Двойная лентивирусная трансдукция для получения мутантных нейронных стволовых клеток для исследований глиомы

Краткое содержание

Этот протокол описывает создание мутантных мышиных нейронных стволовых клеток (НСК) для исследований глиомы с использованием последовательных лентивирусных трансдукций. Онкогенные мутации сначала вводятся в НСК, затем в бицистронный лентивирус с репортерскими генами. После двойного отбора антибиотиков мутантные НСК позволяют в реальном времени визуализировать рост опухолей и ответ на лечение.

Аннотация

Глиомы являются наиболее распространёнными первичными опухолями мозга у взрослых, и мышиное моделирование предполагает, что они могут возникать из-за онкогенных мутаций в НСК или ранних дифференцировающихся предшественников. Модели ортотопной трансплантации, полученные из мутантных НСК, таким образом, обладают потенциалом получения ценной доклинической информации о патогенезе глиомы, исходах и ответе на лечение. Эти модели требуют внедрения онкогенной мутации в НСК, преимущественно в сочетании с репортерами для определения эффективности трансфекции/трансдукции и мониторинга роста опухоли in vivo. Этот протокол описывает методологию на основе двойной трансдукции для создания мутантных НСК, подходящих для мониторинга опухолей in vivo . В этой методике изолированные НСК сначала трансдуцируются лентивирусами, содержащими интересующий ген (онкогенная мутация или контроль зелёного флуоресцентного белка [GFP]), а также элемент устойчивости к бластицидину. После отбора бластицидина клетки вторично трансдуцируются с помощью бицистронного лентивирусного вектора, экспрессирующего люциферазу и красный флуоресцентный белок (RFP), а также элемент, устойчивый к пуромицину. После отбора пуромицинов клетки могут расширяться для пролиферационных анализов, ортотопной трансплантации или других последующих применений. Такой подход к двойной трансдукции позволяет оценивать эффективность трансдукции на обеих стадиях инфекции, а также контролировать in vivo образование, рост и реакцию опухоли на терапию с помощью неинвазивной биолюминесцентной визуализации (BLI). Эта система представляет собой полезный инструмент для исследований глиомы, объединяя биологическую значимость моделирования опухолей взрослых нейронных стволовых клеток с практическими преимуществами возможности визуализации в реальном времени, что в конечном итоге улучшает понимание биологии глиомы и способствует развитию новых терапевтических подходов.

Введение

Глиомы — самая распространённая форма первичных опухолей мозга, поражающих взрослых, составляя примерно 80% всех злокачественных новообразования мозга в этой^{популяции1}. Большинство из них — это высокостепенные^{глиомы 2}, которые обычно очень инвазивны и имеют плохой прогноз ^3,4, несмотря на значительный прогресс в нейрохирургических методах, лучевой терапии и химиотерапевтических^{методах 5}. Высокий уровень смертности среди пациентов с этими опухолями подчеркивает необходимость продолжающихся исследований формирования и прогрессирования глиом.

Глиомагенез в центральной нервной системе может быть вызван введением онкогенных мутаций в НСК^{6, 7, 8, 9} или их раннее дифференцирующее^{потомство 10, 11, 12} в исследованиях моделирования мышей. В частности, эти исследования показали, что те же онкогенные мутации часто не приводят к образованию опухолей при введении в более дифференцированные^{клетки 13}, что создаёт иерархию происхождения клеток, где усиление линии ограничиваний коррелирует с снижением восприимчивости к^{трансформации 14}. Таким образом, генетически модифицированные NSC часто используются для создания биологически значимых и универсальных моделей глиом, используя либо трансгенные методы, либо методы ортотопной^{трансплантации 15}. Оба подхода позволяют изучать образование de novo опухолей в естественной среде мозга из нетрансформированной клетки. Генетически модифицированные модели позволяют проводить такое исследование на животных с целостной иммунной системой, часто лучше имитируя гистологию и клеточную гетерогенность, наблюдаемую у опухолей^{человека 16}. Однако создание таких моделей требует трудозатрат и затрат, и они часто демонстрируют длительные задержки и низкую частоту образования^{опухолей 16}. В отличие от этого, ортотопические модели NSC более легко манипулируемы и экономически эффективны. Мутантные НСК могут быть получены из первичных или увековеченных клеток мышей или человека на основе экспериментальных потребностей, а также подходят для in vitro. ^{Эксперименты 16,17}. Кроме того, эти модели позволяют точно корректировать стадию развития как NSC, так и принимающих мышей, а также пространственную локализацию, из которой производятся NSC и к которой они вводятся. Это позволяет исследователям изучать, как возраст и определённые области мозга влияют на опухологенез, вызванный определёнными^{мутациями 17}.

Этот протокол описывает методологию получения мутантных мышиных НСК из первичной культуры, которые подходят как для экспериментальных применений in vitro, так и in vivo (рисунок 1). Протокол состоит из двух отдельных фаз трансдукции, которые происходят в определённой временной последовательности. На начальной стадии трансдукции изолированные мышиные НСК инфицируются рекомбинантными лентивирусами, несущими целевой генетический конструкт — либо онкогенную мутацию, либо зелёный флуоресцентный белок (GFP), а также кассету с бластицидин-резистентностью. После этого применяется давление отбора антибиотиков с помощью бластицидина, позволяя только выжившим трансдуцированным клеткам перейти к вторичному трансдукционному событию. Это вторичное событие использует конструкцию бицистронного лентивируса, которая кодирует как гены репортеров люциферазы светлячков, так и репортеров белка красного флуоресцентного белка (RFP), а также элементы резистентности к пуромицину для последующего отбора. После отбора с помощью пуромицина полученные популяции НСК с двойной трансдукцией расширяются in vitro перед последующим проведением экспериментов. Этот последовательный подход к трансдукции обладает несколькими методологическими преимуществами: (1) он облегчает количественную оценку эффективности трансдукции на^{каждом этапе 18}, (2) устанавливает стабильные репортерные клеточные линии, подходящие для продольного отслеживания, и (3) позволяет неинвазивно отслеживать инициацию опухоли, прогрессирующую кинетику и терапевтические реакции с помощью методологий^{BLI 18,19,20}. Он также может использоваться с первичными или увековечёнными NSC^{21, 22, 23}.

Представленный здесь протокол решает острую необходимость стандартизированного, эффективного и биологически релевантного подхода к созданию моделей глиом, полученных на основе NSC, у взрослых животных с интегрированными возможностями визуализации. Ожидается, что полученные модели дадут клинически значимые данные по патогенезу глиомы, облегчат выявление новых терапевтических целей и предоставят надёжные платформы для доклинической оценки новых стратегий лечения.

Протокол

Это исследование было проведено в соответствии с этическими стандартами и нормативными нормами, установленными Вашингтонским университетом в Сент-Луисе. Для этого протокола кора взрослых мышей была микровскрыта согласно ранее описанной^{методике 24} лаборатории Броссье и использована для выделения первичных мышиных НСК для последующего расширения в неадгезентной культуре согласно установленному^{протоколу 24,25,26}. Все реагенты, используемые в культуре, либо поставляются в стерильной форме, либо проходят через мембранный фильтр толщиной 0,2 мкм для обеспечения стерильности. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Изоляция нейронных стволовых клеток из микродиссектированной ткани

1. Приготовьте среду для диссоциации (DM) и среду для диджеста трипсина (TDM) согласно рецептам, показаным на рисунке 2.
   1. Добавьте 200 мкл среды для дижеста Трипсин в микроцентрифугные пробирки объемом 1,5 мл и храните на льду не менее 20 минут перед использованием. ДМ можно оставить при комнатной температуре для последующих этапов протокола.
   2. Во время предварительного охлаждения тюбиков подготовьте базовую среду для нейронных стволовых клеток (NSC; рецепт показан на рисунке 2) и поместите NSC и сыворотку плода (FBS) при 37 °C в водную или бусинную ванну для предварительного нагрева. Положите аликвоты добавок (B27, N2) и факторов роста (EGF, FGF) в ведро для медленного оттаивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TDM необходимо готовить свежим каждый раз перед использованием, хотя NSC и DM можно хранить при 4 °C между использованиями; рецепты показаны на рисунке 2. Запасы N2, B27, EGF и FGF должны быть аквитированы и хранятся при -20 °C до использования; избегайте повторных замораживаний и оттаивания восстановленных запасов (см. Таблицу материалов для подробностей при подготовке запасов EGF и FGF).
2. После достаточного охлаждения микроцентрифугных трубок с TDM ткань, как описано^ранее, микродиссектируются 24. После каждой микродиссекции помещайте ткань в микроцентрифугную трубку. Верните трубку в лёд, пока все рассечения не будут завершены, так как любое нагревание тканей может рано начать ферментативный процесс пищеварения и привести к чрезмерному перевариванию.
3. Инкубировать микроцентрифугную трубку при 37 °C в водяной или шариковой ванне в течение 15 минут, чтобы запустить ферментативное переваривание. Во время инкубации подготовьте 10% FBS в NSC, добавив 0,5 мл FBS к 4,5 мл NSC.
   1. После инкубации осторожно обрабатывайте образцы пипеток 5–10 раз микропипеткой объемом 1 мл для дальнейшей дисоциации клеток, затем нейтрализуйте трипсин, добавляя 200 мкл 10% FBS в каждый образец. Аккуратно поднимай и опускай, чтобы смешивать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно соблюдать рекомендуемое время инкубации при 37 °C. Чрезмерная трипсинизация может привести к гибели клеток, тогда как недотрипсинизация может затруднять диссоциацию образца (см. таблицу 1, пункты 1–2 для этого и других советов по устранению неполадок).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для инкубации образцов могут использоваться либо водяная баня, либо ванна с бусинами; Последнее может снизить риск^{загрязнения 27}, но это может сопровождаться риском менее эффективной^{теплопередачи 28}.
4. Опустить изолированные первичные клетки при 630 × г в течение 5 минут при 4 °C. Аспирируйте супернатант, стараясь не потревожить клетки на дне колодца. Промывайте клетки, добавляя 2,5 мл ДМ в гранулу и повторно суспензируя, аккуратно поднимая и опуская 3–4 раза. Снова закрутите вниз при 630 × г в течение 5 минут при 4 °C и аккуратно аспирируйте супернатант.
5. Повторите шаг 1.3, чтобы выполнить вторую промывку. Во время финальной промывки добавьте B27, N2, FGF и EGF в предварительно нагретую основную NSC-среду, чтобы получить полноценную NSC-среду (рецепт показан на рисунке 2).
6. Аспирировать супернатант. Добавьте 2 мл тёплой полной среды NSC в каждую клеточную гранулу, затем повторно взвешенывайте, аккуратно протирая вверх и вниз 3–4 раза. Поместите вновь взвешенные клетки в одну из ямоч шести-лунной пластины с низким уровнем прикрепления и инкубуйте при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя базовая среда NSC может храниться при 4 °C между использованиями, добавки и факторы роста могут деградировать при этой температуре. Таким образом, B27, N2, FGF и EGF следует добавлять в среду NSC, чтобы создать полноценную среду NSC непосредственно перед использованием.

2. Формирование и расширение культуры нейросферы

1. Вводите 0,5–1 мл свежей кормовой среды NSC (рецепт показан на рисунке 2) в каждую колодцу культур NSC каждые 3 дня.
2. Следите за формированием нейросферы. Когда видны полностью сформированные небольшие сферы, культура готова к прохождению (обычно через 5–10 дней после первоначального покрытия).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки лучше всего растут при частом прохождении и в логарифмической фазе роста. Крупные нейросферы сложнее диссоциировать и более подвержены гибели клеток в этом процессе. Поэтому рекомендуется более раннее и частое пассирование для поддержания здоровья клеток. Когда будут готовы к проходу, изолированные нейросферы будут иметь диаметр ~100–200 мкм с плотно упакованными клетками и гладкими, чётко очерченными границами при яркой микроскопии. Нейросферы не будут демонстрировать нерегулярные проекции или расширения. Центр нейросфер будет немного темнее внешних краёв, но не чрезмерно; Чрезмерно тёмные ядра часто возникают из-за некроза центральных клеток из-за нехватки питательных веществ при перерастании нейросфер. Пропускание переросших нейросфер часто приводит к высокой гибели клеток, что может повлиять на дальнейшие применения. См. таблицу 1, пункты 3–4 для этого и других советов по устранению неполадок.
3. Предварительно прогрейте среду NSC, ДМ, 0,05% трипсина-ЭДТА и фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) при 37 °C с помощью воды или ванны с бусинами. Кладите запасы B27, N2, FGF, EGF и FBS на лёд до необходимости.
4. Для прохода переместите хорошо выросшие нейросферы в стерильную коническую трубку объёмом 15 мл с помощью серологической пипетки. Центрифуга при 630 × г в течение 1 минуты при 4 °C для успокоения нейросфер. Аспирируйте супернатант, стараясь не нарушить гранулированные нейросферы. Промыйте клетки, снова суспензировав в стерильном 1x PBS, затем снова центрифугая при 630 × г в течение 5 минут при 4 °C и аспирируя супернатант.
5. Добавьте 1 мл 0,05% трипсина/ЭДТА в клеточную гранулу. Пипетки вверх и вниз 3–5 раз с помощью микропипетки объемом 1 мл для смешивания, затем инкубировать при 37 °C в водной или бусинной ванне в течение 5–6 минут.
   1. После инкубации аккуратно поднимайтесь и опускайте 5–10 раз с помощью микропипетки объемом 1 мл, чтобы разрушить нейросферы. Нейтрализуйте трипсин, добавив 1 мл 10% FBS в среде NSC; Аккуратно перемешивайте пипетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерной трипсинизации и/или чрезмерно интенсивного пипетирования нейросфер, так как это может повредить НСК и повлиять на жизнеспособность клеток.
6. Добавьте 2,5 мл DM и центрифугуйте при 630 × г на 5 минут при 4 °C. Аспирировать супернатант. Повторите этап промывания с ещё 2,5 мл ДМ, затем центрифугирование и аспирация супернатанта, чтобы удалить следы FBS в среде.
7. Суспензировать клетки в свежем полном среде NSC 1 мл. Суспензия фильтрующей ячейки, помещая стерильный фильтр 40 мкм в микроцентрифугную трубку на 50 мл, затем добавляя раствор в верхнюю часть фильтра и позволяя гравитации сливить раствор в трубку. Любые оставшиеся недиссоциированные клетки будут захвачены фильтром, а отдельные клетки проходят в раствор ниже.
8. Из вновь суспензивших, отфильтрованных клеток возьмите 10 мкл для подсчёта и смешайте с 10 мкл трипан-синий. Используя ручной гемоцитометр, загрузите 10 мкл образца и посчитайте жизнеспособные клетки (то есть клетки, не синие) согласно^{стандартной практике 29}. В качестве альтернативы может использоваться автоматический счётчик ячеек, хотя он может быть менее точен при наличии ячеточного мусора или^{агрегатов 30,31}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, менее 10–15% всех клеток должны проявлять признаки гибели клеток (например, невозможность исключить трипан-синий). Более высокие показатели гибели клеток могут быть вызваны чрезмерной трипсинизацией, чрезмерной механической силой при разделении клеток или плохим общим состоянием культуры перед трипсинизацией (см. таблицу 1, пункты 1–3). Поскольку это может негативно повлиять на дальнейшие применения, рекомендуется перепластинировать клетки (шаг 2.9) и снова расширять (например, повторять шаги 2.1–2.9), если наблюдается высокая смертность клеток, а не переход к трансдукции.
9. Разведите 5 x 10⁵ ячеек в 2 мл свежего полного NSC средного материала и разведите в одну яму, сверхслабую пластину с 6 лунками. Каждые три дня вводите 0,5–1 мл свежего кормления NSC в каждую скважину для обеспечения оптимального здоровья культуры. Когда полностью сформированные, здоровые сферы видны (см. таблицу 1, пункт 4), культура готова к использованию на шагах 3 или 4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные НСК можно хранить на этом этапе, ресуспендировав один миллион НСК в 1 мл клеточной среды для замораживания клеток без сыворотки в криовиале объёмом 1,5 мл и храня при -80 °C. НСК также можно дополнительно расширить при необходимости, помещая дополнительные клетки в дополнительные ямы шестиколодной пластины или упаковывая в колбы T-25.

3. Кривая поражения бластицидина в родительских клетках

ПРИМЕЧАНИЕ: После того как проходящие НСК формируют здоровые нейросферы, клетки готовы к последующим экспериментам. Перед трансдукцией крайне важно определить оптимальную концентрацию селективного антибиотика (в данном случае бластицидина). Это необходимо проводить эмпирически, поскольку разные популяции НСК могут иметь разную восприимчивость к антибиотику. Если это уже определено для данного типа клетки, перейдём к шагу 4.

1. Предварительно прогрейте базовую среду NSC, DM, 0,05% трипсина-EDTA и PBS при 37 °C. Запасы разморозки B27, N2, FGF, EGF, FBS и бластицидина. Перед началом или во время инкубационных этапов ниже сделайте свежую полную среду NSC и 10% FBS в среде NSC, как описано выше.
2. Используя свежерасширенные нейросферы (после посева из шага 2.9 выше), трипсинизуйте и затем разделяйте в соответствии с шагами 2.5–2.6, затем ресуспензируются в свежем NSC объёмом 1 мл для подсчёта. Фильтруйте клетки через стерильный фильтр диаметром 40 мкм, как описано выше, чтобы удалить недиссоциированные клетки, затем подсчитайте клетки, как описано в шаге 2.8.
3. Ресуспензировать 25 000 жизнеспособных клеток в 2,5 мл аликвот свежего полного НСК в 15 мл конусов, при этом 1 аликвот на концентрацию антибиотика будет подвергаться тестированию. Планируйте тестировать как минимум 4–6 различных концентраций, хотя при желании можно проверить и больше.
4. Добавьте соответствующее количество бластицидина в каждые 2,5 мл аликвота для достижения желаемой конечной концентрации (см. расчёты образцов в Таблице 2). Пластина 500 мкл взвешенных клеток (5 000 клеток) на одну скважину в 24-лунной пластине с ультранизким уровнем прикрепления, каждая концентрация покрыта в четырёхкратной пластине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения правильной конечной концентрации бластицидиновый бульон может потребовать разведения перед добавлением в среду. Бластицидин может разбавляться в среде NSC или PBS; для разбавленного запаса 1:1000 (10 мг/мл) добавьте 1 мл неразбавлённого (10 мг/мл) бластицидина до 999 мл NSC или PBS. Рекомендуется исследователям выполнять все необходимые расчёты для достижения желаемых концентраций во время нагрева материалов в шаге 3.1; примеры вычислений, показанных в Таблице 2.
5. Инкубировать клетки при 37 °C. Тщательно проверяйте клетки с помощью микроскопии Brightfield каждые 24 часа на изменения морфологии и гибель клеток/нейросферы. Кормите клетки каждые 3 дня, добавляя 0,5–1 мл свежей кормовой среды NSC с правильной концентрацией бластицидина.
6. Определите подходящую концентрацию для последующего отбора бластицидина, определив наименьшую концентрацию бластицидина, которая убивает нетрансдуцированные клетки в период от 72 до 120 часов после покрытия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для взрослых мышиных НСК лучшая концентрация для отбора антибиотиков была определена 1000 нг/мл (1 мг/мл) бластицидина (рисунок 3). Последующие этапы выполняются с использованием бластицидина при этой концентрации. Следует отметить, что оптимальная концентрация бластицидина может значительно варьироваться в разных клеточных препаратах, обычно от 0,5 до 10 мкг/мл в зависимости от типа образца, количества проходов и условий^{культуры; 32,33}; Эмпирические кривые уничтожения являются необходимыми, а не необязательными для каждого нового типа ячеек. См. таблицу 1, пункт номер 5 для дополнительных советов по устранению неполадок.

4. Первая лентивирусная трансдукция

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед переходом к трансдукции важно знать оптимальную мультипликацию инфекции (MOI), при которой можно трансдукировать лентивирусные частицы (LVP). Это необходимо определить эмпирически для разных типов клеток; Методы этого уже были подробно описаны^34,35. В иллюстративных результатах был использован MOI 20, основанный на предыдущем опыте трансдукции первичных мышиных НСК.

1. Начните с расширенных, нетрансдуцированных НСК, формирующих здоровые нейросферы (возникающих после расширения клеток в шаге 2.9 выше). Разделить, повторно суспенгирать, фильтровать и подсчитать клетки в соответствии с шагами 2.3–2.8 выше, затем пластинировать ячейки плотностью 1,5 x 10⁶ клеток на каждую скважину в две ямы (одну для онкогенного вируса, другую для контроля) пластины с 6 лунками с ультранизкой адгезией. Инкубировать тарелки ночью при 37 °C.
2. На следующий день осмотрите клетки. НСК будут готовы к заражению, если образуют небольшие комки.
3. Перед заражением клеток аккуратно разморозите лентивирусный аликвот на льду, чтобы обеспечить постепенное оттаивание. Крайне важно не торопить этот процесс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для иллюстрации этот протокол описывает трансдукцию лентивируса с помощью двух репрезентативных конструкций: (1) контрольного вектора, экспрессирующего GFP под промотором EF1-α с устойчивостью к бластицидину, и (2) экспериментальный вектор, экспрессирующий N-терминальный HA-метированный онкогенный мутант BRAF V600E под промотором EF1-α, также обладающий устойчивостью к бластицидину. Генерация лентивирусов выходит за рамки этого протокола, но ранее была подробно^{описана 36,37}.
4. После размораивания ненадолго нагрейте вирус до 37 °C непосредственно перед заражением. Определите объём LVP для добавления в каждую яму, используя формулу MOI x количество клеток/титр вируса. Используя микропипетку, настроенную на рассчитанный объём, медленно добавляйте LVP по капле к культивируемым клеткам. Аккуратно покрутите тарелку для распределения, стараясь не разбить материал в соседние колодцы. Инкубировать клетки при 37 °C в течение 24 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После того как вирусный аликвот был разморажен до комнатной температуры, его нельзя повторно заморозить и использовать в течение 24 часов. После того как аликвот нагревается до 37 °C, его нужно использовать в течение 30 минут.
5. После этого инкубационного периода центрифугайте нейросферы при 630 × г в течение 5 минут при 4 °C, затем аспирируйте супернатант. Повторно суспензируйте в свежем полном NSC объёмом 2 мл без вирусов и антибиотиков и поместите в свежий отсек с низким уровнем крепления пластины с 6 колодцами.
6. На следующий день оцените эффективность трансдукции в контрольных клетках GFP, определив долю флуоресцентно маркированных клеток/сгустков к общим клеткам/сгусткам с помощью флуоресцентной микроскопии в нескольких областях. Ожидаемая репортерная экспрессия (GFP) должна превышать 80% для успешной трансдукции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если отмечена неоптимальная эффективность трансдукции, можно провести второй цикл инфекции (повторяя шаги 4.4–4.6). Если эффективность не улучшается, рассмотрите возможность повторной оптимизации MOI или испытания другого препарата лентивируса. См. таблицу 1, пункт номер 6 для этих и других советов по устранению неполадок.
7. После того как развивающиеся нейросферы выглядят здоровыми и имеются признаки инфекции (положительный GFP; ~80%), приступайте к расщеплению клеток согласно шагам 2.3–2.6 выше. Суспензировать клетки в свежем объеме 5 мл полной среды NSC с соответствующей концентрацией бластицидина (1000 нг/мл), затем профильтровать через стерильные фильтры диаметром 40 мкм для устранения комков клеток. Посчитайте клетки, затем пластинируйте примерно 5 x 10⁴ клетки/мл в колбах с ультранизкой степенью прикрепления T-25.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После первоначального добавления антибиотика может наблюдаться высокая частота гибели клеток, так как нетрансдуцированные клетки умирают; Это ожидаемо и должно улучшаться по мере продолжения отбора.
8. Расширяйте клетки, питая их каждые 3 дня добавками, содержащей бластицидин. Когда полностью сформированы, здоровые сферы видны, обычно через 5–10 дней после расщепления культура готова к использованию на этапе 5 или 6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После дальнейшего расширения резистентных клонов клетки могут быть собраны для вестерн-блоттинга (описанного на шаге 7), чтобы подтвердить, что онкогенный конструкт с нефлуоресцентной маркировкой HA экспрессируется должным образом. Если вестерн-блоттинг проводится на этом этапе, всё равно рекомендуется проверять экспрессию после^{второй трансдукции} (на шаге 7), чтобы обеспечить соответствующее продолжающееся выражение.

5. Кривая уничтожения пуромицина в НСК, устойчивых к бластицидину,

ПРИМЕЧАНИЕ: оптимальная отборочная концентрация для второй трансдукции также должна быть определена эмпирически. На этом этапе используются трансдуцированные НСК, устойчивые к бластицидину, а клетки поддерживаются под отбором бластицидина (1000 нг/мл), поскольку трансдукция и однопутный отбор бластицидина могут изменять чувствительность к пуромицину.

1. Предварительно прогрейте базовую среду NSC, DM, 0,05% трипсина-EDTA и PBS при 37 °C. Разморозка запасов B27, N2, FGF, EGF, FBS, бластицидина и пуромицина. Перед началом или во время инкубационных этапов ниже сделайте свежую полную среду NSC и 10% FBS в среде NSC, как описано выше.
2. Используя нейросферы, устойчивые к бластициду, трипсинизуйте и затем разделяйте в соответствии с шагами 2.5–2.7, ресуспензируя в свежем NSC объёмом 1 мл для подсчёта и фильтрации с целью удаления комков. Посчитайте клетки, как описано в шаге 2.8, затем ресуспенгируйте 25 000 жизнеспособных клеток в 2,5 мл аликвотов свежего полного НСК в 15 мл конических клеток, при этом 1 аликвот на концентрацию антибиотика будет подготовлен для тестирования. Планируйте тестировать как минимум 4–6 различных концентраций, хотя при желании можно проверить и больше.
3. Добавьте бластицидин для достижения ранее оптимальной концентрации (1000 нг/мл = 0,25 мл неразбавлённого запаса / 2,5 мл аликвот). Затем добавьте соответствующее количество пуромицина в каждую пробирку для достижения желаемой конечной концентрации (см. расчёты образцов в Таблице 2).
4. Пластина 500 мкл взвешенных клеток (5 000 клеток) на одну скважину в 24-лунной пластине с ультранизким уровнем прикрепления, каждая концентрация покрыта в четырёхкратной пластине.
5. Инкубировать клетки при 37 °C. Тщательно проверяйте клетки с помощью микроскопии Brightfield каждые 24 часа на изменения морфологии и гибель клеток/нейросферы. Кормите клетки каждые 3 дня, добавляя 0,25 мл свежей кормовой среды NSC с добавлением бластицидина и правильной концентрацией пуромицина.
6. Определите подходящую концентрацию для последующего отбора пуромицина, определив наименьшую концентрацию пуромицина, которая убивает клетки в период от 72 до 120 часов после нанесения пластин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для взрослых мышиных НСК, трансдуцированных иллюстративными GFP и/или лентивирусами BRAF-V600E, эмпирически было определено 100 нг/мл пуромицина как лучшая концентрация для отбора антибиотиков (см. рисунок 4). Для примера трансдукций последующие этапы выполнялись с использованием 1000 нг/мл бластицидина (из шага 3 выше) и 100 нг/мл пуромицина (из шага 5 выше). См. Таблицу 1, пункт номер 5 для советов по устранению неполадок.

6. Вторая лентивирусная трансдукция

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки остаются в среде, содержащей бластицидин, во время второй фазы трансдукции, чтобы обеспечить сохранение онкогенной конструкции или контроля GFP, введённого в первой фазе трансдукции.

1. Начните процедуру с использованием активно пролиферирующих НСК, стабильно трансдуцирующихся бластицидин-резистентных препаратов (созданных на шаге 4). Начните с диссоциации NSC в одну ячейку (шаги 2.3–2.7) для обеспечения равномерности при нанесении пластины.
2. Пластинчатые ячейки плотностью 1,5 x 10⁶ клеток на скважину в полной среде NSC с бластицидином (1000 нг/мл, как определено на шаге 3) в пластину с 6 лунками с ультранизкой адгезией. Инкубировать тарелки ночью при 37 °C.
3. На следующий день клетки будут готовы к трансдукции, если образуют небольшие сгустки. Разморозить бицистронный лентивирус (содержащий люциферазу и RFP) на льду, затем кратковременно нагреть до 37 °C непосредственно перед инфекцией. Определите объём LVP для добавления в каждую яму, используя формулу MOI x количество клеток/вирусный титр; здесь используется MOI 20.
   1. Используя микропипетку, настроенную на рассчитанный объём, медленно добавляйте LVP по капле к культивируемым клеткам. Аккуратно покрутите тарелку для распределения, стараясь не разбить материал в соседние колодцы. Инкубировать клетки при 37 °C в течение 24 часов.
4. На следующий день центрифугуйте нейросферы при 630 × г в течение 5 минут при 4 °C и перелистуйте их в свежий полный NSC, содержащий бластицидин (1000 нг/мл, согласно шагу 3).
5. На следующий день оцените эффективность второго этапа трансдукции, определив долю RFP-положительных клеток/сгустков по сравнению с полными клетками/сгустками с помощью флуоресцентной микроскопии в нескольких полях, с оптимальной эффективностью ~60%.
6. Наблюдая, что нейросферы выглядят здоровыми и что второй этап трансдукции был эффективен (например, большинство клеточных сгустков имеют RFP+), клетки готовы к двойному отбору. Начните с диссоциации NSC в одноклеточную суспензию (шаги 2.3–2.7), затем повторно переплитуйте с примерно 5 x 10⁴ клетки/мл в колбах с ультранизкой концентрацией T-25 в полном NSC, содержащем бластицидин (1000 нг/мл) и пуромицин (100 нг/мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в шаге 4.6 выше, если отмечена неоптимальная эффективность трансдукции, может быть проведена вторая серия инфекции (повторяя шаги 6.3–6.6). См. Таблицу 1 для дальнейших советов по устранению неполадок.
7. Кормите клетки каждые 3 дня пищевой добавкой, содержащей бластицидин и пуромицин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательный мониторинг культур крайне важен для выявления клонов двойной устойчивости, которые будут отличаться выживанием при обоих селективных нагрузках. Когда полностью сформированы, здоровые сферы видны, обычно через 5–10 дней после расщепления культура готова к дальнейшей валидации (шаг 7).

7. Валидация и характеристика дуализированных НСК

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед дальнейшим проведением экспериментов in vitro или in vivo . рекомендуется дальнейшая валидация, чтобы убедиться, что конструкции с HA-меткой и люцифераза правильно выражены.

1. Вестерн-блоттинг для валидации выражения конструкции с тегом HA
   1. Культурные NSC (контроль GFP и BRAF с HA-тегами). V600E, в приведённом примере) в колбах T-25 с ультранизкой степенью сцепления до готовности к разделению (согласно шагу 2.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед переходом к следующему этапу рекомендуется перепроверить культуры на наличие текущей экспрессии GFP (в контрольных клетках GFP) и экспрессии RFP (во всех клетках).
   2. Удалите половину культуры и разделите по шагам 2.2–2.7, затем переполните в свежую полную среду NSC с помощью бластицидина (1000 нг/мл) и пуромицина (100 нг/мл) для дальнейшего расширения культуры. Опустить оставшиеся нейросферы вниз при 630 × г при 4 °C, затем аспирировать супернатант.
   3. Затем дважды промывали гранулированные NSC с помощью ледяного PBS, вращаясь при 630 × г при 4 °C и аспирируя супернатант после каждой промывки. Добавьте примерно 200 мкл ледяного буфера лизиса RIPA с дополнением ингибиторов протеазы и фосфатазы в каждый образец.
   4. Дайте лизатам инкубировать на льду в течение 30 минут, обеспечивая периодические вихри каждые 10 минут. Центрифугуйте образцы при 14 000 × г в течение 15 минут при 4 °C. Аккуратно переложите супернатант, обозначенный как очищенный лизат, в свежую предварительно охлаждённую трубку. Лизаты храните при -80 °C в морозильнике.
   5. Лизат затем может использоваться для вестерн-блоттинга (для валидации выражения конструкций) согласно ранее установленным^{протоколам 38}.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если не использовать сразу, храните лизаты при -80 °C до использования. Избегайте повторных циклов замораживания и оттаивания для сохранения целостности образца (см. таблицу 1, пункт No 7).
2. Интенсивность биолюминесценции (BLI) для подтверждения соответствующей экспрессии люциферазы светлячков
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол проверяет экспрессию люциферазы с помощью BLI-мониторинга живых клеток с использованием специального аппаратного и программного обеспечения (см. Таблицу материалов для подробностей). Если использовать другую систему для обнаружения и количественной оценки BLI, методология может отличаться.
   1. Разделить НСК и измерить в соответствии с шагами 2.2–2.8 выше, затем разбавить клетки в полной среде NSC и пластине в различных концентрациях (например, 2,5 x^{10 4} ячейки, 1 x 10⁵ клеток/скважину) в пластине с 24 лунками с ультранизкой адхерентностью (500 мл/скважину), при этом каждая концентрация ячейки пластинируется в четырёхкратном виде. Клетки содержатся в полной среде NSC, содержащей бластицидин (1000 нг/мл) и пуромицин (100 нг/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить проникновение люминесценционной интенсивности одной скважины в соседние колодцы во время измерения, избегайте нанесения НСК в соседние скважины.
   2. Включите систему изображения не менее чем за 30 минут до этого, чтобы камера устройства с зарядом охладилась до оптимальной рабочей температуры (примерно -90 °C). Запустите программное обеспечение для количественной оценки и продезинфекцируйте камеру с помощью 70% этанола, давая ей полностью высохнуть перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте температуру камеры визуализации на уровне 37 °C, чтобы обеспечить жизнеспособность клетки во время длительных сеансов визуализации.
   3. Разморозьте стандартные аликвоты D-люциферина, чтобы они были защищены от воздействия света. Аккуратно добавьте объём 5 мкл рабочего раствора D-люциферина 15 мг/мл в каждую ячейку, содержащую яму, чтобы получить итоговую концентрацию 150 мг/мл. Слегка покрутите пластину, чтобы раствор равномерно распределялся.
   4. Инкубировать пластину при 37 °C в течение 10 минут, чтобы облегчить диффузию субстрата в клетки, тем самым способствуя максимальному образованию света.
   5. Разместить пластину внутри чувствительной системы биолюминесценции. Поставьте сетку на тарелку. Выберите режим люминесценции , начиная с автоэкспозиции на время экспозиции. Установите биннинг на средний и отрегулируйте диафрагму на 1 для оптимизации сбора света.
      1. Установить поле зрения на 'D' для пластин с 24 лунками и зафиксировать высоту объекта на 1,5 см. Получайте изображения с помощью программного обеспечения для визуализации. Если сигнал низкий, время экспозиции можно регулировать вручную (см. Таблицу устранения неполадок, пункт No8).
   6. Выполните коррекцию фона на контрольных скважинах и количественно определите относительные единицы света по мере необходимости для последующего анализа с помощью программного обеспечения для визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После валидации BLI клетки могут быть ортотопически пересадены в мозг сингенных или иммунокомпрометированных мышей в соответствии с ранее установленными^{протоколами 19}.

Результаты

Взрослые НСК были выделены из коры взрослых мышей C57BL/6 и выращены в неадгезентной^{культуре 39}, что привело к формированию первичных нейросфер (20–250 мкм) в течение 7–10 дней (см. рисунок 1). Клетки затем расширялись in vitro. Оптимизация отбора бластицидина затем проводилась в нетрансдукированных НСК (шаг 3). После 24 часов отбора концентрации бластицидина на уровне 1000 нг/мл (1 мкг/мл) и выше приводили к уменьше...

Обсуждение

Этот двухэтапный метод трансдукции лентивируса успешно создал генетически модифицированные НСК, подходящие для онкологических исследований. Здесь была показана эффективная интеграция онкогенной мутации BRAF V600E (обнаруженной в подгруппе взрослых высокостепенных глиом и используемой здесь как доказательство концепции) или контроля GFP с двойными репортерными системами для биолюминесцентной визуализации (люциферазы) и флуоресцентной микроскопии (RFP). Последовательная трансдукци...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
β-меркаптоэтанол (BME)	Sigma	M3148-25ML	Использовать внутри биологического шкафа безопасности. Приготовить запасы в 50 мМ, добавив 35 мЛ BME в 10 мЛ DMEM с низким содержанием глюкозы, профильтровать стерильно и разлить порциями по 500 мЛ для использования в приготовлении среды
Анти-мышиное IgG, связанное с HRP антитело	Cell Signal Technology	7076	Используется с разбавлением 1:2000 в 1 % нежирном молочном белке
Добавка B-27 (50X)	Gibco	17504-044	При первом использовании разморозить и разлить порциями по 1 мЛ для будущего использования; хранить порции при -20 °C. Хранить добавки на льду после разморозки до готовности добавить в среду
Бластицидин S HCl (10 мг/мЛ)	Gibco	A1113903	Приготовить порции запаса 10 мг/мЛ; поместить в небольшие пробирки по 200 мЛ и хранить при -20 °C до использования.
Белок сыворотки быка (BSA)	Millipore-Sigma	A1470-10G	Используется как 10% вес/объем BSA в 1x PBS. BSA липкий; обязательно взвесить его правильно и добавить соответствующий объем растворителя, чтобы приготовить точный раствор.
Ситечко для клеток (40 мкм)	Midsci	40ICS	Предварительно стерилизовано и упакованное в отдельные упаковки. Должно быть открыто внутри биологического шкафа безопасности. Не касаться голыми руками
D-Люциферин, калиевая соль	Gold Biotechnology	eLUCK-100	Приготовить рабочий раствор в концентрации 15 мг/мЛ (разбавить в воде молекулярного града) и профильтровать стерильно перед использованием. Каждый раз приготовить новый запас и добавить напрямую в среду, чтобы достичь конечной рабочей концентрации 150 мг/мЛ (например, 5 мЛ рабочего раствора на 500 мЛ культуры)
DMEM, с низким содержанием глюкозы	Gibco	11885-084	Используется для приготовления базовой среды NSC
Фактор роста эпидермиса (EGF)	Corning	354001	Поставляется в виде стерильного лиофилизованного порошка; для приготовления 1000X запаса добавьте 4,95 мЛ PBS и 50 мкЛ 10% BSA (в 1x PBS) к 100 мкг лиофилизованного порошка EGF и перемешайте. Приготовить порции по 500 мкЛ или меньше в небольших пробирках и хранить при -20 °C до использования для полной среды NSC и добавки для кормления NSC. Избегайте многократного замораживания и размораживания.
Фибробластный фактор роста, базовый (FGF)	R&D systems	233-FB	Поставляется в виде стерильного лиофилизованного порошка; для приготовления 1000X запаса добавьте 1,24 мЛ PBS и 12,5 мкЛ 10% BSA (в 1x PBS) к 25 мкг лиофилизованного порошка FGF и перемешайте. Приготовить порции по 500 мкЛ или меньше в небольших пробирках и хранить при -20 °C до использования для полной среды NSC и добавки для кормления NSC. Избегайте многократного замораживания и размораживания.
Глюкоза, 45%	Corning	25-037-CI	Поставляется в виде стерильного раствора. Не открывать за пределами биологического шкафа безопасности
HA-тег (C29F4) кролики mAb	Cell Signal Technology	3724	Используется с разбавлением 1: 1000 в 3 % сыворотки быка (Western blotting, для проверки экспрессии HA-тега)
HBSS, 10x	Gibco	14185-052	Поставляется в виде стерильного раствора. Не открывать за пределами биологического шкафа безопасности
HEPES, 1 М	Corning	25-060-CI	Поставляется в виде стерильного раствора. Не открывать за пределами биологического шкафа безопасности
IVIS 50	PerkinElmer		Прибор следует включить за 30 мин до использования, чтобы камера охладилась до оптимальной температуры. Для количественного анализа используется программное обеспечение Living Image (версия 4.3.1).
Лентовирус-люцифераза (светлячок)-2A-RFP	AMSBio	LVP324-PBS	LVP следует разлить порциями и хранить в холодильнике при -80 °C
L-глютамин, 200 мМ	Corning	25-005-CI	Поставляется в виде стерильного раствора. Не открывать за пределами биологического шкафа безопасности
Вода молекулярного града	Corning	46-000-CM	Поставляется в виде стерильного раствора. Не открывать за пределами биологического шкафа безопасности
Добавка N-2 (100x)	Gibco	17502-048	При первом использовании разморозить и разлить порциями по 1 мЛ для будущего использования; хранить порции при -20 °C. Хранить добавки на льду после разморозки до готовности добавить в среду
Нестин (E5C7I) кролики mAb	Cell Signal Technology	89529	Используется с разбавлением 1: 1000 в 3 % сыворотки быка (Western blotting, для проверки экспрессии маркера NSC)