной волны на 800 нм для создания кривых амплитуды сигнала во времени и OA. Подробно описаны разработка животных моделей, подготовка к OA-визуализации, приобретение OS OAI и DCE OAI, а также анализ характеристик оксигенации и сосудистой перфузии, а также ключевые рекомендации по устранению неисправностей артефактов движения, поверхностных поглотителей и неудачных инъекций.

В совокупности этот протокол OS-DCE OAI даёт интегрированный функциональный портрет гипоксии и сосудистого транспорта, который позволяет выявлять физиологические изменения опухолей и ран раньше проведения грубых анатомических измерений. OS-DCE OAI легко адаптируется к другим моделям заболеваний.

Введение

Оптоакустическая визуализация (ОИ), также известная как фотоакустическая визуализация или мультиспектральная оптоакустическая томография, — это относительно новый метод, сочетающий оптическое возбуждение с ультразвуковым обнаружением (УЗИ) для обеспечения глубокотканевой визуализации 1,2. В ОАИ короткие наносекундные лазерные импульсы возбуждают эндогенные хромофори, такие как окси- и дезоксигемоглобин, создавая локализованное термоупругое расширение и широкополосные акустические волны, которые обнаруживаются американскими преобразователями. Эти сигналы позволяют OAI получать изображения с оптическим контрастом при пространственном разрешении, подобном ультразвуку, при этом достигая сантиметровой глубины обзора in vivo. Когда данные собираются на нескольких длинах волн и анализируются с помощью спектрального смешивания, кислородочувствительный (OS) OAI может оценить относительные концентрации окси- и дезоксигемоглобина и таким образом сделать выводы насыщения тканей кислородом (%sO₂)2. Насыщение кислородом крови обеспечивает функциональную оценку микрососудистой физиологии, к которой трудно получить неинвазивный доступ другими методами.

Сосудистая перфузия также полезна для оценки физиологии микрососудистой системы. Сосудистая перфузия представляет собой сочетание сосудистого потока, проницаемости и площади поверхностисосудов 3. Для количественной оценки перфузии OAI можно использовать с экзогенным контрастным агентом для выполнения Dynamic Contrast Enhanced OAI (DCE OAI). В этом подходе временная визуализация до, во время и после введения контрастного агента контролирует фармакокинетику (PK) препарата. Эти результаты можно моделировать для измерения скорости промывания (NK trans) от плазменного компартмента крови к опухолевому внесосудистому компартменту и скорости промывания (kep) от опухолевой внесосудистого компартмента к плазменному компартменту. Мы разработали метод моделирования PK, который избегает печально известной проблемы флуэнса света (то есть рассеяния и поглощения в тканях, вызывающих переменную энергию излучения через ткань)4. Наш метод нормализует изменение динамического сигнала OAI-сигнала с 0% (до впрыскивания) до 100% (максимальное усиление), а затем использует дифференциальные уравнения для оценки скорости транс-вмывания NK и k ep. Другие исследования DCE OAI использовали стандартные методы PK-моделирования, которые страдают от основного предположения, что флюенс света равномерен по всейткани 5,6.

Результаты DCE OAI также могут использоваться для оценки скорости промывания сигнала путём проведения эмпирических измерений максимального усиления сигнала (MSE), времени до пика (TTP) для достижения MSE, наклона (обычно для введения в TTP) и начальной площади под кривой (IAUC; обычно для инъекции в TTP после инъекции)7. Следует отметить, что если TTP происходит позже в кривой PK, наклон или IAUC можно взять на линейной части кривой или с момента введения до 1 минуты после инъекции. Мы показали, что эмпирические измерения могут быть полезны при оценке лечения, применяемого к моделям опухолей, или при оценке заживленияран 8,9. Другие исследования также показали ценность использования эмпирических измерений для оценки сосудистой проницаемости опухолей и фиброзапечени 10,11. Форма кривой PK также может использоваться для качественной классификации сосудистой перфузии опухоли как высокая илинизкая 12,13,14.

Кроме того, сигнал OAI в одну точку времени после инъекции может использоваться как эмпирическая оценка перфузии, известная как нединамический контрастный усиленный OAI (CE OAI)15. Изображение CE OA, показывающее яркую опухоль или рану, является простым и очень визуальным, но часто используется только для качественной оценки высокой и низкой перфузии. В целом, динамические изменения сигналов ОАИ после ТТП не анализируются для эмпирической оценки сосудистой перфузии при опухоли. Однако, как показано ниже, скорость промывания в ранах чрезвычайно высокая, поэтому измерениеNK trans, TTP, наклона и IAUC сложно измерить. Поэтому мы использовали линейный или экспоненциальный наклон фазы промыва как эмпирическую меру сосудистой перфузии вранах 9.

Большинство агентов OAI поглощают в ближнем инфракрасном диапазоне длин волн (NIR), которые могут проникать глубже вткани 16,17. Однако поглощение воды на длинах волн более 900 нм ограничивает полезный диапазон длин волн OAI in vivo до 700–900 нм для большинстваслучаев 2. Индокианин зелёный (ICG) является прототипическим агентом DCE OAI, поскольку обеспечивает сильное поглощение NIR на 780–800 нм, обеспечивает умеренно сильный сигнал OAI и благоприятно биосовместимость с одобрением FDA для клинического использования. Эти особенности обеспечивают внутрисосудистый контраст и интерпретируемые PK кривые.

Мы разработали комбинированный протокол OS-DCE OAI для оценки оксигенации и сосудистой перфузии в доклинических моделях солидных опухолейи ран 8,9. Операционная часть этого протокола может оценивать оксигенацию в нескольких срезах визуализации, которые могут покрыть целый объем опухоли и раны в моделях мышей. В части нашего протокола, посвящённого DCE, есть возможность снимать один срез опухоли или раны с помощью нескольких длин волн лазера (что повышает точность обнаружения контрастных агентов) или снимок до 5 срезов с одной длиной волны лазера (что улучшает пространственное покрытие). Мы использовали OS-DCE OAI для мониторинга изменения оксигенации и сосудистой перфузии после лечения опухолевой модели с помощью лучевой терапии или комбретастатина A4 фосфата, сосудистого разрушителя 4,8. Мы также использовали OS-DCE OAI для мониторинга заживленияран 9. DCE OAI даёт OAI возможность отслеживать прогрессирование с помощью сосудистой перфузии, которая может применяться при различных заболеваниях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Проводите все процедуры с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) вашего учреждения. Все процедуры, указанные в протоколе ниже, были одобрены IACUC нашего учреждения.

1. Анестезия (для последующих процедур)

  1. Индуцировать анестезию. Сначала индуцировать и поддерживать анестезию с помощью 5% изофлурана в 100% газе-носителе кислорода, пока мышь не проснётся.
  2. Поддерживайте анестезию. Продолжайте анестезировать мышь с помощью 1,5–2% изофлурана в 100% газе-носителе кислорода. Проверьте отсутствие педального рефлекса.
  3. Поддерживайте нормотермию. Обязательно держите животных на тёплой поверхности и контролируйте температуру на протяжении всего периода анестезии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (Точка паузы) Переходите к имплантации опухоли или образованию раны после полной анестезии.

2. Подготовка модели

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся работа с клетками должна проводиться в шкафу для биобезопасности, чтобы избежать воздействия и возможного загрязнения.

  1. Установите ортотопическую модель опухоли 4T1 (рисунок 1).
    1. Подготовьте клетки на льду: ресуспензировать клетки 4T1 в ледяной PBS при концентрации 2 × 107 клеток/мл.
    2. Смешивание клеток с матрицей: объединяйте суспензию клетки 1:1 (v/v) с ледяным биологическим гидрогелем с богатым внеклеточным матриксом. Комбинация должна дать раствор клеток при 1 × 107 клеток/мл.
    3. Загрузить шприц: Загрузить смесь клеток в стерильный лабораторный шприц с объёмом не более 1,0 мл. Ограничить объём до 100 мкл на инъекцию (1 × 106 элементов). В качестве варианта аккуратно нагрейте шприц до 30 °C, что делает биологический гидрогель слегка вязким и более фокально удерживающимся в месте инъекции.
      ВНИМАНИЕ: Обращайте внимание на острые шприцы и избегайте их повторения.
    4. Обезболить мышь, как описано в разделе 1.
    5. Удалите шерсть, если есть: Депилируйте область подушечки груди. Опустите этот шаг, если используете атимических обнажённых мышей.
    6. Поставьте иглу и укол: простерилизуйте 4-ю паховую жировую подушечку молочной защиты. Введите иглю и медленно вводите 100 мкл в жировую подушечку, чтобы избежать рефлюкса.
    7. Выведите животное после наркоза: верните мышь в тёплую клетку и наблюдайте за ней до передвижения.
    8. Дайте опухоли рост: Дайте опухолям 4T1 минимальный диаметр 0,3 см в течение 8–10 дней до проведения визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно сфотографировать опухоли с большим диаметром. Диаметр опухоли можно измерить с помощью калиброванного верньерного суппорта. Опухоли, превышающие максимальный диаметр, одобренный IACUC (или аналогичным институциональным комитетом), должны быть эвтаназианы. Следуйте ортотопной инъекции и адаптируйте количество и объём клеток к желаемому протоколу пришивки.
  2. Образование эксцизионной раны у мыши (Рисунок 2)
    1. Подготовьте хирургическое поле: простерилизуйте рабочую зону и инструменты.
    2. Обезболить мышь, как описано в разделе 1.
    3. Удалите шерсть, если есть: депилируйте спинную область. Опустите этот шаг, если используете атимических обнажённых мышей.
    4. Введите обезболивание: закрепите мышь на стерильной хирургической поверхности. Вводите бупренорфин 0,05–0,1 мг/кг подкожно (SC) в дорсальную область.
    5. Дезинфицируйте область раны: продезинфицируйте спинную кожу повидон-йодом, затем 70% этанола.
    6. Создайте эксцизионную рану: используйте биопсийный пунш диаметром 6 мм, чтобы обвести участок. Удалите кожу и panniculus carnosus, чтобы получить дефект полной толщины.
    7. Установите силиконовую шину:
      1. Центрируйте силиконовую шину в форме пончика вокруг раны. Убедитесь, что внутренний диаметр щели на 2–4 мм больше диаметра раны, а ширина шины — ~5 мм.
      2. Вырежьте силиконовую шину в форме пончика из листа силиконового материала. Используйте прозрачный материал для шва, чтобы пришить шину. Если нужно, используйте тонкую клейкую пленку, чтобы закрепить кольцо.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пигментированные материалы для шва могут поглощать NIR-свет, поэтому их не следует использовать.
    8. Зашивайте шину: Наложите восемь равномерно расположенных прерванных швов, чтобы закрепить шину на окружающей коже без удушения.
    9. Наложите окклюзионную повязку: закройте рану и шину окклюзионной повязкой, чтобы защитить кровать и стандартизировать окружение раны.
    10. Выведите животное после наркоза: верните мышь в тёплую клетку и наблюдайте за ней до передвижения.
    11. Дайте животному заживать: продолжайте ежедневный уход и обследования в зависимости от дизайна исследования или до полного заживления раны.
    12. Заменяйте повязку каждый день: Меняйте окклюзивную повязку ежедневно после съёмки или фотографии, чтобы минимизировать загрязнение и поддерживать стерильность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (Критический шаг) Наложите шину на рану для подавления сокращения и стимулирования повторной эпителизации, что повышает трансляционную значимость для заживления человека. (Точка паузы) После нанесения повязки сделайте паузу до следующего назначенного обследования или сеанса визуализации.

3. Протоколы получения OAI OS-DCE

  1. Подготовьте мышь и контрастное вещество для OAI-сканирования.
    1. Приготовьте контрастное вещество.
      1. Приготовьте раствор 1,62 мМ контрастного вещества ICG в стерильной воде. Фильтруйте раствор с помощью шприцового фильтра 0,3 мкм. Наполните стерильный лабораторный шприц 100 мкЛ этого раствора.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эта доза составляет 162 нмоль или 125,5 мкг, исходя из молекулярной массы ICG 775 г/моль. Доза составляет 6,28 мг/кг массы тела мыши, учитывая, что масса мыши составляет примерно 20 г. Животная эквивалентная доза в 12,3 раза превышаетчеловеческую эквивалентную дозу 18. Таким образом, эквивалентная человеческая доза составляет 0,51 мг/кг массы тела. Максимальная допустимая доза для человека составляет 2 мг/кг 19. Таким образом, используемая доза в этом доклиническом исследовании составляет примерно 1/4 от максимально допустимой дозы у людей.
    2. Приготовьте сканер OAI.
      1. Наполните резервуар для съёмок деионизированной, дистиллированной водой. Установите температуру в аквариуме на 36 °C для мыши с весом тела <25 г.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Температура этого аквариума поддерживает температуру тела около 37 °C, потому что мышь завернута в пластиковый пакет в колыбели. Для более крупной мыши с весом тела >25 г температура в аквариуме должна быть установлена на уровне 35 °C, чтобы избежать перегрева, поскольку у крупной мыши больше подкожной жировой ткани, которая служит изоляционным слоем.
    3. Обезболить мышь, как описано в разделе 1. В течение оставшейся части протокола захвата убедитесь, что мышь остаётся под анестезией с содержанием 1,5–2% изофлурана в 100% газе-носителе кислорода.
    4. Если проводите DCE OAI, установите венозный доступ.
      1. Промывайте катетер на хвостовой вену весом 27 G гепаринизированным физиологическим раствором. Введите катетер в боковую хвостовую вену и закрепите катетер, чтобы предотвратить его отъезд из хвостовой вены (рисунок 3A). Убедитесь, что нет воздушных пузырьков.
        ПРИМЕЧАНИЕ: (Критический этап) Используйте гепаринизированный физиологический раствор для поддержания проходимости катетера.
      2. Кроме того, подготовьте стерильный лабораторный шприц с объёмом не более 500 мкл, который может подключиться к катетеру. Убедитесь, что в шприце 100 мкл 2,14 мМ ICG (~322 нмоль; ~16 мкмоль/кг для мыши весом 20 г).
    5. Накройте мышь и люльку гелем для ультразвукового устройства (рисунок 3B).
      1. Нанесите тонкий слой прозрачного ультразвукового геля на область опухоли или раны (рисунок 3C). Также нанесите ультразвуковой гель на колыбель, чтобы создать герметичность между колыбелью и областью опухоли или раны.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Устраните воздушные пузырьки. В качестве опции можно центрифугировать ультразвуковой гель для удаления воздуха перед использованием геля. Также используйте минимальное количество ультразвукового геля, чтобы избежать образования пузырьков в толстых слоях геля.
    6. Положите мышь в люльку (рисунок 3D): Обратитесь к инструкциям производителя к инструменту. Поместите мышь в держатель так, чтобы нос мыши был плотно внутри носового конуса. Используйте наручники, чтобы держать руки и ноги мыши. Используйте зубную петлю для стабилизации головки.
      1. (ПО ЖЕЛАНИЮ) Используйте колыбель с конусом для крысиного носа при съёмке мыши. Конус крысиного носа поднимает голову мыши с нижней части люльки, что может предотвратить случайное утопление, если небольшое количество воды попадёт в колыбель.
    7. Поместите мышь и люльку в инструмент OAI. Обратитесь к инструкциям производителя к инструменту.
      1. Обратите внимание на наличие протечек в люльке для мыши. Если есть протечки, вынимите мышь и люльку из прибора и заново запечатайте мышь в люльке, чтобы избежать случайных утоплений.
      2. Если нужен DCE OAI, подключите катетер к шприцу с помощью контрастного вещества.
    8. Уравновесьте мышь перед съёмкой: Дайте 10 минут стабилизации физиологии мыши в терморезервуаре с теплой водой перед получением изображения (рисунок 3E).
    9. Поместите мышь относительно OAI-преобразователя:
      1. Переместите мышь или трансдьюсер OAI согласно инструкциям производителя так, чтобы опухоль или рана находились в наборе мультислайсов.
      2. Оптимизируйте скорость звука для набора изображения. Выполните этот шаг, пока мышь находится в равновесии перед изображением (шаг 3.1.7).
      3. (Критический шаг) Поддерживайте единообразную ориентацию/положение срезов животных для всех мышей и в любой момент времени для обеспечения строгих результатов
  2. Задайте параметры OAI ОС.
    1. Выберите параметры среза изображения так, чтобы несколько срезов были сняты так, чтобы покрыть всю область опухоли или раны толщиной среза 1 мм.
    2. Выберите длины волн поглощения. Для OS OAI выберите длины волн поглощения 700, 730, 760, 800, 850 и 875 нм.
    3. Используйте усреднение сигнала: выберите параметры, чтобы получить 10 средних значений на длину волны перед получением следующей длины волны, а затем переходом к следующему срезу изображения. 10 средних значений на длину волны увеличивают соотношение сигнал/шум каждого среза изображения.
    4. Задайте количество повторений:
      1. Установите количество повторов, как показано в таблице 1 , чтобы поддерживать общее время обучения примерно 2 минуты. Для пользователей инструмента с частотой повторения 10 Гц общее время получения составляет 6,0 с на срез изображения.
      2. Перемещение мыши к следующему срезу изображения и возвращение в первую позицию среза требует в среднем 0,2 с, так что каждый срез занимает 6,2 с.
      3. Выполните минимум 3 повторения для обеспечения стабильности измерения. Общее время освоения более 2 минут допустимо, если требуется больше повторений.
  3. Получите OA-образы ОС.
  4. Задайте параметры OAI DCE.
    1. Установите параметры получения DCE OAI для протокола односрезной визуализации с несколькими длинами волн.
      1. Расположите срезы для изображения. Выберите ≤5 срезов для визуализации, расположенных по центру в области опухоли или раны, толщиной среза 1 мм.
      2. Выберите оптимальную длину волны поглощения для контрастного агента. Для индокианинового зелёного цвета в условиях in vivo установите длину волны на 800 нм.
      3. Установите количество средних и повторов, как показано в таблице 2. Эти рекомендации будут поддерживать временное разрешение ≤ 5 с и общее время приобретения 11,0–11,2 минуты для пользователей инструмента OAI, который имеет частоту повторения изображения 10 Гц.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи других инструментов с разной частотой повторения изображения должны скорректировать количество средних значений, чтобы поддерживать временное разрешение ≤ 5 секунд для каждого набора изображений.
    2. В качестве альтернативы шагу 3.4.1 установите параметры получения DCE OAI для протокола мультислайсовой визуализации с одной длиной волны.
      1. Расположите срезы для изображения. Выберите ≤ 5 срезов для визуализации, расположенных по центру опухоли или раны с толщиной среза 1 мм.
      2. Выберите оптимальную длину волны поглощения для контрастного агента. Для индокианинового зелёного цвета в условиях in vivo установите длину волны на 800 нм.
      3. Установите количество средних и повторов, как показано в таблице 2. Эти рекомендации будут поддерживать временное разрешение ≤ 5 с и общее время приобретения 11,0–11,2 минуты для пользователей инструмента OAI, который имеет частоту повторения изображения 10 Гц.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователям других инструментов с разной частотой повторения изображения следует корректировать количество средних показателей, чтобы поддерживать временное разрешение ≤ 5 с для каждого набора изображений.
  5. Получите изображения DCE OA.
    1. Записывайте исходные изображения: Начните сбор и соберите 12 наборов изображений (~1 минута).
    2. Введите контрастное вещество: введите 100 мкл через катетер, продолжая набирать вещество.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция болюса должна быть стабильной примерно 10–15 секунд, чтобы избежать накопления давления в катетере в хрупкой хвостовой вене. Эту консистенцию можно контролировать при постоянном давлении на поршень шприца во время ручной инъекции или с помощью автоматического инжектора. Важно отметить, что скорость инъекций в 10–15 секунд сгладит начальную доставку препарата к опухоли, а не вызывает первопроходных скачки кинетики в кривой PK, вызванных более быстрыми временами инъекций, что улучшает моделирование PK и анализ эмпирических измерений.
      1. (Критический шаг) Избегайте утечки контрастных веществ из кровеносных сосудов в окружающие ткани в месте инъекции, чтобы сохранить точное время нанесения болюса.
    3. Продолжить съёмку: Заберите оставшиеся 128 комплектов изображений на 10,2 минуты после инъекции для фиксации кинетики промывания/вымывания.
    4. Следите за процессом визуализации, чтобы убедиться, что изображения получены: следите за частотой дыхания мыши, чтобы убедиться, что физиология мыши стабильна во время сканирования.
    5. Снимите мышь и люльку с инструмента: Вынимите мышь из люльки. Дайте мыши восстановиться после анестезии. Верните мышь в нагретую клетку и следите за ней до тех пор, пока не начнёт передвигаться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующее программное обеспечение и ознакомьтесь с инструкциями производителя для прибора OAI. Ниже приведены шаги реконструкции и анализа OAI-инструмента, использующего программное обеспечение viewMSOT v4.0, а также Matlab R2019b или более новую версию Matlab.

4. Анализ результатов OS-DCE OAI

  1. Восстановить изображения OA.
    1. Выберите параметры реконструкции изображения: настройте реконструкцию изображения с использованием фильтрованного обратного проекционного фильтра 50 кГц — 6,5 МГц и включите автоматическую коррекцию энергии импульс-импульс.
    2. Реконструировать все изображения: получить изображения на всех длинах волн лазера, всех положений срезов и всех временных точек. Такой объём данных может потребовать значительного времени для восстановления изображения.
  2. Анализируйте OA-образы OS.
    1. Разведите хромофоры: проведите спектральное размешивание для получения параметрических карт оксигемоглобина (HbO 2), дезоксигемоглобина (Hb), общего гемоглобина (где HbT =HbO 2 + Hb) и %sO 2 (где %sO 2 = HbO2/HbT).
    2. Определите ROI:
      1. Вручную нарисуйте ROI, отражающую опухоль или рану в каждом срезе изображения. Определите консервативную отдачу от инвестиций, которая будет исключать пиксели периферии опухоли или раны, вместо того чтобы включать пиксели для нормальных тканей на периферии.
      2. В качестве альтернативы вручную определите один ROI, который отражает край опухоли, и второй ROI, представляющий ядро опухоли. Край опухоли может иметь большую васкуляризацию, чем ядро опухоли, что обеспечивает потенциально полезный анализ субрегионов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя могут быть получены дополнительные ROI опухолевых или рановых субрегионов, или можно оценивать значения HbO2, Hb, HbT или %sO 2 (без необходимости возврата инвестиций инвестиций), эти меньшие области имеют более низкий сигнал/шум, что приводит к неточным измерениям.
      3. Поддерживайте постоянные позиции ROI на всех изображениях в каждой длине волны и в каждой точке времени.
    3. Рассчитайте средние параметры для всей опухоли.
      1. Вычислите среднее значениеHbO-2, Hb, HbT и %sO2 в ROI опухоли или ROI раны для каждого среза визуализации и каждой временной точки.
      2. Для многослойного OS OAI вычислите среднее значениеHbO 2, Hb, HbT и %sO 2 по всем срезам визуализации, чтобы получить единое среднее значение для каждого параметра для всей опухоли или раны.
    4. Оценка стабильности параметров. Постройте значение %sO 2 для каждого повторения (см. шаг 3.2.4). Оцените, изменилось ли значение %sO2 более чем на 10% во время сканирования, что указывает на временно нестабильное измерение.
  3. Проанализировать изображения OA DCE.
    1. Размешивайте хромофоры в многоволновых изображениях DCE OA: Выполняйте спектральное размешивание для создания параметрических отображенийHbO2, Hb и контрастного агента. Этот шаг не нужен для одноволнового DCE OAI.
    2. Определите возврат инвестиций.
      1. Вручную нарисуйте ROI, отражающую опухоль или рану в каждом срезе изображения. Определите консервативную отдачу от инвестиций, которая будет исключать пиксели периферии опухоли или раны, вместо того чтобы включать пиксели для нормальных тканей на периферии.
      2. В качестве альтернативы вручную определите один ROI, который отражает край опухоли, и второй ROI, представляющий ядро опухоли. Край опухоли может иметь большую васкуляризацию, чем ядро опухоли, что обеспечивает потенциально полезный анализ субрегионов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя могут быть получены дополнительные ROI субрегионов опухоли или оценки по пикселям контрастного агента (не требующие возврата инвестиций), эти меньшие области имеют более низкий коэффициент сигнал/шум, что приводит к неточным измерениям.
      3. Поддерживайте постоянные позиции ROI на всех изображениях в каждой длине волны и в каждой точке времени.
    3. Извлечь кривые PK из OA-изображений DCE.
      1. Для возврата инвестиций в каждом срезе изображения экспортируйте временные точки по сравнению со средним сигналом ICG (из многоволнового DCE OAI) или OAI-сигналом на выбранной длине волны (для одноволнового DCE OAI).
      2. Вычислите средний сигнал для всех срезов изображения. График среднего значения сигнала по всему опухоли или ране по отношению к времени называется кривой PK.
      3. Передайте средний сигнал для всех срезов изображения в каждую точку времени в компьютерную программу, которая может оценить эмпирические параметры, перечисленные ниже. Например, Microsoft Excel и Graphpad Prism могут выполнять простые анализы графов.
    4. Вычислить эмпирические параметры, описанные в шагах 4.3.5–4.3.11.
    5. Нормализуйте кривую PK: определите среднее значение точек времени до введения, известных как базовый сигнал. Вычтите базовое значение сигнала из всех значений сигнала после инъекции.
    6. Определите максимальное усиление сигнала (MSE): определите максимальное значение сигнала после впрыска в кривой PK.
    7. Определите время до пика (TTP): определите значение временной точки MSE.
    8. Вычислите начальный наклон кривой PK.
      1. Получите этот начальный уклон от момента начальной инъекции к TTP. Или же вычислите наклон через 1 минуту после инъекции, если форма кривой слишком крутая или если TTP слишком поздня.
      2. В этом сценарии получите прединъекционные изображения в течение 1 минуты и вычислите этот уклон от Минуты 1.0 до Минуты 2.0 на кривой PK.
    9. Вычислите начальную площадь под кривой (IAUC): Вычислите среднее значение значений сигнала с момента первоначального ввода в TTP на кривой PK.
    10. Рассчитайте эмпирическую скорость фазы промыва.
      1. Для участка кривой PK от 1 минуты после TTP до последней временной точки эту часть кривой подгоняют на прямую или моноэкспоненциально затухающую функцию с постоянным смещением.
      2. Используйте наклон прямой линии или экспоненциальную постоянную затухания как эмпирическую меру скорости PK фазы размыва.
    11. Рассчитайте контрастно-усиленный OAI.
      1. Выберите временную точку длиннее TTP. Определите значение сигнала в данный момент времени как меру усиления контраста.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Часто выбирается временная точка через 10 минут после инъекции, но при необходимости могут быть выбраны и другие временные точки.
      2. В качестве альтернативы вычислите средний сигнал от TTP до выбранной временной точки, средний сигнал от TTP до последней временной точки или другой диапазон точек времени по необходимости.
      3. Обратите внимание, что средний сигнал эквивалентен площади под кривой PK для этих двух временных точек, что технически называется мерой интенсивности сигнала, а не мерой амплитуды сигнала.
    12. Выполните моделирование PK, как описано в шагах 4.3.13–4.3.20.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги анализируют изображения DCE OA, полученные с помощью прибора inVision OAI. Другие инструменты OAI могут создавать изображения в другом формате данных. Приведённые ниже шаги всё ещё можно выполнить для анализа OA-изображений DCE с использованием других OAI-инструментов, если формат данных с других приборов можно перенести в MatLab, а формат данных скорректировать для соответствия примерным файлам данных, предоставленным программным пакетом.
    13. Скачайте программу.
      1. Для многоволнового DCE OAI скачайте OE-DCE_MSOT_Matlab из репозитория CAMEL-MartyPagel на Github или https://github.com/CAMEL-MartyPagel/OE-DCE_MSOT_Matlab.
      2. Для одноволнового DCE OAI скачайте DCE-MSOT_SingleWavelength_Matlab из репозитория CAMEL-MartyPagel на Github или https://github.com/CAMEL-MartyPagel/DCE_MSOT_SingleWavelength_Matlab.
      3. Распаковать сжатый файл. Откройте файл SOP в папке doc и следуйте стандартной процедуре установки и использования программного обеспечения.
    14. Организуйте программные компоненты по разным папкам. Храните следующие программные файлы в одной папке:
      Основной код: run_MSOT_nonneg.m
      Подкоды: run_DCE_MSOT_MSP.m ; run_OE_MSOT_AK_nonneg.м
      Другие коды: Negative_pixel_count.m ; Voxel_count.m; ROI_modification.m
      Папка под названием: com.itheramedical.msotlib_beta_rev723_20221128_M2022b
      Данные экспортированы из ViewMSOT после реконструкции и спектрального смешивания.
    15. Запустить программу в MatLab.
      1. Дважды кликните на run_MSOT_nonneg.m, чтобы начать программу в Matlab. Нажмите кнопку «Запустить» в верхней части окна Matlab. Код может сообщать об ошибке, run_OE_MSOT_AK_nonneg отсутствует в текущей папке или на пути MATLAB.
      2. Чтобы исправить эту ошибку, введите addpath, затем поместите местоположение файла в кавычки (например, addpath 'C:\Users\yourname\Documents\Non negative analysis') перед запуском кода.
    16. Выберите тип анализа: введите N для анализа OE и Y для анализа DCE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программа способна анализировать изображения кислородно-усиленного (OE) OA, которые состоят из комбинации карт %sO2, полученных с использованием 21% кислородного газа (медицинского воздуха) или 100% O2 дыхательного газа, который не используется в исследованиях OS-DCE OAI, описанных в данном протоколе.
    17. Выберите данные:
      1. Выберите папку, содержащую файлы DCE OAI. Выберите основную папку сканирования, а не подпапку MSP.
      2. Затем проверьте название сканирования. Наконец, выберите папку для сохранения проанализированных данных.
    18. Введём 3 для количества хромофоров. Хромофоры — это Hb, HbO2 и контрастное вещество.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программа разработана с учётом OAI-анализа DCE нескольких хромофоров, которые при необходимости ко-инжекциируются в мышиную модель. Однако протокол DCE OAI в этом протоколе использует только один хромофор.
    19. Определите ROI, как описано в шагах 4.3.19.1–4.3.19.4.
      1. Определите ROI кровеносного сосуда, который будет выполнять функции артериального входа для анализа: появится изображение сканирования в оттенках серого. Вручную отслеживайте ROI, который отражает сосуд.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличите изображение, нажав на увеличительное стекло с плюсом чуть выше правого верхнего угла изображения. Нажмите на лупу ещё раз, чтобы вернуться в режим для получения ROI. Нижняя полая вена возле позвоночника часто может быть идентифицирована и использована как AIF.
      2. Определите отдачу от опухоли: появится изображение сканирования в оттенках серого. Проследите ROI, который отражает всю опухоль, край опухоли или ядро опухоли. Чтобы проанализировать более одного ROI, повторите всю процедуру моделирования PK (шаг 4.3.12) для получения дополнительного ROI.
      3. Определите ROI мышечной области: не используйте этот ROI в расчёте DCE OAI. Используйте ROI мышцы для анализа DCE OAI, используя модель линейных референтных областей, которая не используется в данном отчёте. Этот этап всё равно должен быть выполнен, чтобы программа могла продолжаться.
      4. Проверьте, что получена правильная отдача инвестиций. Начнётся моделирование кривой PK.
    20. Визуализируйте проанализированные результаты OAI DCE.
      1. Чтобы загрузить проанализированные данные DCE, перейдите в панель браузера и выберите DCE_MSOT_MSP.
      2. В командном окне введите «очистить всё».
        ПРИМЕЧАНИЕ: Вкладка текущей папки теперь заполнена проанализированными данными OAI DCE, включающими:
        Average_signal_Wavelength_ICG.mat: Дважды кликните, чтобы увидеть таблицные значенияNK транс и kep для ROI опухоли. Кинетические параметры определяются тремя способами:
        NK trans_avg: Среднее значениеNK-транс, рассчитанное для каждого пикселя.
        NK транс _avg_signal: Одно значениеNK-транс, рассчитанное после усреднения сигналов по всей опухоли
        NK trans _nz: NK trans_avg вычисляется только с ненулевой величиной пикселей.
        Аналогично, можно отображать kзначения ep .
        NKtrans.fig: Отображается картаNK trans _avg, наложенная на изображение в оттенках серого.
        kep.fig: отображает карту kep_avg наложенной на изображение в оттенках серого.
        Maps_Wavelength_ICG.mat: Это нужно загрузить, чтобы визуализировать другиекарты NK trans или kep . После загрузки этой матрицы используйте «код перекрытия» (прилагаемый отдельно) для отображения нужного параметра.
        Muscle_Average_signal_Wavelength_ICG.mat и Muscle_Maps_Wavelength_ICG.mat : Отображать параметры мышечной ROI.
        Нормализованный сигнал для ICG.fig: обозначает средний сигнал ICG за время в трёх ROI, нормализованный до максимального сигнала.
        Сигнал для ICG.fig: обозначает средний сигнал ICG за время в трёх ROI.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сигнал OAI может создавать карты насыщения кислородом в опухолях и ранах
После сбора и реконструкции многоспектральных наборов данных по ОАИ могут быть определены области интереса (ROI) внутри опухолей или ран для количественной оценки интенсивности сигнала на разных длинах волн. Затем применяются алгоритмы спектрального разбивания для разделения вклада оксигемоглобина (HbO 2) и дезоксигемоглобина (Hb) от составного оптоакустического сигнала. Эта обработка ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Кривые DCE OAI PK могут подвергаться влиянию различных артефактов, снижающих надёжность PK-анализа. Одной из распространённых ошибок является наличие поверхностных ран, корок или засохшей крови в поле визуализации, что может привести к сильному, неспецифическому всасыванию поверхности кожи и заслонять более глубокие сигналы (рисунок 8). При составлении ROI внутри опухоли следует соблюдать осторожность и избегать включения этих поверхностных структур, чтобы и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов в отношении этой работы.

Благодарности

Авторы выражают благодарность доктору Нилу Бёртону из iThera Medical, GmbH, за консультацию. Эта работа была профинансирована грантом UW-Madison Radiology NRSA (2T32CA009206-46), пилотным грантом ITPT по радиологическим наукам, программой премии Clinical and Translational Science Award (CTSA), грантами Национального центра развития трансляционных наук (NCATS), грантами UL1TR002373 и TL1TR002375, NIH R43 CA265603, NIH R01 EB034261, NIH R21 EB037731 и премией Falk Catalyst от Falk Medical Research Trust.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Игла на 20 GExel INT26417Шподермическая игла; 20G x 1", используется для приготовления растворов гепарина
Ячейки 4T1ATCCCRL-2539Тройной отрицательная линия рака молочной железы
Анти-Анти (100 раз)Gibco15240-062Антибиотиковый коктейль
Биопсионный ударIntegra 33-366 мм одноразовый биопсийный пуншон и bbsp;
Вода сорта клеточной культурыКорнинг25-055-CV500 мл; испытан по стерильному сатеру USP по спецификациям инектации 
Решение матрицы коллагенаКорнинг354262Коллагеновая матрица для фомации опухоли и инъекции
ЭтанолЛаборатория Дикона2701Универсальный антисептик
Глазная смазка  Optixcare 50-218-844220 г/0,70 унции; только для животных 
Марля  Фишербранд22-415-468Хлопковая марлевая подушечка; 3" x 3" (7,6 x 7,6 см); 12-слойная
ПерчаткиVWR76457-130Перчатки для анализа нитрила
ГепаринMeithealNDC71288-402-1010 000 единиц USP на 10 мл, 1000 единиц USP на мл; Многодозовый флакон объёмом 10 мл
Индоцианиновый зелёныйTCII0535Оптоакустический контрастный агент
ИзофлуранИзоспир17033-091-25Невоспламеняющийся, невзрывоопасный ингаляционный анестетик для использования у лошадей и собак; 250 мл 
Лабораторная плёнкаParafilm PM-9922" x 250'; Сердечник диаметром 1"
Nair body bream для удаления волос  НаирLL4038депилиаторный крем; Богатое какао-масло и витамин E
Needle ТэрумоNN2732R27G x 1 1/4" (6,40 мм x 32 мм); R.W. Reg. Bevel 
Оптоакустический аппарат для визуализацииiTheraMedical MSOT inVision 512Оптоакустический сканер
PBS, 1 разCorning 21-040-CV500 мл; Фосфатно-буферный физиологический раствор без кальция и магния 
RPMICorning 10-040-CVСреда для клеточной культуры
Физиологический растворHospiraNDC0409-4888-0210 мл одноразовой дозы; Впрыск хлорида натрия 0,9%, USP
СекундомерiTheraMedical 4135333Использовался для записи минут и секунд  
ШприцыКардинал Хелс11881280121 мл инсулинового шприца; Только инсулин U-100; 27G x 1/2" (0,35 x 12,7 мм)
Прозрачная повязка для раныTegaderm1624Wстиль прозрачной плёнки; 2 3/8" x 2 3/4" (6 см x 7 см)
ПинцетТермо Электрон  7626Используется для оттягивания кожи при введении клеток мышам
Гель для ультразвукаEcoVue28332 г в пакетике, без прпиленагликоля, водорастворимый, без парабена и красителей
Неокрашенные швыEthiconVR493Резка 18"; P-3 3/8 13 мм; Неокрашенный и плетёный, синтетический впитываемый шов, не USP
Подогревающая площадкаRepti Therm UTH120VAC 60 Гц 8Вт Привыкли к согреву животных под наркозом;  
Уилл СплинтсGrace Bio-Labs476684Прозрачный силикон, 14 мм OD x 10 мм ID толщины 0,5 с участками швов и nbsp;
Зажимы для ранReflex 7203-1000Система рефлекторного закрытия кожи, 7 мм, нержавеющая сталь

Ссылки

  1. Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic tomography: In vivo imaging from organelles to organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
  2. Ntziachristos, V., Razansky, D. Molecular imaging by means of multispectral optoacoustic tomography (MSOT). Chem Rev. 110 (5), 2783-2794 (2010).
  3. Sourbron, S. P., Buckley, D. L. Classic models for dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 26 (8), 1004-1027 (2013).
  4. Hupple, C. W., et al. A light-fluence-independent method for the quantitative analysis of dynamic contrast-enhanced multispectral optoacoustic tomography (DCE MSOT). Photoacoustics. 10, 54-64 (2018).
  5. Xiao, T. G., et al. Applying dynamic contrast-enhanced MSOT imaging to intratumoral pharmacokinetic modeling. Photoacoustics. 11, 28-35 (2018).
  6. Han, Z., et al. Dynamic 2-deoxy-D-glucose-enhanced multispectral optoacoustic tomography for assessing metabolism and vascular hemodynamics of breast cancer. Photoacoustics. 32, 100531(2023).
  7. Pickles, M. D., Manton, D. J., Lowry, M., Turnbull, L. W. Prognostic value of pre-treatment DCE-MRI parameters in predicting disease-free and overall survival for breast cancer patients undergoing neoadjuvant therapy. Eur J Radiol. 71 (3), 498-505 (2009).
  8. Goel, S., et al. Evaluations of radiotherapy in small animal models of pancreatic cancer with oxygen-enhanced–dynamic contrast-enhanced multispectral optoacoustic tomography (OE-DCE MSOT). Photons Plus Ultrasound: Imaging and Sensing 2023, 12379, (2023).
  9. Yang, E., et al. Evaluations of a cutaneous wound healing model using oxygen-enhanced dynamic contrast-enhanced photoacoustic imaging (OE-DCE PAI). Mol Imaging Biol. 26 (6), 995-1004 (2024).
  10. Longo, D. L., et al. Water-soluble melanin derivatives for dynamic contrast-enhanced photoacoustic imaging of tumor vasculature and response to antiangiogenic therapy. Adv Healthcare Mater. 6 (1), 1600550(2017).
  11. Ermolayev, V., Dean-Ben, X. L., Mandal, S., Ntziachristos, V., Razansky, D. Simultaneous visualization of tumour oxygenation, neovascularization and contrast agent perfusion by real-time three-dimensional optoacoustic tomography. Molec Imaging. 26, 1843-1851 (2016).
  12. Chen, Z., et al. Concurrent fluorescence and volumetric optoacoustic tomography of nanoagent perfusion and bio-distribution in solid tumors. Biomed Opt Express. 10 (10), 5093-5102 (2019).
  13. Taruttis, A., Morscher, S., Burton, N. C., Razansky, D., Ntziachristos, V. Fast multispectral optoacoustic tomography (MSOT) for dynamic imaging of pharmacokinetics and biodistribution in multiple organs. PLoS One. 7 (1), e30491(2012).
  14. Tomaszewski, M. R., Gehrung, M., Joseph, J., Quiros-Gonzalez, I., Disselhorst, J. A., et al. Oxygen-enhanced and dynamic contrast-enhanced optoacoustic tomography provide surrogate biomarkers of tumor vascular function, hypoxia, and necrosis. Cancer Res. 78 (20), 5980-5991 (2018).
  15. Choi, W., Park, B., Choi, S., Oh, D., Kim, J., et al. Recent advances in contrast-enhanced photoacoustic imaging: and practical challenges. Chem Rev. 123 (11), 7379-7419 (2023).
  16. Weber, J., Beard, P. C., Bohndiek, S. E. Contrast agents for molecular photoacoustic imaging. Nat Methods. 13 (8), 639-650 (2016).
  17. Fu, Q. R., Zhu, R., Song, J. B., Yang, H. H., Chen, X. Y. Photoacoustic imaging: Contrast agents and their biomedical applications. Adv Materials. 31 (6), 1805875(2019).
  18. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J Basic Clin Pharm. 7 (2), 27-31 (2016).
  19. Alander, J. T., et al. A review of indocyanine green fluorescent imaging in surgery. Int J Biomed Imaging. 2012, 940585(2012).
  20. Xia, J., Chen, W. Y., Maslov, K., Anastasio, M. A., Wang, L. H. V. Retrospective respiration-gated whole-body photoacoustic computed tomography of mice. J Biomed Opt. 19 (1), 016003(2014).
  21. Liu, S., Wang, T., Zheng, X., Zhu, Y., Tian, C. On the imaging depth limit of photoacoustic tomography in the visible and first near-infrared windows. Optics Express. 32 (1), 5460-5480 (2024).
  22. Oraevsky, A., Clingman, B., Zalev, J., Stavros, A., Yang, W., et al. Clinical optoacoustic imaging combined with ultrasound for coregistered functional and anatomical mapping of breast tumors. Photoacoustics. 12, 30-45 (2018).
  23. Cox, B., Laufer, J. G., Arridge, S. R., Beard, P. C. Quantitative spectroscopic photoacoustic imaging: a review. J Biomed Opt. 17 (6), 061202(2012).
  24. Khodaverdi, A., et al. Two photoacoustic spectral coloring compensation techniques adapted to the context of human in-vivo oxygenation measurements. Biomed Optics Express. 16 (6), 2217-2231 (2025).
  25. Reinhart, M. B., Huntington, C. R., Blair, L. J., Heniford, B. T., Augenstein, V. A. Indocyanine green: Historical context, current applications, and future considerations. Surg Innov. 23 (2), 166-175 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Оценка оксигенации и сосудистой перфузии в доклинических моделях рака и заживления ран с использованием OS-DCE OAI
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.