Полуавтоматическая интеграция анализа показателей здоровья и продолжительности жизни двигательного аппарата с использованием конвейера FlyTrDT на Drosophila melanogaster

Durga Nandan; Nikhil Raj Selvaraj; Bipin G. Nair; Parvathy Venugopal; Rajaguru Aradhya

doi:10.3791/70697

Методическая статья

Полуавтоматическая интеграция анализа показателей здоровья и продолжительности жизни двигательного аппарата с использованием конвейера FlyTrDT на Drosophila melanogaster

8 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70697

⸱

30 октября 2026 г.

Durga Nandan^*¹ , Nikhil Raj Selvaraj^*¹ , Bipin G. Nair¹ , Parvathy Venugopal¹ , Rajaguru Aradhya¹

¹Amrita School of Biotechnology, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amrita University campus

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Drosophila melanogaster служит эффективным модельным организмом для исследований старения. В данном протоколе подробно описаны этапы, необходимые для получения воспроизводимых популяционных показателей как продолжительности жизни, так и периода функционального здоровья.

Аннотация

Старение характеризуется прогрессирующим снижением функциональных возможностей и сокращением продолжительности жизни; в экспериментальных исследованиях эти два параметра часто оцениваются независимо друг от друга. Для изучения старения и нейродегенерации у Drosophila melanogaster обычно используются тесты на продолжительность жизни и измерения локомоторной активности на основе отрицательного геотаксиса. Однако отсутствуют стандартизированные подходы, которые количественно объединяли бы показатели двигательной функции на ранних этапах с долгосрочной выживаемостью. В данной работе мы описываем воспроизводимый полуавтоматизированный рабочий процесс, сочетающий анализ продолжительности жизни с объективной количественной оценкой периода сохранения двигательного здоровья у стареющих мух.

Данный протокол объединяет контролируемые условия содержания мух, учет смертности и видеоанализ отрицательного геотаксиса с использованием стандартизированных записей в формате MP4 (минимальное разрешение 1280 × 720, 30 кадров/с). Локомоторная активность количественно оценивается с помощью специализированного программного конвейера на базе Python, реализованного в Python 3.12.1 с использованием OpenCV 4.9.0, NumPy 1.26.4, Pandas 2.2.0 и Matplotlib 3.5.2. Рабочий процесс включает покадровое определение центроида и расчет активной скорости подъема (пикселей/с) как непрерывного показателя моторной функции. Траектории выживаемости анализируются путем вычисления доли выживших и применения трапециевидного численного интегрирования для определения площади под кривой (AUC) выживаемости. Нормализация ранних показателей моторной функции позволяет напрямую сопоставить снижение функциональных возможностей с общим сроком жизни.

Рабочий процесс был оценен путем сравнения полуавтоматических измерений угла подъема с традиционной ручной оценкой конечной точки у контрольных мух и мух, экспрессирующих амилоид-β; оба метода выявили возрастное снижение двигательной функции. Репрезентативные наборы данных продемонстрировали воспроизводимые траектории продолжительности жизни у контрольной группы Canton S и измеримое раннее нарушение двигательной функции в нейродегенеративной модели. Данный метод сводит к минимуму субъективность наблюдателя, повышает воспроизводимость и остается совместимым с недорогими системами видеозахвата. Рабочий процесс может быть легко адаптирован для генетических моделей, фармакологических вмешательств и нейродегенеративных парадигм, предоставляя масштабируемую платформу для комплексного фенотипирования старения у Drosophila.

Введение

Старение характеризуется не только сокращением продолжительности жизни, но и прогрессирующим снижением физиологических и поведенческих функций¹. При нейродегенеративных состояниях ранние нарушения моторной координации часто возникают до наступления значимой смертности и отражают лежащую в их основе нейрональную дисфункцию²^,³. Плодовая мушка Drosophila melanogaster стала мощной модельной системой для изучения старения и нейродегенерации благодаря короткому жизненному циклу, генетической доступности и хорошо отработанным поведенческим тестам⁴. Анализ продолжительности жизни Drosophila обеспечивает надежную оценку выживаемости организма, в то время как тесты на отрицательный геотаксис широко используются для оценки локомоторной функции и возрастного снижения двигательной активности⁵^,⁶. Однако эти два показателя часто анализируются независимо, что ограничивает возможность количественно связать ранние функциональные нарушения с траекториями долгосрочного выживания. Интегрированный анализ периода сохранения моторного здоровья и общей продолжительности жизни может дать понимание механизмов того, влияют ли вмешательства на скорость старения, прогрессирование заболевания или конкретные физиологические системы. Такой подход особенно подходит для генетических, фармакологических и нейродегенеративных моделей, в которых ранний локомоторный дефицит предшествует значимой смертности, что позволяет чувствительно обнаруживать функциональный спад до появления заметных различий в выживаемости.

Традиционные тесты на отрицательный геотаксис основаны на подсчете конечных результатов, таких как доля мух, достигших определенной высоты за фиксированный интервал времени. Несмотря на простоту и дешевизну, ручная оценка может привести к субъективности наблюдателя и игнорированию тонких различий в кинетике движений. Измерения, основанные на непрерывном отслеживании траектории, могут повысить чувствительность при выявлении незначительных нарушений локомоции по сравнению с традиционными методами оценки конечных точек. Аналогично, тесты на продолжительность жизни требуют строгого учета смертности и стандартизации условий окружающей среды для обеспечения воспроизводимости⁷. Сохраняется потребность в доступных и воспроизводимых подходах, которые интегрируют показатели функционального периода здоровья с данными о выживаемости внутри одной когорты.

В данной работе мы описываем полуавтоматизированный рабочий процесс, который сочетает стандартизированный анализ продолжительности жизни с видеоколичественной оценкой двигательной функции стареющих Drosophila. С использованием вычислительных инструментов с открытым исходным кодом выполняется покадровое определение центроида для извлечения скорости подъема (pixels/s) как непрерывного показателя двигательной функции. Данные о выживаемости обрабатываются путем расчета доли выживших и выполнения трапециевидного численного интегрирования для получения площади под кривой (AUC) выживаемости. Путем нормализации ранних показателей двигательной функции и их интеграции с AUC выживаемости данный протокол позволяет проводить прямое сравнение между функциональным упадком и общей продолжительностью жизни. Такой подход обеспечивает объективную и экономически эффективную основу для установления связи между периодом сохранения двигательного здоровья и продолжительностью жизни, а также позволяет проводить комплексное фенотипирование траекторий старения у Drosophila (Рисунок 1).

Протокол

Все эксперименты проводились с использованием Drosophila melanogaster в соответствии с правилами работы в институциональной лаборатории руководства. Этическое одобрение не требовалось, поскольку в исследовании использовались беспозвоночные организмы. Все процедуры проводились в соответствии с институциональными правилами по уходу за животными при проведении исследований беспозвоночных.

ПРИМЕЧАНИЕ: Храните экспериментальные корма при 4 °C и используйте их в течение 1 недели, при условии, что они остаются сухими. Поддерживайте стандартные условия окружающей среды, инкубируя мух при 25 °C с циклом освещения/темноты 12:12 ч и относительной влажностью около 60%.

1. Приготовление стандартной среды для мух

Приготовление базового корма
1. Смешайте 6 g кукурузного крахмала, 5 g дрожжей, 4 g D-глюкозы, 3 g сахарозы, 1 g дрожжевого экстракта, 1 g агара и 0.25 g солодового экстракта в контейнере, содержащем 100 mL дистиллированной воды.
2. Тщательно перемешайте содержимое шпателем до образования однородной суспензии.
3. Нагревайте смесь примерно до 85–100 °C на индукционной плите в течение 12–15 мин при приготовлении объемов ≥500 mL или в течение 5–10 мин при приготовлении объемов от 100–400 mL. Постоянно перемешивайте во время нагрева.
4. Автоклавируйте нагретую смесь в соответствии со стандартными лабораторными процедурами стерилизации.
5. Дайте автоклавированной среде остыть. Контролируйте температуру с помощью термометра, пока она не достигнет 50–55 °C.
6. Добавьте в охлажденную среду 600 µL пропионовой кислоты и 100 mg бензойной кислоты в 1 mL 100% этанола и тщательно перемешайте.
7. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Работа с пропионовой кислотой и этанолом должна проводиться в хорошо проветриваемом помещении с использованием перчаток и защитных очков, так как оба вещества летучи и могут вызвать раздражение при вдыхании или контакте с кожей.
8. Разлейте по 5 mL корма в каждый стерильный флакон длиной 10 cm и диаметром 20 mm.
9. Оставьте флаконы открытыми минимум на 5–6 ч при комнатной температуре. Накройте их бумажными салфетками, чтобы предотвратить попадание посторонних мух. Этот этап необходим для минимизации вариабельности показателей продолжительности жизни, возникающей из-за различий в приготовлении среды и условиях хранения.
Приготовление корма с препаратом
1. Приготовьте небольшую порцию корма для взрослых особей, как описано в шагах 1.1.1–1.1.5.
2. Дайте корму остыть до 50–55 °C.
3. Приготовьте стоковый раствор исследуемого соединения в желаемой концентрации, используя подходящий растворитель, такой как дистиллированная вода или диметилсульфоксид (DMSO). Растворите исследуемое соединение в выбранном растворителе для получения концентрированного стокового раствора, затем добавьте сток в охлажденный корм (50–55 °C) для достижения требуемой конечной концентрации, поддерживая при этом идентичную концентрацию растворителя в опытных и контрольных группах.
4. Тщательно перемешайте для обеспечения равномерного распределения.
5. Разлейте по 2 mL корма, содержащего препарат, в каждый экспериментальный флакон, нанося его слоем на поверхность предварительно застывшего базового корма.
6. Подготовьте контрольные флаконы, добавив эквивалентный объем одного только растворителя (например, дистиллированной воды или DMSO в той же конечной концентрации, что и в опытных группах) в корм, наносимый слоем на базовый корм.
7. Дайте нанесенному слою корма полностью застыть при комнатной температуре перед посадкой мух.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Обращение с кормом и его хранение: Если корм готовится вечером, оставьте флаконы накрытыми бумажными салфетками на ночь при комнатной температуре и вставьте хлопковые пробки на следующее утро. Всегда мойте, дезинфицируйте и автоклавируйте флаконы перед использованием. Автоклавируйте хлопковые валики отдельно перед формированием пробок. Вставляйте хлопковые пробки только после того, как корм полностью застынет (минимум через 5–6 ч).

2. Получение D. melanogaster, экспрессирующих амилоид-β

Сбор и проверка девственных самок линии-драйвера
1. Перед сбором девственных особей содержите линию мух-драйверов при 25 °C с циклом освещения 12 ч свет : 12 ч темнота.
2. Собирайте только что вылетевших самок линии-драйвера дважды в день, утром и поздно вечером, используя кратковременную анестезию углекислым газом.
3. Сразу после сбора пересаживайте самок в свежие пробирки с одним полом, чтобы предотвратить спаривание.
4. Инкубируйте пробирки при 25 °C еще 48 ч для проверки статуса девственности.
5. Ежедневно проверяйте пробирки на наличие личинок.
6. Подтверждайте статус девственности, убедившись в отсутствии яиц или личиночного потомства.
7. Для использования в генетических скрещиваниях оставляйте только тех самок, у которых нет признаков производства личинок.
Постановка генетического скрещивания
1. В день постановки скрещивания соберите только что вылетевших взрослых самцов UAS-APPE693G, используя кратковременную анестезию углекислым газом.
2. Проведите скрещивание, поместив 20 девственных самок elav-GAL4 и 10 самцов UAS-APPE693G в пробирку со свежей питательной средой.
3. Инкубируйте пробирки со скрещенными особями при 25 °C при контролируемой влажности и цикле освещения 12 ч свет : 12 ч темнота.
4. Оставьте мух для спаривания и откладки яиц на 48 ч.
5. Пересадите взрослых особей в свежие пробирки, если требуется получить дополнительное потомство.
6. Удалите родительских мух после откладки яиц, чтобы избежать перенаселения и перекрытия поколений.
7. Дайте потомству развиться до взрослого состояния в стандартных условиях до момента вылета.
8. Используйте взрослых мух поколения F1, экспрессирующих amyloid-β в нейронах, для последующих экспериментов по продолжительности и качеству жизни.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Драйвер elav-GAL4 обеспечивает паннейрональную экспрессию белка-предшественника амилоида человека, несущего мутацию E693G Arctic. Экспрессия происходит на протяжении всего развития и во взрослом состоянии при стандартных условиях содержания. Для экспериментов по старению используйте единообразный генетический фон и соответствующие контроли. Поддерживайте стабильный температурный режим в рамках каждого
  эксперимента. В период развития можно использовать более низкие температуры инкубации, например 18 °C, чтобы
  замедлить развитие патологии, связанной с трансгеном, до достижения взрослого состояния.

3. Сбор мух

Сбор мух для анализа отрицательного геотаксиса
1. До начала эксперимента содержите все линии мух на стандартном корме при температуре 25 °C, относительной влажности около 60% и световом цикле 12 ч свет : 12 ч темнота.
2. Соберите недавно вылупившихся взрослых самцов в течение 2–3 дней, используя кратковременную анестезию углекислым газом.
3. Перенесите самцов либо в пробирки с кормом, содержащим препарат, либо в контрольные пробирки с кормом, в зависимости от условий эксперимента.
4. Заменяйте корм каждые 3 дня или раньше, если качество корма ухудшится.
5. Содержите мух в этих условиях до достижения возраста, установленного для оценки отрицательного геотаксиса.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа отрицательного геотаксиса используются только самцы, чтобы избежать вариабельности, вызванной половыми различиями в локомоторной активности и процессах старения.
Сбор мух для анализа продолжительности жизни
1. Кратковременно анестезируйте небольшие группы мух на анестезирующей подушке.
2. Отберите самцов с помощью мягкой кисточки.
3. Минимизируйте воздействие углекислого газа во время сортировки, чтобы предотвратить длительные физиологические эффекты, которые могут исказить показатели продолжительности жизни.
4. В зависимости от плана эксперимента, поместите в каждую пробирку со свежим кормом по 10 самцов и 10 самок (соотношение полов 1:1).
5. Завершите сортировку и распределение по пробиркам в течение 3–4 мин для каждой партии.
6. Следите за тем, чтобы общее время воздействия анестезии не превышало 9–10 мин.
7. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Анестезию углекислым газом следует проводить с использованием соответствующих регуляторов и при надлежащей вентиляции лаборатории, чтобы минимизировать воздействие на оператора и предотвратить длительный физиологический стресс у мух, вызванный анестезией.
8. Повторяйте шаги 3.2.1–3.2.6 до тех пор, пока для каждого экспериментального условия не будет сформировано 4–6 повторностей (пробирок).

4. Эксперимент по изучению долголетия

Перенос и содержание мух
1. Содержите мух в стандартных условиях.
2. Регулярно переносите мух в пробирки со свежей подкормкой, чтобы предотвратить перенаселение, загрязнение личинками и порчу корма.
3. Переносите мух на свежую подкормку каждые 3 дня.
4. Используйте такую частоту переноса, чтобы минимизировать нарушение условий кормления, предотвращая рост личинок в пробирке.
5. Выполняйте все переносы без использования анестезии.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте применения анестезии во время экспериментов по определению продолжительности жизни, так как она может вызвать острую смертность, особенно у старых мух.
Оценка смертности при переносах
1. При каждом переносе фиксируйте возраст когорты в днях.
2. Тщательно осмотрите старую пробирку.
3. Подсчитайте и запишите количество погибших мух, оставшихся в старой пробирке.
4. Подсчитайте и запишите количество погибших мух, перенесенных в новую пробирку.
5. Записывайте эти значения отдельно, чтобы избежать двойного учета.
6. Рассчитайте общее количество смертей для каждого переноса по следующему уравнению:
  Общее число смертей = погибшие мухи в старой пробирке + погибшие мухи, перенесенные в новую пробирку.
7. Определите количество новых смертей с момента предыдущего переноса, вычтя число мух, отмеченных как «перенесенные» при предыдущем переносе, из общего числа смертей при текущем переносе.
8. Используйте этот расчет, чтобы мухи, переносимые между пробирками, не учитывались несколько раз.
Идентификация живых, но неактивных мух
1. Если старые мухи кажутся неподвижными или лежат на спине, осторожно постучите по стенке пробирки, прежде чем засчитывать муху как погибшую.
2. Проверьте, наблюдается ли какое-либо движение.
3. Считайте живыми тех мух, которые проявляют двигательную активность при стимуляции.
4. Не регистрируйте мух, проявляющих активность при стимуляции, как погибших.
5. Осторожно постучите по пробирке, чтобы отделить любых живых мух, прилипших к поверхности корма в старой пробирке.
6. Перенесите отделенных живых мух в новую пробирку.
7. Не засчитывайте отделенных живых мух как погибших.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Точное различие между погибшими и неактивными мухами имеет решающее значение на поздних стадиях жизни. Перед определением статуса смерти всегда следует использовать осторожную механическую стимуляцию.
Критерии цензурирования
1. Считайте муху правоцензурированной, если она покидает эксперимент до естественной смерти вследствие побега из пробирки, случайного повреждения или проблем при манипуляциях.
2. Записывайте цензурированных мух в отдельную колонку в день их выбывания из эксперимента.
3. Не регистрируйте цензурированных мух как погибших.
4. Исключайте цензурированных мух из подсчета смертности при анализе выживаемости.
5. Используйте цензурирование осторожно, так как чрезмерное цензурирование может привести к возникновению экспериментальной ошибки.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Разделение при вводе данных на «погибших» и «перенесенных» мух предотвращает завышение показателей смертности и обеспечивает правильное построение кривой выживаемости.
Продолжение анализа
1. Повторяйте шаги 4.1–4.4 на протяжении всего эксперимента.
2. Продолжайте анализ до смерти последней выжившей мухи.

5. Эксперимент по отрицательному геотаксису

Подготовка мух
1. Соберите мух из экспериментальных пробирок с кормом без использования CO₂-анестезии.
2. Осторожно перенесите мух в чистую пробирку для тестов на лазание (или пробирку для теста на отрицательный геотаксис), используя небольшую воронку, чтобы предотвратить их побег.
3. Дайте мухам акклиматизироваться в тестовой камере в течение 5 min перед началом анализа.
4. Проводите все тесты на лазание в одно и то же время суток, например, днем, чтобы минимизировать циркадную вариабельность.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте попадания прямых солнечных лучей во время тестирования, так как интенсивность света может изменить локомоторное поведение.
Установка пробирки для лазания
1. Используйте прозрачную цилиндрическую пробирку для лазания высотой 12 cm и диаметром 2 cm.
2. Отметьте горизонтальную линию на расстоянии 10 cm от основания пробирки.
3. Разместите пробирку вертикально на однородном белом фоне для облегчения видеотрекинга.
4. Установите смартфон или цифровую камеру на устойчивый штатив.
5. Убедитесь, что вся пробирка попадает в кадр.
Процедура анализа
1. Трижды резко постучите пробиркой по поролоновой или коврику для мыши, расположенному на твердой поверхности, чтобы все мухи одновременно упали на дно.
2. Немедленно начните запись видео продолжительностью 10–12 s с частотой примерно 30 кадров/s.
3. Дайте мухам свободно лазать в течение 10 s.
4. Запишите результаты как минимум трех независимых попыток для каждой пробирки.
5. Соблюдайте интервал отдыха в 10 min между попытками.
6. Проведите анализ для каждого экспериментального условия, например, для контрольной группы, группы, получавшей препарат, и группы контроля растворителя.
7. Подсчитайте количество мух, достигших или пересекших отметку 10 cm в течение 10 s.
8. Запишите значение E как количество мух, достигших отметки 10 cm.
9. Запишите значение T как общее количество протестированных живых мух.
10. Рассчитайте процент активности лазания как (E/T) × 100.
11. Вычислите среднее значение по трем попыткам.
12. Представьте значения в виде среднего ± SD.
Полуавтоматический анализ лазания с помощью Python-скрипта
1. Сбор видеоданных
  1. Записывайте тесты на отрицательный геотаксис с помощью камеры смартфона, расположенной перпендикулярно прозрачной пробирке для лазания высотой 12 cm и диаметром 2 cm. Записывайте видео с помощью смартфона или цифровой камеры с частотой примерно 30 кадров/s и минимальным разрешением 1280 × 720 пикселей. Расположите камеру на фиксированном расстоянии примерно 15–20 cm от пробирки и соблюдайте одинаковую геометрию съемки для всех записей. Используйте известную высоту пробирки (12 cm) в качестве внутреннего пространственного эталона калибровки для измерений в пикселях.
  2. Поместите пробирку на однородный белый фон.
  3. Записывайте видео продолжительностью 10–12 s.
  4. Поддерживайте постоянное освещение во всех записях.
  5. Соблюдайте постоянное расстояние до камеры во всех записях.
  6. Соблюдайте постоянное положение пробирки во всех записях.
  7. Минимизируйте вариабельность при определении центроида.
  8. Сохраняйте записанные видео в формате .mp4.
  9. Перенесите записанные видео на настольный компьютер для анализа.
2. Обработка видео на базе Python
  1. Анализируйте видео с помощью специального внутреннего Python-скрипта, предоставленного в Дополнительном файле 1. Выполняйте все анализы с использованием Python 3.12.1 с библиотеками OpenCV (cv2) версии 4.9.0, NumPy версии 1.26.4, Pandas версии 2.2.0, Matplotlib версии 3.5.2 и Scikit-learn версии 1.4.2.
    1. Укажите путь к входному видео и выходной каталог в Дополнительном файле 1 перед запуском скрипта из среды Python или интерфейса командной строки.
    2. Запустите скрипт с помощью команды python climbing_analysis.py после редактирования переменных VIDEO_PATH и OUTPUT_CSV.
  2. Используйте OpenCV (или cv2) для обработки кадров и обнаружения объектов.
  3. Используйте NumPy для численных вычислений.
  4. Используйте Pandas для экспорта данных.
  5. Используйте Matplotlib для визуализации.
  6. Обрабатывайте каждое видео покадрово.
  7. Считывайте видео с помощью функции VideoCapture библиотеки OpenCV.
  8. Обрабатывайте отдельные кадры последовательно.
  9. Преобразуйте кадры в градации серого.
  10. Применяйте размытие по Гауссу для уменьшения фонового шума.
  11. Применяйте пороговую обработку Оцу в режиме инвертированного бинарного изображения для сегментации мух на фоне.
  12. Выполняйте операции морфологического открытия и закрытия для удаления мелких артефактов и заполнения разрывов в контурах.
  13. Идентифицируйте контуры, площадь которых превышает минимальный порог в 60 пикселей², чтобы исключить фоновые артефакты и мелкие частицы шума.
  14. Вычислите пространственные моменты для каждого валидного контура.
  15. Определите координаты центроида, x и y, для каждого валидного контура.
  16. Вычисляйте средние координаты центроида, если в кадре обнаружено несколько мух.
  17. Получайте одно среднее положение когорты на каждый кадр.
3. Оценка контроля качества
  1. Подтвердите успешную сегментацию мух, убедившись, что обнаруженные контуры соответствуют видимым мухам на протяжении всей записи.
  2. Обеспечьте достаточный контраст между мухами и фоном, используя однородный белый фон и стабильные условия освещения.
  3. Исключайте видео с чрезмерными бликами, тенями, смещением пробирки, сильным перекрытием мух или неполной видимостью пробирки.
  4. Считайте видео непригодным для анализа, если трекинг центроида прерывается на значительных участках записи или если пороговая обработка приводит к постоянным фоновым артефактам.
4. Извлечение показателей лазания
  1. Рассчитайте показатель лазания вручную, как описано в пункте 5.3.7.
  2. Рассчитайте высоту лазания в пикселях как разность между начальным и конечным вертикальными положениями центроида.
  3. Рассчитайте среднюю скорость в пикселях/s как общую длину траектории, деленную на продолжительность записи.
  4. Рассчитайте пиковую скорость в пикселях/s как максимальное мгновенное смещение между последовательными кадрами.
  5. Рассчитайте длину траектории в пикселях как совокупное расстояние, пройденное между кадрами.
  6. Рассчитайте площадь траектории в пикселях² как площадь выпуклой оболочки, охватывающей все положения центроида.
  7. Рассчитайте количество поворотов как число смен горизонтального направления.
  8. Рассчитайте количество остановок как число кадров, в которых смещение центроида между последовательными кадрами остается ниже порога остановки в 3 пикселя.
  9. Постройте график вертикального положения в зависимости от времени для получения объективной меры эффективности активного лазания.
  10. Рассчитайте наклон лазания в пикселях в секунду, используя скользящее окно линейной регрессии продолжительностью 1 секунда во время фазы активного лазания на записи.
  11. Используйте значение наклона в качестве основного показателя моторной функции для интеграции с анализом выживаемости.
  12. Экспортируйте количественные локомоторные показатели, включая высоту лазания, среднюю скорость, пиковую скорость, длину траектории, площадь траектории, количество поворотов, количество остановок и наклон лазания, в файлы .csv. Сохраняйте графики визуализации наклона в виде изображений .png для проверки качества и последующего анализа.

6. Интеграция анализа раннего состояния моторных функций и выживаемости

Экспортируйте данные о выживаемости в файл формата .csv, содержащий столбцы для группы, дня и количества живых мух.
Рассчитайте долю выживших для каждой группы в каждой временной точке, разделив количество живых мух на начальный размер когорты.
Вычислите площадь под кривой выживаемости (AUC), используя трапециевидное численное интегрирование доли выживших по времени.
Экспортируйте данные о двигательной активности в файл формата .csv, содержащий значение наклона кривой подъема на 7-й день для каждой группы.
Нормализуйте показатели двигательной активности на 7-й день относительно контрольной группы Canton S, разделив значение наклона каждой группы на 7-й день на соответствующий наклон контрольной группы.
Объедините нормализованные значения двигательной активности на 7-й день с соответствующими значениями AUC выживаемости для каждого генотипа.
Проведите описательное сравнение нормализованной двигательной активности на 7-й день и AUC выживаемости для оценки взаимосвязи между ранним снижением двигательной функции и показателями выживаемости.
Создайте графическую визуализацию нормализованной двигательной активности на 7-й день и значений AUC выживаемости (Дополнительный файл 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте весь интегральный анализ выживаемости и двигательной активности с помощью специального скрипта Python, предоставленного в качестве Дополнительного файла 2. Используйте библиотеку Pandas для обработки и объединения наборов данных, NumPy для трапециевидного численного интегрирования и Matplotlib для графической визуализации.

7. Статистический анализ

Представляйте данные по локомоторной активности и выживаемости в виде репрезентативных наборов данных, полученных из биологических реплик в отдельных пробирках.
Указывайте показатели локомоторной активности как средние значения, вычисленные по результатам независимых тестов на способность к подъему.
Используйте графическую визуализацию наклона кривой подъема (pixels/s) и значений AUC выживаемости для демонстрации репрезентативных взаимосвязей между двигательными функциями и исходами выживаемости.

Результаты

Воспроизводимые профили продолжительности жизни при стандартизированных условиях содержания
При содержании мух в контролируемых условиях окружающей среды (25 °C, влажность 60%, цикл свет–темнота 12 ч:12 ч) с использованием свежеприготовленного стандартизированного корма контрольные когорты демонстрировали стабильные траектории выживаемости в независимых экспериментах. Контрольные мухи линии Canton S имели медианную продолжительность жизни примерно 65–72 дня, при этом максимальная выживаемость достигала 75 дней (Рисунок 2). Эксперименты по определению продолжительности жизни проводили с 2 биологическими повторами для каждого условия, по 20 мух в каждом. Репрезентативные траектории выживаемости, полученные при стандартизированных условиях среды и питания, продемонстрировали воспроизводимые профили продолжительности жизни в контрольных когортах.

Напротив, мухи с пан-нейрональной экспрессией амилоида-β демонстрировали снижение выживаемости по сравнению с контрольной группой Canton S, что согласуется с ранее описанными нейродегенеративными фенотипами в моделях болезни Альцгеймера у Drosophila⁴^,⁵^,⁶.

Неоптимальные показатели продолжительности жизни могут наблюдаться при ухудшении качества корма или при нестабильных условиях содержания. В этих условиях был зафиксирован резкий рост ранней смертности в течение первых 7–10 дней и повышенная вариабельность между пробирками (>25%), что свидетельствует о нарушении воспроизводимости эксперимента и снижении согласованности результатов между биологическими повторами.

Возрастное снижение двигательной активности, выявленное с помощью полуавтоматического анализа способности к лазанию
Традиционная ручная оценка отрицательного геотаксиса выявила возрастное снижение локомоторной активности у мух, экспрессирующих amyloid-β, по сравнению с контрольной группой Canton S (Рисунок 3). На 7-й день показатели лазания в обеих группах оставались в целом сопоставимыми, тогда как к 28-му дню у мух, экспрессирующих amyloid-β, наблюдалось снижение активности лазания по сравнению с контрольными мухами. Контрольные когорты сохраняли относительно стабильные показатели лазания на протяжении всех временных точек старения. Эти поведенческие тенденции, определенные при ручной оценке, соответствовали снижению значений наклона кривой лазания, полученных с помощью полуавтоматического конвейера FlyTrDT; при этом наблюдались возрастные тенденции, схожие с результатами традиционной конечной оценки и компьютерного рабочего процесса отслеживания (Рисунок 4). Наблюдаемое снижение локомоторной активности у мух, экспрессирующих amyloid-β, согласуется с установленным возрастным поведенческим нарушением, описанным в моделях нейродегенерации Drosophila с использованием традиционных тестов на отрицательный геотаксис⁶^,⁷.

Полуавтоматический анализ способности к лазанию с использованием FlyTrDT выявил сохранность ранней двигательной функции у контрольных мух. На 7-й день средний наклон кривой лазания у контрольных мух составил 86,64 pixels/s, что отражает устойчивое перемещение вверх во время активной фазы лазания (Рисунок 4). К 28-му дню наклон приблизился к нулю (−1,50 pixels/s), что соответствует возрастному замедлению.

Напротив, у мух, экспрессирующих амилоид-β, наблюдалось раннее нарушение двигательных функций. На 7-й день скорость подъема снизилась до 34,25 pixels/s, что после нормализации составило примерно 39% от показателей контрольной группы. К 28-му дню скорость подъема существенно снизилась до −72,25 pixels/s, что указывает на нарушение локомоторной способности к перемещению вверх.

Метрика на основе наклона фиксирует активный сегмент подъема и снижает влияние начальной латентности испуга, фаз плато и стохастических артефактов движения. Положительный наклон указывает на чистое движение вверх, наклон, близкий к нулю, свидетельствует об ограниченном вертикальном перемещении, а отрицательный наклон указывает на чистое перемещение вниз. Эти репрезентативные траектории иллюстрируют прогрессирующее снижение двигательной активности у мух, экспрессирующих amyloid-β, по сравнению с контрольной группой соответствующего возраста.

При оптимальных условиях записи конвейер FlyTrDT генерировал непрерывные траектории центроидов со стабильной сегментацией контура и согласованными профилями вертикального смещения (Рисунок 4A). Снижение локомоторной активности у мух, экспрессирующих амилоид-β, отражалось в менее устойчивых восходящих траекториях и более низких значениях наклона (Рисунок 4B–D). Видеозаписи с избыточными бликами, нестабильным положением трубки, неоднородным освещением или недостаточным контрастом фона, которые приводили к разрывам траекторий центроидов и периодическим артефактам отслеживания, были исключены в ходе оценки контроля качества.

Связь между ранними показателями моторной функции и выживаемостью
Для изучения связи между ранними показателями моторной функции и выживаемостью значения нормализованного наклона кривой подъема на 7-й день сравнивали с AUC (площадью под кривой) выживаемости для разных генотипов (Рисунок 5). Мухи контрольной группы с сохраненной ранней моторной функцией (нормализованный моторный индекс = 1,0) имели более высокие значения AUC выживаемости (48,2), тогда как мухи, экспрессирующие amyloid-β, с пониженной ранней моторной функцией (нормализованный моторный индекс = 0,395) демонстрировали более низкие значения AUC выживаемости (24,65). Репрезентативные наборы данных по локомоции были получены из 2 биологических повторностей (флаконов) для каждого условия. Эти репрезентативные данные указывают на связь между снижением ранней моторной функции и сокращением продолжительности жизни в модели заболевания amyloid-β. Поскольку анализ проводился только для двух репрезентативных генотипов, данные результаты представлены в описательном виде, а не в виде статистически значимой прогностической корреляции.

Тест на способность трансгенных Drosophila к лазанию; диаграмма размаха и кривая Каплана-Мейера для исследования болезни Альцгеймера.
Рисунок 1: Обзор рабочего процесса полуавтоматизированного конвейера FlyTrDT, интегрирующего показатели здоровья локомоторной функции с анализом выживаемости. Рабочий процесс включает стандартизированное разведение мух и анализ продолжительности жизни, ручную и полуавтоматизированную оценку отрицательного геотаксиса, покадровую экстракцию центроидов из видеозаписей лазания, расчет наклона кривой лазания (pixels/s), анализ площади под кривой (AUC) выживаемости и интеграцию показателей двигательной активности с результатами выживаемости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

График анализа выживаемости с сравнением контрольной группы CS и групп Aβ; вероятность в зависимости от количества дней.
Рисунок 2: Анализ выживаемости по методу Каплана — Майера для контрольных мух Canton S и мух, экспрессирующих амилоид-β. Кривые выживаемости иллюстрируют траектории продолжительности жизни при стандартизированных условиях окружающей среды и питания. Контрольные мухи Canton S демонстрировали более длительную выживаемость по сравнению с мухами с пан-нейрональной экспрессией амилоид-β, у которых наблюдалось сокращение продолжительности жизни в различных временных точках старения. Данные представляют собой репрезентативные траектории выживаемости, полученные из двух биологических повторов (пробирок) для каждого условия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты теста на способность Drosophila к лазанию; диаграммы размаха сравнивают CS и elav-Gal4/UAS-Aβ42 на 7-й и 28-й дни.
Рисунок 3: Показатели ручного теста на отрицательный геотаксис у контрольных мух и мух, экспрессирующих амилоид-β, на 7-й и 28-й дни. Диаграммы размаха показывают репрезентативные измерения активности лазания, выраженные как процент мух, преодолевших порог 10 cm в течение 10 s. Контрольные мухи линии Canton S (CS) сохраняли относительно стабильную активность лазания в разные временные точки старения, в то время как мухи, экспрессирующие амилоид-β, продемонстрировали снижение способности к лазанию к 28-му дню. Каждая точка представляет собой измерение в отдельном флаконе. Репрезентативные наборы данных были получены из 2 биологических повторностей (флаконов) для каждого условия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Анализ высоты подъема; на графиках A-D показаны наклоны в пикселях/сек; диаграммы зависимости высоты от времени; тенденции данных.
Рисунок 4: Полуавтоматическое извлечение траекторий подъема и активного наклона подъема у контрольных мух и мух, экспрессирующих amyloid-β. Репрезентативные траектории среднего вертикального положения были извлечены из видеозаписей отрицательного геотаксиса с помощью конвейера трекинга FlyTrDT. Синие линии представляют собой среднее по кадрам вертикальное положение центроида обнаруженных мух с течением времени, а красные сегменты обозначают репрезентативный сегмент активного подъема, определенный с помощью окна скользящей линейной регрессии. Значения наклона выражены в pixels/s. (A) Контрольные мухи Canton S, день 7. (B) Мухи, экспрессирующие amyloid-β, день 7. (C) Контрольные мухи Canton S, день 28. (D) Мухи, экспрессирующие amyloid-β, день 28. Репрезентативные траектории были получены из 2 биологических повторностей (флаконов) для каждого условия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

График зависимости раннего состояния двигательной функции от выживаемости; оси показывают нормированный показатель двигательной функции на 7-й день и AUC выживаемости.
Рисунок 5: Связь между ранними показателями двигательной функции и выживаемостью в модели токсичности амилоида-β у Drosophila. Нормированные значения наклона кривой способности к лазанию на 7-й день отложены против площади под кривой (AUC) выживаемости для контрольных мух Canton S (CS) и мух, экспрессирующих амилоид-β (AD) (n = 2). Контрольные мухи продемонстрировали более высокие показатели двигательной функции на ранней стадии и более высокие значения AUC выживаемости по сравнению с мухами, экспрессирующими амилоид-β. Эти репрезентативные наборы данных иллюстрируют связь между ранними локомоторными показателями и результатами выживаемости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Скрипт FlyTrDT на языке Python для анализа способности к лазанию, используемый для полуавтоматического количественного определения локомоторной активности по видеозаписям отрицательного геотаксиса. Скрипт выполняет покадровую обработку изображений, определение центроида, извлечение траектории и расчет показателей лазания, включая наклон подъема, скорость, длину траектории, площадь траектории, количество остановок и количество поворотов.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Скрипт на языке Python для интеграции данных о продолжительности здорового периода (healthspan) и общей продолжительности жизни (lifespan) двигательных функций. Скрипт выполняет расчет доли выживших, анализ площади под кривой (AUC) трапециевидным методом, нормализацию значений наклона кривой подъема на 7-й день, объединение наборов данных, а также графическую визуализацию показателей двигательной активности и результатов выживаемости.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В данной работе мы представляем протокол, объединяющий анализ продолжительности жизни с полуавтоматическим количественным определением периода сохранения моторных функций у Drosophila melanogaster. Надежная интеграция измерений продолжительности жизни и локомоторной активности в значительной степени зависит от стабильности условий окружающей среды, качества корма и стандартизированных процедур обращения с биологическими повторами⁷. Различия в степени высыхания корма, задержки при пересадке или непоследовательный учет смертности могут привести к резким всплескам ранней смертности и усилению вариативности между пробирками, что влияет на построение кривых выживаемости и последующую интерпретацию фенотипов старения.

При проведении анализа отрицательного геотаксиса необходимо обеспечить стабильные условия освещения, фиксированное положение камеры и правильное выравнивание пробирок для надежного определения центроидов при обработке видео. Следует минимизировать избыточное воздействие CO₂ во время сортировки, так как анестезия может повлиять как на продолжительность жизни, так и на локомоторную активность. При проведении повторных поведенческих измерений одной и той же когорты тесты следует проводить в одно и то же время суток, чтобы снизить влияние циркадных ритмов. Недостаточный контраст фона или неравномерное освещение могут затруднить пороговую обработку и определение контуров при автоматизированном анализе. Если при обработке видео наблюдается фрагментация контуров или нестабильные траектории центроидов, следует улучшить контраст фона, уменьшить блики, стабилизировать положение камеры и обеспечить равномерное освещение во всех записях. Постоянные артефакты пороговой обработки можно минимизировать, изменив угол записи, уменьшив количество теней или обеспечив непрерывную видимость всей climbing tube в кадре. Избыточное скопление мух в пробирке может помешать точной оценке центроида, поэтому следует минимизировать этот эффект, поддерживая одинаковый размер когорт в разных экспериментах.

Традиционные тесты на отрицательный геотаксис обычно количественно определяют долю мух, достигших заданной высоты за фиксированный интервал времени, и широко используются для оценки снижения локомоторной активности при старении и нейродегенерации⁵^,⁶. Напротив, предлагаемый полуавтоматизированный рабочий процесс выделяет активную фазу подъема и рассчитывает скорость активного подъема (пикселей/с) на основе построения траекторий центроидов по каждому кадру. Поскольку положения центроидов усредняются по всем обнаруженным мухам в каждом кадре, индивидуальные локомоторные траектории и поведенная гетерогенность между отдельными особями не учитываются. Такой подход снижает влияние латентности реакции на испуг, кратковременных пауз и кластерного поведения, которые влияют на ручную оценку по конечной точке. В отличие от традиционной оценки по конечной точке, данный рабочий процесс также обеспечивает непрерывные измерения возрастающего наклона (пикселей/с), что позволяет количественно сравнивать снижение моторных функций в зависимости от возраста и генотипа. Подобные вычислительные методы трекинга все чаще применяются для повышения объективности и согласованности анализа поведения Drosophila с использованием платформ автоматического количественного определения локомоции⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹².

Следует учитывать ряд дополнительных ограничений. Измерения скорости подъема на основе пикселей (pixels/s) зависят от согласованности калибровки камеры и геометрии записи во всех экспериментах. Различия в расстоянии до камеры или разрешении могут повлиять на абсолютные значения наклона, что обуславливает необходимость нормализации по внутренним контролям. Более того, хотя раннее снижение двигательной активности качественно коррелировало с сокращением выживаемости в представленной здесь модели амилоида-β, более широкая валидация на дополнительных генотипах, вмешательствах или фармакологических методах лечения позволила бы более точно интерпретировать взаимосвязь между двигательными функциями и показателями выживаемости. Представленные здесь репрезентативные наборы данных предназначены для демонстрации реализации и интерпретации рабочего процесса, а не для создания обобщенной прогностической модели для различных контекстов заболевания.

Несмотря на эти ограничения, данный протокол представляет собой воспроизводимую и экономически эффективную основу для установления связи между функциональными показателями периода здоровья и исходами выживаемости в исследованиях старения. Метод легко адаптируется к генетическим манипуляциям, парадигмам скрининга лекарственных препаратов и моделям нейродегенерации, при которых функциональный спад предшествует смерти. Благодаря интеграции объективной количественной оценки крутизны подъема (pixels/s) со стандартизированным анализом выживаемости, этот подход облегчает комплексное фенотипирование траекторий старения у Drosophila. Будущие исследования, включающие дополнительные нейродегенеративные генотипы, фармакологические вмешательства и лонгитюдные наборы поведенческих данных, могут дополнительно расширить применимость данного рабочего процесса для интегрированного анализа периода здоровья¹³^,¹⁴.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.

Благодарности

Данная работа была поддержана средствами Школы биотехнологий Университета Амрита Вишва Видьяпитам, Амритапури.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агар	Himedia	GRM666	Отвердитель
Бензойная кислота	Himedia	GRM488	Антимикробный консервант
Canton-S	Центр коллекций Drosophila в Блумингтоне	BDSC #1	Референсный штамм дикого типа
Трубка для подъема	Специально изготовленный	Поскольку исходный текст не был предоставлен, я не могу выполнить перевод. Пожалуйста, отправьте текст, который необходимо перевести на русский язык.	Прозрачная цилиндрическая трубка, высота 12 см × диаметром 2 см, прозрачный пластик или стекло
Кукурузная мука	Местный поставщик	Поскольку исходный текст не был предоставлен, пожалуйста, введите текст, который необходимо перевести.	Приготовление корма для мух
Настольный компьютер/ноутбук	Любой производитель	Определяемый пользователем	Минимальные требования: двухъядерный процессор, ≥8 ГБ ОЗУ, операционная система, совместимая с Python 3.x
D-глюкоза	Himedia	MB037	Компонент корма для мушек
elav-GAL4	Центр коллекций Drosophila в Блумингтоне	BDSC №458	Паннейрональный драйвер GAL4
Matplotlib	Библиотека с открытым исходным кодом	Версия 3.5.2	Построение графиков и визуализация
NumPy	Библиотека с открытым исходным кодом	Версия 1.26.4	Численные расчеты
OpenCV	Библиотека с открытым исходным кодом	Версия 4.9.0	Обработка видео
Pandas	Библиотека с открытым исходным кодом	Версия 2.2.0	Обработка данных
Пропионовая кислота	Himedia	GRM3658	Противогрибковый консервант
Python	Python Software Foundation	Версия 3.12.1	Среда анализа
Scikit-learn	Библиотека с открытым исходным кодом	Версия 1.4.2	Линейный регрессионный анализ
Камера смартфона / Цифровая камера	Любой производитель	Определяемый пользователем	Запись с частотой не менее 30 кадров/с, стабильный фокус, перпендикулярное расположение, минимум 1280 × разрешение 720p
Сахароза	Himedia	GRM601	Компонент корма для мух
UAS-APP.Aβ.E693G	Центр коллекций Drosophila в Блумингтоне	BDSC #33774	Модель мутации Arctic белка APP человека
Дрожжи	Himedia	RM027	Пищевая добавка

Ссылки

López-Otín C, et al. The hallmarks of aging. Cell. 2013;153(6):1194-217.
Caligiore D, Giocondo F, Silvetti M. The Neurodegenerative Elderly Syndrome (NES) hypothesis: Alzheimer and Parkinson are two faces of the same disease. IBRO Neurosci Rep. 2022;13:330-43.
Buchman AS, Bennett DA. Loss of motor function in preclinical Alzheimer’s disease. Expert Rev Neurother. 2011;11(5):665-76.
Sivanantharajah L, Mudher A, Shepherd D. An evaluation of Drosophila as a model system for studying tauopathies such as Alzheimer’s disease. J Neurosci Methods. 2019;319:77-88.
Jones MA, Grotewiel M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Exp Gerontol. 2011;46(5):320-5.
Gargano JW, Martin I, Bhandari P, Grotewiel MS. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 2005;40(5):386-95.
Linford NJ, Bilgir C, Ro J, Pletcher SD. Measurement of lifespan in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. 2013;(71):50068.
Spierer AN, Yoon D, Zhu CT, Rand DM. FreeClimber: automated quantification of climbing performance in Drosophila. J Exp Biol. 2021;224(2).
Taylor MJ, Tuxworth RI. Continuous tracking of startled Drosophila as an alternative to the negative geotaxis climbing assay. J Neurogenet. 2019;33(3):190-8.
Cao W, et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. J Vis Exp. 2017;(127):56507.
Liu H, et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Aβ42-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 2015;31(5):541-9.
Rhodenizer D, et al. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp Gerontol. 2008;43(8):739-48.
Tsintzas E, Niccoli T. Using Drosophila amyloid toxicity models to study Alzheimer’s disease. Ann Hum Genet. 2024;88(5):149-65.
O’Keefe L, Denton D. Using Drosophila models of amyloid toxicity to study autophagy in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Biomed Res Int. 2018;2018:5195416.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

отрицательный геотаксис локомоторная активность траектории выживаемости анализ на основе видеозаписи определение центроида скорость подъема нейродегенеративная модель

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Сообщать об обновлениях: