Выявление потенциальных кандидатов в противотуберкулёзные препараты: пошаговое руководство по синтезу, определению MIC и оценке цитотоксичности в клетках млекопитающих

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для выявления потенциальных кандидатов в противотуберкулёзные препараты с помощью фенотипического скрининга, включающий химический синтез соединения 4-аминохинолина, определение его минимальной концентрации ингибитора против Mycobacterium tuberculosis и оценку его цитотоксичности в клеточных линиях млекопитающих.

Аннотация

Туберкулёз (ТБ) остаётся одной из ведущих причин смерти от одного инфекционного агента во всём мире, при этом рост уровня лекарственной резистентности делает разработку новых терапевтических препаратов глобальным приоритетом в области здравоохранения. Этот протокол описывает фенотипический скрининговый подход для выявления потенциальных кандидатов в противотуберкулёзные препараты через три интегрированных этапа. Во-первых, соединение из класса 4-аминохинолинов синтезируется трёхступенчатым методом и полностью характеризуется высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), ядерно-магнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопией и высокоразрешающей масс-спектрометрией (HRMS). Во-вторых, антимикробная активность соединения оценивается по Mycobacterium tuberculosis с помощью колориметрического резазурин-редукционного микропластинчатого анализа (REMA), который определяет минимальную концентрацию тормозов (MIC) с помощью простого визуального показания изменения цвета. В-третьих, цитотоксичность соединения оценивается в двух линиях клеток млекопитающих — Веро (почка африканской зелёной обезьяны) и HepG2 (гепатоцеллюлярный карцинома человека) с использованием анализа MTT (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромид) и нейтрального анализа на красное поглощение (NRU). Эти два дополнительных анализа измеряют различные клеточные параметры, позволяя перекрестно валидировать результаты цитотоксичности. Вместе данные MIC и цитотоксичности позволяют рассчитывать индекс селективности (SI) для оценки терапевтического потенциала каждого соединения. Этот протокол обеспечивает воспроизводимую пошаговую структуру для ранней стадии выявления противотуберкулёзных болезней и доклинической оценки.

Введение

Туберкулёз (ТБ), вызванный преимущественно бациллой Mycobacterium tuberculosis (Mtb), является инфекционным респираторным заболеванием у человека, которое в первую очередь поражает лёгкие, хотя могут встречаться и внелегочные варианты. ТБ распространяется через воздушно-капельные бациллы, выделяемые людьми с активным^{заболеванием 1}. В зависимости от прогрессирования заболевания человек с туберкулёзом может сразу же развить активный туберкулёз. Однако обычно у недавно инфицированного человека развивается латентный туберкулёз, при котором Mtb-клетки с низкой метаболической активностью выживают внутри гранулом ^1,2. Человек с латентным туберкулёзом может со временем развить активную форму болезни, проявив клинические^{симптомы 3}. В настоящее время оценивается, что четверть населения мира страдает латентной туберкулёзной^{инфекцией 4}.

Несмотря на многочисленные достижения, туберкулёз остаётся серьёзной проблемой общественного здравоохранения во всём мире. Данные из последнего Глобального доклада по туберкулёзу показывают, что в 2024 году заболевание заболели 10,7 миллиона человек. В том же году во всем мире было зарегистрировано 1,23 миллиона смертей от туберкулёза, что делает туберкулёз ведущей причиной смерти от одного инфекционного^{агента 5}. Помимо патологии и сложной биологии Mtb, социально-экономические аспекты, такие как бедность и недоедание, а также связанные со здоровьем факторы, такие как курение, диабет и коинфекция ВИЧ, делают контроль заболеваний ещё более^{сложным 5}. Это способствует долгосрочной устойчивости туберкулёза как глобальной проблемы здравоохранения.

Кроме того, современные методы лечения туберкулёза имеют ограничения, которые усложняют борьбу с этим заболеванием. Против восприимчивых штаммов Mtb стандартное лечение включает комбинированную терапию 4 препаратов: изониазид (INH), рифампицин (RIF), этамбутол (EMB) и пиразинамид (PZA). Эти антибиотики вводятся минимум в течение 6 месяцев, требуя строгого соблюдения на протяжении всего лечения. Этот терапевтический режим, несмотря на эффективность в большинстве случаев и около 85%, всё ещё сталкивается со многими^{трудностями 5,6}. Среди самых серьёзных проблем — побочные эффекты и длительное действие, которые часто приводят к преждевременному прерыванию у пациента. Это прекращение приёма антибиотиков вместе с неправильным назначением способствует выбору устойчивых штаммов Mtb, которые требуют более токсичных, дорогостоящих и обширных терапевтических^{схем 7,8}.

Учитывая этот сценарий, разработка новых мощных противотуберкулёзных препаратов является срочной. Этот протокол описывает ранние этапы исследования новых кандидатов на лекарства с использованием фенотипического скрининга. Для иллюстрации применения этого протокола мы выбрали 4-аминохинолиновое соединение, полученное из LABIO-17, для оценки. LABIO-17 ранее был идентифицирован нашей исследовательской группой как ингибитор фермента энойл-ACP-редуктазы (InhA) в Mtb, который является той же молекулярной мишеню, что и изониазид (INH^)9,10. InhA участвует в биосинтезе миколовых кислот при M. tuberculosis и является жизненно важным для выживания бациллы, что подчёркивает его значимость как перспективной молекулярной цели¹¹

Протокол

1. Химический синтез и характеристика

ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез и характеристика химического соединения выполняются как описано^{выше 10}. Все этапы с 1.1 по 1.4 следует выполнять в хорошо проветриваемой вытяжной вытяжке с использованием нитриловых перчаток.

1. Подготовка реагентов
   1. Приготовление MeOH/CH₃CN (1:1) с 0,1% муравьиной кислотой
      1. Измерьте равные объёмы метанола (MeOH) и ацетонитрила (CH₃CN), чтобы подготовить смесь 1:1 (v/v) (HPLC).
      2. Смешайте растворители в чистой, сухой ёмкости (например, в объёмной колбе). Добавьте муравьиную кислоту для получения конечной концентрации 0,1% (v/v) (например, добавить 1 мл муравьиной кислоты к 1 л растворительной смеси).
      3. Тщательно перемешивайте, аккуратно перемешивая или перемешивая. Храните в плотно закрытом контейнере при комнатной температуре, защищённой от света.
   2. Приготовление 1% уксусной кислоты в ультрачистой воде
      1. Прополосните объёмную колбу водой Ultrapure и поставьте её на скамейку. Добавьте ~80% конечного объёма воды Ultrapure в колбу (то есть 80 мл для колбы на 100 мл; 800 мл для колбы на 1 л).
      2. Используя откалиброванную пипетку, добавьте ледниковую уксусную кислоту для получения 1% (v/v): для конечного объёма 100 мл → добавить 1,0 мл уксусной кислоты; для 1 л итогового объёма → добавить 10,0 мл уксусной кислоты.
      3. Тщательно перемешивайте, перемешивая или перемешивая. Долийте в колбу до финальной отметки ультрачистой водой и перемешайте.
      4. Дегазируйте раствор с помощью ультразвукового очистителя (частота баллона ~40 кГц), установленного в режим дегазации на 20 минут при окружающей температуре.
      5. Переложите в бутылку с маркировкой янтаря (этикетка: содержание, концентрация, сорт растворителя, дата, препарат). Храните плотно закрыто при комнатной температуре.
   3. Подготовка ацетонитрила: метанола (1:1, v/v), HPLC класса
      1. Измерять равные объёмы ацетонитрила и метанола: для 100 мл конечного объёма → 50,0 мл ацетонитрила + 50,0 мл метанола; для 1 л итогового объёма → 500 мл ацетонитрила + 500 мл метанола.
      2. Смешайте растворители в чистой объёмной колбе или бутылке и перемешивайте, перемешивая или перемешивая. Фильтруйте смесь через фильтр 0,45 мкм в чистый контейнер для удаления частиц.
      3. Дегазируйте раствор с помощью ультразвукового очистителя (частота баллона ~40 кГц), установленного в режим дегазации на 20 минут при окружающей температуре.
      4. Переложите в бутылку с маркировкой янтаря (этикетка: состав, сорт растворителя, дата, препарат). Храните плотно закрыто при комнатной температуре, вдали от тепла и света.
   4. Подготовка раствора гексана/этилацетата 7:3 (v/v) для колонной хроматографии
      1. Измерьте 70% итогового объёма в гексане. Пример: для итогового объёма 100 мл → 70 мл гексана.
      2. Измерьте 30% итогового объёма в этилацетате. Пример: для итогового объёма 100 мл → 30 мл этилацетата.
      3. Смешайте оба растворителя в чистой, сухой ёмкости (например, в объёмной колбе или бутылке).
      4. Тщательно перемешивайте, перемешивая или перемешивая до однородности. Маркируйте контейнер составом, датой, сортом растворителя и препаратом.
   5. Подготовка раствора гексана/этилацетата 1:1 (v/v) для колонной хроматографии
      1. Измерьте 50% итогового объёма в гексане. Пример: для итогового объёма 100 мл → 50 мл гексана.
      2. Измерьте 50% итогового объёма в этилацетате. Пример: для итогового объёма 100 мл → 50 мл этилацетата.
      3. Смешайте оба растворителя в чистой, сухой ёмкости (например, в объёмной колбе или бутылке). Тщательно перемешивайте, перемешивая или перемешивая до однородности.
      4. Маркируйте контейнер составом, датой, сортом растворителя и препаратом.
   6. Подготовка насыщенного раствора бикарбоната натрия (NaHCO₃)
      1. Взвесьте избыточное количество бикарбоната натрия (NaHCO₃) (примерно 15–20 г на каждые 100 мл воды).
      2. Добавьте бикарбонат натрия в чистый стакан с известным объёмом дистиллированной воды (например, 100 мл). Мешайте смесь непрерывно при комнатной температуре (20–25 °C) с помощью магнитного мешалка или стеклянного стержня.
      3. Продолжайте помешивать, пока твердое не растворится больше и на дне не останется небольшое количество нерастворённого бикарбоната натрия — это указывает на насыщение раствора.
      4. Дайте подвеске отдохнуть 10–15 минут, чтобы нерастворённое тело осело. Фильтруйте смесь через бумажный фильтр или стеклянную воронку, чтобы удалить лишний нерастворённый бикарбонат.
      5. Соберите прозрачный фильтрат, который является насыщенным раствором бикарбоната натрия.
      6. Храните раствор в плотно закрытой бутылке, правильно маркированной с названием соединения, концентрацией (насыщенной), датой приготовления и вашими инициалы.
      7. Держите раствор при комнатной температуре и готовьте свежим по мере необходимости, так как_CO2 может постепенно выходить и со временем менять концентрацию.
2. Синтез 6-бромо-2-метилхинолина-4-ол (3)
   1. Приготовьте раствор, содержащий 4-бромоанилина (1,2 г, 7,3 ммоль) и безводный сульфат магния (1,08 г, 9,0 ммоль) в этаноле (15 мл).
   2. Добавьте в раствор ледниковую уксусную кислоту (0,33 мл) и этилацетоацетат (1,8 мл, 14,1 ммоль). Перемешивать реакционную смесь при 90 °C в течение 16 часов.
   3. Фильтруйте реакционную смесь через целлюлозу с удержанием 11 мкм, качественную фильтрационную бумагу для удаления взвешенного сульфата магния.
   4. Испарите этанол с помощью ротационного испарителя для получения акрилатного промежуточного продукта.
   5. Промежуточную жидкость нагревайте соответствующую масляную ванну с высокоэффективным синтетическим теплопереносным раствором (см. Таблицу материалов) (15 мл) при температуре 230–250 °C в течение 15 минут для завершения реакции.
   6. Охладите смесь до комнатной температуры. Отфильтруйте образовавшийся осад и промыйте его гексаном и хлороформом.
   7. Концентрируйте конечный продукт под пониженным давлением с помощью ротационного испарителя, пока не будут удалены все остаточные растворители (см. Таблицу материалов).
3. Синтез 6-бром-4-хлор-2-метилхинолина (4)
   1. Приготовьте раствор 6-бром-2-метилхинолина-4-ол (0,65 г, 2,8 ммоль) в толуоле (10 мл). Добавьте в раствор оксихлорид фосфора (V) (0,65 мл, 6,9 ммоль).
   2. Перемешивать реакционную смесь при 110 °C в течение 2 часов. Избыток оксихлорида фосфора (V) удалите с помощью ротационного испарителя.
   3. Охладите остатки в ледяной ванне. Нейтрализуйте реакционную смесь насыщенным раствором бикарбоната натрия.
   4. Извлекайте продукт этилацетатом (3 x 50 мл). Соедините органические фазы и высушите их на безводном сульфате натрия.
   5. Испарите растворитель с помощью ротационного испарителя для получения твёрдого остатка. Сушите полученное твердое тело с помощью ротационного испарителя, чтобы позволить себе получить сырый продукт.
   6. Очищайте соединение с помощью флэш-хроматографии на силикагеле (35–70 сетки) с использованием гексана:этилацетата (7:3) в качестве элуэнта.
4. Синтез 6-бромо-2-метил-N-(4-(пиперидин-1-ил)фенил)хинолина-4-амина (6)
   1. Приготовьте реакционную смесь, содержащую 6-бромо-4-хлоро-2-метилхинолин (0,53 г, 2 ммоль), 4-(пиперидин-1-ил)анилин (0,57 г, 3 ммоль), пиридин (0,24 мл) и HCl 37% (0,2 мл) в изопропаноле (20 мл).
   2. Перемешивать реакционную смесь при 85 °C в течение 16 часов. Удалите растворитель с помощью ротационного испарителя.
   3. Обрабатывайте остатки насыщенным раствором бикарбоната натрия.
   4. Профильтруйте полученное твердое тело через целлюлозную качественную фильтрационную бумагу с удержанием 11 мкм и растворите её в хлороформе (50 мл).
   5. Промой хлороформный раствор водой (3 x 15 мл). Высушить органическую фазу поверх безводного сульфата натрия.
   6. Испарите растворитель с помощью роторного испарителя, чтобы получить зелёное твердое существо. Очищайте продукт последовательно горячим гексаном (4 x 10 мл).
   7. Окончательное очищение с помощью флэш-хроматографии на силикагеле (35–70 сетки) с использованием гексана:этилацетата (1:1) в качестве элюэнта.
5. Тонкослойная хроматография (TLC)
   1. Отслеживайте ход реакции с помощью тонкослойной хроматографии (TLC) на пластинах TLC Silica gel 60 F254.
   2. Используйте исходный материал 4 как ориентир для мониторинга реакции и оценки её потребления.
6. Melting Point (m.p.)
   1. Добавьте наконечник шпателя соединения к аппарату для температуры плавления. Запишите диапазон температуры плавления.
   2. Не применяйте никаких коррекций к измеряемым значениям. Проведите эксперимент в трёх экземплярах.
7. Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC)
   1. Весите 1–2 мг соединения 6. Приготовьте стандартный раствор соединения с концентрацией 1,0 мг/мл в ацетонитриле/метаноле (1:1, v/v).
   2. Разведите стандартный раствор до 0,5 мг/мл для анализа. Анализируйте образцы с помощью системы HPLC (см. таблицу материалов), оснащённой двойным насосом, автоматическим инжектором и УФ-детектором.
   3. Сбор и обработка данных с помощью программного обеспечения для сбора хроматографических данных (см. таблицу материалов).
   4. Установите хроматографические условия следующим образом: используйте колонку обратной фазы C18, 5 мкм (250 x 4,6 мм) (см. таблицу материалов). Установите расход на 1,5 мл/мин и отслеживайте обнаружение ультрафиолета на 254 нм. Поддерживайте подвижную фазу при 100% воде (0,1% уксусной кислоты) с 0 до 7 минут; применить линейный градиент от 100% воды (0,1% уксусной кислоты) до 90% ацетонитрила/метанола (1:1, V/V) с 7 по 15 минут; Вернитесь к 100% воды (0,1% уксусной кислоты) в течение 5 минут и задержите ещё 10 минут.
8. Ядерный магнитный резонанс (¹H, ¹³C)
   1. Взвесьте 15–20 мг соединения 6 в ЯМР-трубке. Добавьте_{DMSO-d 6} в качестве растворителя.
   2. ^{Получить 1 H и}13C ЯМР-спектры на ЯМР-спектрометре (см. таблицу материалов) с использованием стандартных импульсных последовательностей.
   3. Управляйте прибором на частоте 400 МГц для ¹ядра H и 100 МГц для ¹³ядер C. Используйте тетраметилсилан (TMS) в качестве внутреннего источника.
   4. Экспрессируйте химические сдвиги (δ) в частях на миллион (ppm). Используйте файл FID, полученный в ходе эксперимента, чтобы визуализировать и обработать данные ЯМР.
9. Высокоразрешающая масс-спектрометрия (HRMS)
   1. Весите 1–2 мг соединения 6. Подготовьте образец в смеси 1:1 MeOH/_{CH 3}CN, содержащей 0,1% муравьиной кислоты.
   2. Проведите анализ на высокоразрешающем масс-спектрометре Orbitrap (см. таблицу материалов), который сочетает линейный масс-спектрометр с ионными ловушками и масс-анализатором Orbitrap.
   3. Вводите образец прямой инфузией при расходе 10 мкл/мин в положительном ионном режиме с помощью электрораспылительной ионизации (ESI).
   4. Определите элементный состав с помощью инструмента элементного состава в программном обеспечении для анализа данных масс-спектрометрии (см. таблицу материалов).
10. Колонная хроматография – состав 4
    1. Подготовьте колонку силикагеля с использованием силикагеля 60 Å (70–230 mesh, 0,063–0,200 мм). Плотно наполните колонку силикагелем.
    2. Используйте гексан/этилацетат (7:3, v/v) в качестве подвижной фазы. Загрузите грубую смесь 4 на колонну. Элюируйте соединение и собирайте дроби.
    3. Контролируйте дроби с помощью TLC и комбинируйте те, содержащие чистый продукт.
11. Колонная хроматография – соединение 6
    1. Подготовьте колонку силикагеля с использованием силикагеля 60 Å (70–230 mesh, 0,063–0,200 мм). Плотно наполните колонку силикагелем.
    2. Используйте гексан/этилацетат (1:1, v/v) в качестве подвижной фазы. Загрузите грубый состав 6 на колонну. Элюируйте соединение и собирайте дроби.
    3. Контролируйте дроби с помощью TLC и комбинируйте те, содержащие чистый продукт.

Рисунок 1. Реагенты и условия: i = MgSO₄, AcOH, EtOH, 90 °C, 16 ч; ii = C₁₂H₁₀, C_{12H 10}O, 230-250 °C, 15 мин; iii =_{POCl 3}, толуол, 110 °C, 2 ч; iv = Пиридин, HCl, (CH₃)₂CHOH, 85 °C, 16 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

2. Определение минимальной концентрации тормозов

1. Экспериментальная конструкция и компоновка пластин
   1. Оценить способность соединений подавлять рост M. tuberculosis с помощью колориметрического редукционного микропластинчатого анализа (REMA) для определения минимальной ингибиторной концентрации (MIC), как описано^{выше 11,12,13}.
   2. Проведите три независимых эксперимента (три биологических реплики) для каждого соединения, протестированного без технических репликаций (одна строка на соединение и одна пластина на эксперимент).
   3. Оценивайте соединения, действующие как положительные контроли, вместе с тестовыми соединениями, чтобы убедиться, что условия анализа позволяют подавлять рост.
   4. Анализы Изониазида (INH) и рифампицина (RIF) в качестве положительных контролей.
   5. Назначьте строки A и B для контрольных соединений (INH и RIF соответственно).
   6. Присвоите следующие строки для тестовых соединений (соединения от A до F на рисунке 2).
   7. Подготовьте столбцы с 1 по 10 с двукратным последовательным разбавлением контрольных и тестовых соединений, каждое соединение занимает одну строку, при этом более высокая концентрация — в столбце 10, а низкая — в столбце 1.
   8. Подготовьте столбец 11 как средство контроля жизнеспособности, содержащее растительную среду и бактерии при конечной концентрации DMSO 2,5%, без добавления контроля или тестового соединения.
   9. Подготовьте столбец 12 как метод контроля стерильности, добавив контрольные или тестовые соединения с более высокой концентрацией последовательного разбавления (аналогично столбцу 10) в среду роста без бактериальных клеток.
   10. См. рисунок 2 для репрезентативной схемы пластины MIC.
2. Подготовка реагентов
   1. Приготовление бульона Middlebrook 7H9 с добавлением олеиновой кислоты, альбумина, декстрозы и каталазы (OADC).
      1. В стеклянную бутылку объёмом 200 мл с 90 мл сверхчистой воды добавьте 0,47 г порошка 7H9, 0,24 мл 85% глицерина и 0,5 мл 10% Tween-80.
      2. Автоклав в среде на 10 минут при 121 °C и 98,07 кПа.
      3. Дайте среде остыть, пока оно не станет тёплым на ощупь (примерно 45–50 °C).
      4. Добавьте 10 мл OADC (мы используем коммерчески доступный OADC; см. таблицу материалов для подробностей).
      5. Храните при 4 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте соответствующее количество для эксперимента, учитывая пропорции реагентов.
   2. Приготовление бульона Middlebrook 7H9 с ADC
      1. В стеклянную бутылку объёмом 200 мл с 90 мл ультрачистой воды добавьте 0,47 г порошка 7H9. Автоклав в среде на 10 минут при 121 °C и 98,07 кПа.
      2. Дайте среде остыть, пока оно не станет тёплым на ощупь (примерно 45–50 °C). Добавьте 10 мл АЦП. Храните при 4 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте соответствующее количество для эксперимента, сохраняя пропорции реактивов.
   3. Приготовление растворов составного бульона
      1. Приготовьте стандартный раствор каждого соединения в 2 мг/мл, растворённый в ДМСО.
      2. Храните при -20 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Перед экспериментом максимальная концентрация теста определяется на основе оценки растворимости. Для определения предела растворимости визуально осмотрите растворы на наличие кристаллов. Если наблюдаются кристаллы, дополнительно разведите аликвот до половины предыдущей концентрации. Проведите эту оценку с использованием 5% DMSO.
   4. Подготовка составных рабочих растворов
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочие растворы должны быть свежеприготовлены на момент эксперимента, разбавляя бульоны в бульоне 7H9 с добавлением 10% АЦП. Итоговая концентрация DMSO в рабочем растворе должна составлять 5%, а концентрация соединения — вдвое превышающей максимальную запланированную концентрацию для теста. Примечательно, что конечная концентрация DMSO, которой подвергаются бактерии во время анализа, составляет 2,5%, так как объём удваивается после добавления бактериальной суспензии (см. раздел 2.3, шаг 2.3.8).
      ПРИМЕЧАНИЕ: DMSO 2,5% переносится бактериальными штаммами, используемыми в нашей лаборатории (M. tuberculosis H37Ra, H37Rv и клинические изоляты). Если вы работаете с другими штаммами или другими бактериальными видами, проведите предварительный MIC эксперимент с использованием DMSO в качестве тестового соединения, чтобы определить высокие концентрации DMSO, которые можно использовать без стимулирования ингибирования роста.
   5. Приготовление раствора ресазурина
      1. Приготовьте раствор ресазурина с 0,01%, растворив 1 мг ресазурина в 10 мл ультрачистой воды.
      2. Стерилизуйте раствор с помощью фильтра 0,22 мкм.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрующий ресазурин можно хранить при 4 °C в^{течение} 14-й недели. Однако этот раствор нужно подготовить непосредственно перед использованием, как стандартную практику.
3. Подготовка микобактерий
   1. Инокулировать одну колонию M. tuberculosis в центрифугную трубку объемом 50 мл с 10 мл бульона 7H9, дополненного 10% OADC, 0,2% глицерина и 0,05% Tween-80.
   2. Инкубировать с постоянным встряхиванием (100 об/мин) при 37 °C, пока культура не достигнет оптической плотности при 600 нм (_{OD 600}) от 0,6 до 0,8 (примерно 3–4 недели).
      ВНИМАНИЕ: M. tuberculosis H37Rv классифицируется как патоген группы риска 3, способный передаваться воздушно-капельно и вызывать потенциально смертельное заболевание у человека. Проводите все манипуляции в сертифицированном шкафу биобезопасности в лаборатории уровня биобезопасности 3 (BSL-3), используя соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
   3. Гомогенизируйте бактериальную культуру, вихря стерильными стеклянными шариками (1 мм) в течение 3 минут.
   4. Дайте суспензии отдохнуть 15 минут, чтобы оседать комки.
   5. Измерьте_{OD 600} супернатанта и храните аликвоты при −80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов разведите бактериальную суспензию до теоретического_{OD 600} 0,006 в свежем бульоне 7H9 с добавлением 10% ADC. Во время анализа раздайте 100 мкл на одну скважину в пластины с 96 лунками.
4. Подготовка пластин с 96 скважинами
   1. Добавьте 100 мкл бульона 7H9 с добавлением 10% ADC в столбец 12.
   2. Добавьте 100 мкл бульона 7H9 с добавлением 10% АДЦ (содержащего 5% ДМСО) в колонки с 11 и 9 по 1.
   3. Добавьте 200 мкл соединенного раствора (приготовленного в вдвое выше максимальной тестовой концентрации) в столбец 10 (присвоите одну строку на каждую смесь).
   4. Добавьте 100 мкл соединенного раствора в столбец 12. Проведите двойное последовательное разбавление: перенесите 100 мкл из колонки 10 в колонку 9 и хорошо перемешайте с помощью пипетирования.
   5. Продолжайте последовательное разбавление от колонки 9 до колонки 1. Сбросьте последние 100 мкл из столбца 1.
   6. Добавьте 100 мкл бактериальной суспензии (теоретический_{OD 600} от 0,006) в столбцы с 11 по 1.
   7. Накройте пластину, запечатайте парапленкой и инкубуйте при 37 °C в течение 7 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 2 — это представительная схема пластины MIC. Обратитесь к этой рисунку для интерпретации шагов 2.3.1 по 2.3.9.
5. Добавление ресазурина и анализа данных
   1. Добавьте 60 мкл раствора резазурина 0,01% в каждую лунку пластины. Накройте пластину, запечатайте парапленкой и инкубуйте при 37 °C в течение 48 часов.
   2. Наблюдайте изменение цвета с синего (подавление роста) на розовый (рост бактерий).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых экспериментах неполное изменение цвета приводит к фиолетовой яме. Интерпретуйте это как рост бактерий.

Рисунок 2. Схематическое представление микроразбавляющей пластины бульона, используемой для определения минимальной ингибиторной концентрации (MIC). Двойное серийное разбавление протестированных соединений распределялось по столбцам 1–10, последующие разбавления выполнялись последовательно от столбца 10 до столбца 1, при этом наибольшая концентрация соединений была в столбце 10. Строки A и B соответствуют положительным контролям, содержащим референсные препараты изониазид и рифампицин соответственно. Строки C–H соответствуют исследуемым соединениям. Столбец 11 обозначает контроль жизнеспособности (среда, содержащая 2,5% ДМСО и бактериальный инокулум), тогда как столбец 12 соответствует контролю стерильности (среда, содержащая соединения при отсутствии бактериального инокулума). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Оценка цитотоксичности в клеточных линиях млекопитающих

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все манипуляции с культурой клеток в стерильных условиях в сертифицированном шкафу биологической безопасности класса II.

1. Подготовка клеточных линий млекопитающих
   1. Культивировать клеточные линии человеческой печёночной карциномы (HepG2) и почек африканской зелёной обезьяны (Vero) в модифицированной орлиной среде (DMEM) от Dulbecco.
   2. Дополните среду 1,8 г/л бикарбоната натрия, 10% плодовой бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина/стрептомицина и 0,1% амфотерицина B (называемого полным медиумом).
   3. Инкубировать клеточные культуры при 37 °C в увлажнённой атмосфере с содержанием 5%_CO2.
   4. Забирайте субслияние клеток (70%–80%), обрабатывая их раствором трипсина-ЭДТА 0,25% в течение 5–10 минут.
   5. Нейтрализуйте трипсин, добавив равный объём полного материала. Перенесите подвеску ячейки в коническую трубку объёмом 15 мл и центрифугу при 200 x g на 5 минут.
   6. Сбросьте супернатант и снова суспензуйте клеточную гранулу в 10 мл свежей полной среды.
   7. Определите концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью автоматического счётчика клеток или гемоцитометра с исключением трипанового синего.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для исключения трипана синего смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл раствора трипана синего 0,4% и загрузите на гемоцитометр (или счётное стекло). Мёртвые или мембранные клетки выглядят синими, тогда как жизнеспособные клетки остаются неокрашенными. Вычислите жизнеспособность как % жизнеспособность = (неокрашенные клетки / общее количество ячеек) x 100. Приступайте к посеву только если жизнеспособность ≥ 90%.
   8. Разведите суспензию ячейки до целевой плотности посева. Посеять 100 мкл клеточной суспензии в каждую яму, столбцы 2–12 из 96-лунной плоско-нижней пластины.
      Плотность посева: 4 000 клеток на колодец для клеток Vero; 5 000 клеток на скважину для клеток гепатит-2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте эти плотности, чтобы клетки оставались в логарифмической фазе роста и не достигали 100% слияния до окончания 48 часов анализа.
   9. Заполните столбец 1 100 мкл полной среды (без ячеек), чтобы использовать его в качестве заготовки для измерений поглощения.
   10. Подготовьте четыре одинаковые пластины для каждой клеточной линии: две для MTT-анализа и две для NRU.
   11. Инкубировать пластины в течение 24 часов при 37 °C, 5%_CO2 для прикрепления клеток.
2. Разбавление соединений и обработка клеток
   1. Подготовьте стандартные растворы для каждого тестового соединения в фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco (DPBS) или в соответствующем растворителе (например, диметилсульфоксид; DMSO).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед анализом убедитесь, что соединение растворимо в клеточной культурной среде и что концентрация растворителя нетоксична (например, <0,1% v/v для DMSO).
   2. Спроектировать компоновку пластин с включением заготовок, соответствующих органов управления и технических реплиек. Репрезентативная схема для тестирования до 9 соединений в 8 концентрациях показана на рисунке 3.
   3. Подготовьте последовательное разбавление тестового соединения в полной среде для покрытия предполагаемого диапазона концентрации. Убедитесь, что объём для всех репликированных пластин подготовлен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании растворителя (например, DMSO) добавьте разбавительную среду так, чтобы конечная концентрация растворителя оставалась постоянной на протяжении всей серии последовательных разбавлений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скважины, обработанные растворителями (управление транспортными средствами), служат функциональным отрицательным контролем, определяя 100% жизнеспособность клеток, относительно которой скважины, обработанные соединениями, нормализуются. Для валидации анализов включите цитотоксическое эталонное соединение (например, 0,1% тритон X-100 или 1 мМ натрий додецилсульфат) в концентрации, известной как приводящая к полной гибели клеток (0% жизнеспособности). Значения поглощения в этих положительных контрольных скважинах не должны существенно отличаться от пустых скважин, что подтверждает жизнеспособность 0%.
   4. После 24-часового периода прикрепления клеток визуально осмотрите пластины под перевёрнутым микроскопом, чтобы убедиться, что клетки прикреплены, распространены и покрывают примерно 70–80% поверхности ямы с равномерным слиянием. Сбросьте пластины с изображением загрязнения или недостаточного крепления.
   5. Аккуратно аспирируйте посевную среду с помощью наконечника пипетки, наклоняя кончик к бокам каждой колодцы, чтобы не нарушать монослой клетки. Обрабатывайте пластины секциями, чтобы предотвратить высыхание.
   6. Немедленно добавьте 100 мкл соответствующего разбавления тестового соединения или контрольной среды в соответствующие скважины.
   7. Инкубировать обработанные пластины 48 часов при 37 °C, 5%_CO2.
3. MTT Assay Protocol
   1. Приготовьте раствор MTT с 0,5 мг/мл в безсывороточном DMEM. Фильтруйте через шприцовый фильтр 0,22 мкм и защитите от света.
   2. После 48-часового лечения визуально осмотрите клетки для подтверждения ожидаемых результатов.
   3. Аккуратно аспирируйте среду из MTT-пластин. Добавьте в каждую скважину 50 мкл рабочего раствора MTT с расходом 0,5 мг/мл.
   4. Инкубировать 3 часа при 37 °C, 5%_CO2, защищено от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя 2–4 часа — обычное явление, для клеток Vero и HepG2 обычно достаточно 3 часа. Оптимизируй, если нужно.
   5. Добавьте 100 мкл 100% DMSO в каждую скважину для растворения кристаллов формазана. Поставьте пластины на орбитальный шейкер со скоростью 100 об/мин на 15 минут, защищённые от света. Проверьте контрольные скважины, чтобы убедиться в полном растворении кристаллов. Считывайте поглощение при 570 нм с помощью считывателя микропластин. Если доступно, установите опорную длину волны 630–690 нм.
4. Протокол анализа нейтрального поглощения красного вещества (NRU)
   1. Приготовьте раствор Neutral Red (NR) с концентрацией 40 мкг/мл в безсывороточном DMEM и фильтре. Приготовьте раствор NR десорбции: 1% (v/v) ледниковой уксусной кислоты, 49% (v/v) этанола и 50% (v/v) ультрачистой воды.
      ВНИМАНИЕ: ледниковая уксусная кислота коррозийна; Ручка в вытяжке с дымом.
   2. После 48-часового лечения визуально осмотрите клетки. Аккуратно аспирируйте среду из пластин NRU.
   3. Добавьте 100 мкл из рабочего раствора 40 мкг/мл NR в каждую скважину. Инкубировать 2 часа при 37 °C, 5%_CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для максимального поглощения красителя в этих клеточных линиях достаточно двухчасовой инкубации.
   4. Аспирируйте рабочее решение для НР. Аккуратно промывайте каждую колоду по одному разу 150 мкл стерильного PBS.
   5. Добавьте 150 мкл раствора NR десорбции в каждую скважину. Поставьте на орбитальный шейкер при 150 об/мин на 15 минут для извлечения красителя.
   6. Проверьте контрольные скважины, чтобы убедиться в полном извлечении красителя. Считывайте поглощение при 540 нм с помощью считывателя микропластин.
5. Анализ данных
   1. Выполните фоновый вычитание, вычислив среднюю поглощённость пустых столбцов и вычитая это значение из всех колодц.
   2. Проведите проверку токсичности растворителя, сравнив скважины с контролем растворителя с необработанными контролями. Если жизнеспособность ниже определённого порога (например, 80%), рассмотрите цитотоксичность растворителя.
   3. Рассчитайте процентную жизнеспособность относительно скважин с контролем растворителя:
      % жизнеспособность = (поглощение обработанной скважины / среднее поглощение контроля растворителя) x 100.
   4. График % жизнеспособности (оси y) по логарифму₁₀ по концентрации соединения (ось x). Используйте нелинейную регрессионную модель (сигмоидальный дозовый ответ, переменный наклон) для определения CC₅₀.
   5. Вычислите индекс селективности (SI), деля CC₅₀ на MIC.

Рисунок 3. Пример конструкции пластин для анализа жизнеспособности клеток MTT/NRU — ранний скрининг для проверки цитотоксичности до 9 соединений. (A) Схема дизайна пластин. Столбец 1 назначен как «пустой», без ячеек и заполнен DPBS или полной средой. Колонки 2 и 12 засеяны клетками и обработаны полным материалом («необработанный контроль») или полным средом растворителем («контроль растворителя»). Столбцы с 3 по 11 засеяны клетками и обработаны серийными разбавлениями тестируемых соединений, до 9 соединений с одним репликатом на концентрацию. (B) Репрезентативные фотографии пластины Vero NRU (выше) и пластины Vero MTT (ниже) после 48-часовой обработки и финального анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Результаты

Синтез дал целевое соединение 6 в виде светло-зелёного твёрдого вещества (0,53 г, выход 67%). Соединение демонстрирует температуру плавления 227–229 °C и чистоту UHPLC 99% (t_R = 14,11 мин) (рисунок 4). Химическая структура была подтверждена с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и высокоразрешающей масс-спектрометрии (HRMS). Спектр ЯМР ¹H (рисунок 5) показывал сигналы, соответствующие пиперидиновой части в диапазоне от 1,50 до 3,13 ppm. Метиловая группа на позиции 2 выглядела как типичный синглет с коэффициентом 2,38 ppm. Водород в трёхпозиционной позиции проявился в виде синглета с коэффициентом 6,56 ppm. Фениловое кольцо показывало два дублета с частотой 6,97 и 7,17 ppm, с константой связи 8,9 Гц. Водороды в 7- и 8-позициях генерировали мультиплет с частотой 7,63–7,75 ppm, а водород в 5-й позиции ядра хинолина — дублет с частотой 8,59 ppm (J = 2,0 Гц). Амин-водород был зафиксирован в виде синглета с концентрацией 8,66 ppm. Спектр ЯМР ¹³C (рисунок 6) демонстрировал сигнал с частотой 23,81 ppm, приписываемый метильной группе в позиции 2, тогда как сигналы между 24,85 и 49,70 ppm соответствовали пиперидиновой части. Углерод на трёхпозиционной позиции достиг 100,52 ppm. Оставшиеся сигналы в нижнем поле связаны с ядром хинолина и углеродами фенилового кольца. HRMS подтвердил молекулярную формулу соединения 6, показывая ион [M+H]⁺ при m/z 396.1063 (расчёт для C_{21H 23BrN 3}: 396.1070).

Рисунок 4. Хроматограмма ВЭЖХ и ультрафиолетовые спектры соединения 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. ¹H ЯМР-спектр (400 МГц, DMSO-d6) соединения 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6. ¹³C ЯМР (101 МГц, DMSO-d6) спектров соединения 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Ингибиторная активность соединения против M. tuberculosis оценивалась путём определения MIC, который определяется как наименьшая концентрация соединения, полностью предотвращающего видимый рост бактерий. В тесте REMA отсутствие изменения цвета (остаётся синим) указывает на подавление роста, а сдвиг на розовый — на рост бактерий. Изониазид (INH) и рифампицин (RIF) служили средствами контроля за наркотиками. Результаты представлены на рисунке 7. Каждая пластина включала контроль роста (столбец 11, без лекарств) и контроль стерильности (столбец 12, без микобактерий). Соединения были последовательно разбавлены от колонки 10 (максимальная концентрация) до столбца 1 (самая низкая концентрация). Как показано на рисунке 7, значение MIC для соединения в строке A (изониазид) наблюдается в столбце 4, а значения MIC для соединений в строках B (рифампицин) и C (синтезированное соединение) — в столбце 5. В наших руках значения MIC для INH составляют 0,31 мкг/мл для деформации H37Rv и 0,16 мкг/мл для H37Ra, а для RIF получаем 0,08 мкг/мл для деформации H37Rv и 0,01 мкг/мл для деформации H37Ra.

Рисунок 7. Определение минимальной ингибирующей концентрации (MIC) в Mycobacterium tuberculosis с помощью резазуринового микропластинчатого анализа (REMA). Строки A–C, столбцы 1–10: Двойное серийное разбавление изониазида (строка A), рифампицина (ряд B) и синтезированного соединения (строка C). Столбец 11: Контроль жизнеспособности (среда содержит 2,5% DMSO + бактерии). Колонка 12: Контроль стерильности (средняя + составная). Синий цвет указывает на подавление роста бактерий, тогда как розовый — на жизнеспособность бактерий за счёт восстановления резазурина до резоруфин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Репрезентативная 96-колодцевая пластина для анализов NRU (Vero, верх) и MTT (Vero, снизу) показана на рисунке 3B. В MTT-пластине виден чёткий цветовой градиент, который меняется от полупрозрачных (без жизнеспособных клеток) при высоких концентрациях соединений к глубокого пурпурного (высокая жизнеспособность клеток) при низких концентрациях. Аналогично, пластина NRU демонстрирует градиент от полупрозрачного к насыщенно-розовому, что указывает на поглощение нейтрального красителя в лизосомы жизнеспособных клеток.

Микроскопия обеспечивает визуальное подтверждение состояния анализа после 48 часов инкубации (рисунок 8). Рисунок 8A сравнивает здоровые, необработанные контрольные клетки (Vero и HepG2) с клетками, обработанными цитотоксичной концентрацией соединения. Обработанные клетки выглядят округлыми, отстранёнными и нежизнеспособными. Рисунок 8B показывает критическую визуальную контрольную точку перед финальной стадой растворения. Он показывает ожидаемое образование тёмно-фиолетовых кристаллов формазана внутри жизнеспособных клеток (MTT-анализ) и накопление красного красителя в лизосомах (анализ NRU) в обоих типах клеток.

Исходные данные о поглощении нормализовались для управления автомобилем и анализировались с помощью нелинейной регрессии для создания кривых доза-отклик, как подробно описано в шаге протокола 3.5. Для целевого соединения 6 (полученного из LABIO-17) этот анализ дал CC₅₀ размером 12,2 мкм (Vero) и 18,3 мкм (HepG2) в анализе NRU, а также CC₅₀ >20 мкм для обеих клеточных линий в MTT-анализе. В результате индекс селективности (SI) варьировался от 30,5 до >50, как ранее^{сообщалось 10}.

Рисунок 8. Репрезентативные микроскопические изображения цитотоксичных тестов в клетках Vero и HepG2. Все изображения были сделаны с увеличением в 100 раз. (A) Сравнение морфологии клеток после 48 часов лечения. Необработанные контрольные колодцы для клеток Vero (верхняя) и HepG2 (нижняя) показывают здоровый, слияющийся монослой. В отличие от этого, клетки, обработанные цитотоксичной концентрацией соединения, выглядят округлыми, уменьшенными и отделёнными от поверхности пластины. (B) Критические зрительные контрольные точки после добавления реагента и до растворения. В анализе MTT (левые панели для каждой линии клеток) жизнеспособные клетки содержат видимые тёмно-фиолетовые кристаллы формазана. В анализе NRU (правые панели для каждой клеточной линии) жизнеспособные клетки демонстрируют накопление красного красителя внутри целостных лизосом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Фенотипический подход к скринингу, основанный на активности целых клеток, а не на изолированных ферментах, является эффективной стратегией для выявления активных соединений против M. tuberculosis. Здесь мы описали начальные этапы этого подхода, включающие химический синтез кандидатного соединения, оценку его ингибиторной активности с помощью определения минимальной ингибирирующей концентрации (MIC) и оценку его цитотоксичности в клетках млекопитающих (Vero и HepG2) с помощью анализов MTT и NRU.

Синтетический путь состоял из трёх основных этапов (рисунок 1), которые обеспечивают целевому соединению высокую чистоту с помощью оперативно простых преобразований. Были определены несколько критически важных этапов, определяющих воспроизводимость и эффективность. Начальная конденсация требует точного стехиометрического контроля и устойчивого рефлюкса для обеспечения полного промежуточного образования. Неполное удаление растворителя до термической циклизации может негативно сказаться на эффективности закрытия кольца. Сам этап циклизации требует строгого контроля температуры, так как недостаток нагрева приводит к неполной ароматизации, тогда как чрезмерный или продолжительный нагрев может способствовать образованию побочных продуктов. Во время хлорирования рекомендуется тщательный контроль температуры реакции и постепенное добавление фосфорилхлорида для минимизации побочных реакций и обеспечения селективной активации в 4-м положении. Во время оптимизации методов незначительные процедурные корректировки повышали устойчивость. В случаях неполного осадка после циклизации постепенное охлаждение, а не быстрое затухание, способствовало восстановлению твердого тела. Если на этапе нуклеофильного замещения наблюдалось снижение выхода, продление времени реакции или проверка чистоты аминов оказалось полезным.

Основные ограничения метода — необходимость циклизации при высоких температурах и коррозийных хлорирующих реагентов, таких как фосфорилхлорид, что требует специальной лабораторной инфраструктуры и безопасности. Заместительные электронные эффекты могут потребовать переоптимизации для различных анилинов или аминов, что ограничивает широкую диверсификацию строительных лесов без адаптации. Однако подход Конрада–Лимпаха операционно проще, чем синтезы типа Скраупа (жёсткие окислители) или протоколы, катализируемые переходными металлами (специализированные катализаторы/инертные атмосферы). Этот метод без металлов эффективно обеспечивает функционализированные промежуточные продукты хинолина для медицинской химии.

Протокол, используемый для определения MIC, представляет собой колориметрический анализ, основанный на визуальном осмотре. Потенциальной проблемой этого метода является неполное изменение цвета, в результате чего появляется фиолетовый колодец вместо ярко выраженного синего (ингибирование) или розового (рост). Если это происходит, это следует интерпретировать как неспособность подавлять рост микобактерий. Кроме того, поскольку соединение оценивается последовательно разбавлением, максимальная проверяемая концентрация определяется его растворимостью. В результате в некоторых случаях результат может быть неопределённым, если не наблюдается торможения при максимальной растворимой концентрации. Кроме того, важно признать, что другие лаборатории могут адаптировать определённые этапы протокола к своим конкретным условиям, что может привести к вариациям полученных результатов. Для повышения пропускной способности этот протокол можно адаптировать для автоматизации. Внедрение систем обработки жидкостей для подготовки пластин на 96 скважин снизит ошибки пипетирования, тем самым повысив точность и воспроизводимость.

Протокол оценки цитотоксичности использует две отдельные линии клеток млекопитающих (Vero и HepG2) и два дополнительных анализа жизнеспособности (MTT и NRU). Несколько этапов в этом протоколе критически важны для обеспечения воспроизводимости и точности данных, и каждая лаборатория должна проводить собственную валидацию. Например, исходная плотность засея клеток должна быть тщательно оптимизирована, так как чрезмерное слияние может привести к ингибированию контакта и изменению метаболического состояния, что запутает результаты, а недосеяние может сделать клетки более восприимчивыми к незначимым повреждениям, потенциально переоценив^{токсичность 15}. Кроме того, самая высокая тестируемая концентрация часто ограничена растворимостью соединений, а осаждение может привести к неточным результатам. Кроме того, рекомендуемая схема пластины (рисунок 3A) предназначена для первичного скрининга, максимизирующего количество тестируемых соединений за счёт отказа от технических репликаций и игнорирования эффектов краёв в пользу валидации с помощью независимых биологических репликаций.

Ключевой сильной стороной этого протокола является параллельная реализация как MTT, так и NRU-анализов. Хотя оба хорошо зарекомендованы, они измеряют разные клеточные параметры. MTT-анализ количественно оценивает метаболическую активность митохондриальных дегидрогеназ, что обычно коррелирует с жизнеспособностью клетки¹⁶. Однако этот анализ подвержен вмешательству соединений с восстанавливающими или окисляющими свойствами, либо те, что нарушают митохондриальное дыхание, что может привести к ложным^{результатам 15}. Параллельное проведение анализа NRU помогает устранить такие артефакты. Анализ NRU измеряет способность жизнеспособных клеток сохранять лизосомную целостность и градиенты pH, необходимые для поглощения^{красителя 17}. Расхождения между результатами MTT и NRU могут выявить специфические механизмы токсичности, такие как дисфункция митохондрий, что требует дальнейшего изучения.

В итоге этот протокол описывает фундаментальные шаги для выявления потенциальных кандидатов в противотуберкулёзные препараты. Соединения, демонстрирующие многообещающую селективность и потенцию, впоследствии могут быть перенесены в более сложные модели инфекций, такие как исследования in vivo .

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ЛИНИИ КЛЕТОК
HepG2 (человеческая карцинома гепатоцитов)	ATCC	HB-8065	Линии клеток рака печени человека
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	ATCC	25177
Mycobacterium tuberculosis H37Rv	ATCC	27294
Vero (почечные клетки африканской зеленой обезьяны)	ATCC	CCL-81	Эпителиальная линия клеток почек приматов
ХИМИКАТЫ – СИНТЕЗ
4-(Piperidin-1-yl)aniline	Sigma-Aldrich	TCI: P0887	Аминовый прекурсор для соединения 5/6
4-Бромоанилин	Sigma-Aldrich	108-67-8	Исходный материал для синтеза хинолина
Уксусная кислота (ледяная)	Sigma-Aldrich	695092	Реагент в синтезе и подготовке мобильной фазы
Ацетонитрил (HPLC-град)	Sigma-Aldrich	34967	Компонент мобильной фазы HPLC и растворитель для ЯМР
Хлороформ	Sigma-Aldrich	C2432	Растворитель для извлечения продукта
DMSO-d6 (дейтеренный)	Sigma-Aldrich	175641	Растворитель для ЯМР
Dowtherm A (термоноситель)	Sigma-Aldrich / Solutia	TBD	Высококипящий растворитель для термической циклогенезации (230–250 °C); ранее указывался как Dowtherm® A
Этанол (абсолютный)	Sigma-Aldrich	459836	Реагент для реакции шага Конрада-Лимпаха
Этилацетат (HPLC-град)	Sigma-Aldrich	270989	Компонент элюента колонки
Этил ацетоацетат	Sigma-Aldrich	E12806	β-кетоэфирный реагент для формирования кольца хинолинов
Муравьиная кислота (HPLC-град)	Sigma-Aldrich	F0507	0.1% добавка в мобильную фазу для HPLC и HRMS
Стеклянные шарики (1 мм, стерильные)	Sigma-Aldrich	G8772	Для гомогенизации культуры M. tuberculosis
HCl (хлористоводородная кислота, 37%)	Sigma-Aldrich	320331	Кислотный катализатор в нуклеофильном замещении
Гексан (HPLC-град)	Sigma-Aldrich	34859	Неполярный элюент для колоночной хроматографии
Изопропанол	Sigma-Aldrich	278475	Реагент для синтеза соединения 6
Сульфат магния (MgSO4, безводный)	Sigma-Aldrich	M7506	Сушильное средство и катализатор реакции
Метанол (HPLC-град)	Sigma-Aldrich	34860	Компонент мобильной фазы HPLC и растворитель для ЯМР
Фосфорилхлорид (POCl3)	Sigma-Aldrich	201170	Реагент для хлорирования промежуточного продукта 4
Пиридин	Sigma-Aldrich	270970	Основный катализатор в нуклеофильном замещении
Силикагель (35–70 меш) для флеш-хроматографии	Macherey-Nagel	815349	Стационарная фаза для шагов флеш-хроматографии
Силикагель 60 Å (70–230 меш) для колоночной хроматографии	Macherey-Nagel	815381	Стационарная фаза для колоночной хроматографии
Сульфат натрия (Na2SO4, безводный)	Sigma-Aldrich	239313	Сушильное средство для органической фазы
Тонкослойные пластинки из силикагеля 60 F254	Merck	1.05554	Мониторинг тонкослойной хроматографии
Толуол	Sigma-Aldrich	244511	Растворитель для шага хлорирования
Ультрачистая вода	Millipore / эквивалент	N/A	Используется в подготовке мобильной фазы; ранее упоминалась как вода Milli-Q в тексте
ОБОРУДОВАНИЕ & ИНСТРУМЕНТЫ
0.22 µm шприцевый фильтр	Millipore / любой	SLGP033RS	Стерилизация раствора резазурина (2.1.4); фильтрация рабочего раствора MTT (3.3); фильтрация рабочего раствора Neutral Red (3.4)
0.45 µm шприцевый фильтр	Millipore / любой	SLHA033SS	Фильтрация растворов мобильной фазы
15 мл конусная пробирка (стерильная)	Falcon / любой	352097 или эквивалент	Сбор и центрифугирование клеточной суспензии после трипсинизации
96-лунковая пластинка (плоскодонная, обработанная для культуры тканей)	Corning / любой	3596	Для анализов цитотоксичности и МИК
Алюминиевая фольга	Любой	—	Защита пластинок от света во время инкубации и встряхивания MTT и NRU
Автоклав	Любой	—	Стерилизация среды (121 °C, 98.07 kPa, 10 мин)
Кабина биобезопасности (II класс, сертифицированная)	Любой (сертифицированный BSL-3)	—	Н