Культурная оценка невыявленного роста и антиоксидантное профилирование свежего экстракта геля алоэ вера

Краткое содержание

Этот протокол описывает асептическую подготовку свежего экстракта внутреннего геля алоэ вера , потенциометрическое измерение pH, оценку общего антиоксидантного потенциала с помощью автоматизированного колориметрического анализа на основе ABTS, культурную оценку невыявленного роста при определённых инкубационных условиях и предварительный антимикробный скрининг алоэ вера с соотношением 70:30 (v/v).Тестовая смесь /N-ацетил-L-цистеина с помощью дисковой диффузии и качественного двухкратного разбавления труб.

Аннотация

Алоэ вера (Aloe barbadensis Miller) широко используется в местных и комплементарных медицинских продуктах. Однако стандартизированные лабораторные рабочие процессы для одновременной оценки общей антиоксидантной ёмкости (TAC), поведения pH, культурного статуса невыявленного роста при определённых условиях и предварительного антимикробного скрининга остаются ограниченными. Свежий экстракт алоэ вера с внутренним гелем был приготовлен асептически и сформулирован с содержанием 5%, 10%, 15% и 20% (в/в). pH измерялся потенциометрически, а TAC — с помощью автоматизированного колориметрического анализа на основе радикальных катионов ABTS. Оценка невыявленного роста на основе культуры проводилась путём инокуляции экстракта на кровяной агар, эозин метиленово-голубой агара и агар-декстрозу Сабуро, затем аэробная инкубация и визуальный осмотр через 24 часа, 48 и 72 часа. Антимикробный скрининг смеси алоэ вера/N-ацетил-L-цистеин 70:30 (v/v) проводился против стандартных эталонных штаммов с помощью дисковой диффузии и качественных двухкратных трубочных разбавлений. TAC значительно различался между группами (Крускал-Уоллис, p = 0,014), при этом самые высокие значения наблюдались в 20% формуле. В течение 72-часового периода наблюдения видимого бактериального или грибкового роста не наблюдалось в условиях тестируемой культуры. Тестовая смесь алоэ вера/N-ацетил-L-цистеина дала зоны ингибирования от 11 мм до 17 мм, при этом самая большая зона наблюдалась против Pseudomonas aeruginosa. Этот рабочий процесс обеспечивает практический лабораторный подход к приготовлению и предварительной характеристики свежего алоэ вера.-основанные на формулировках для исследований в области комплементарной медицины на ранних стадиях.

Введение

Алоэ вера продолжает привлекать значительное научное внимание благодаря своему давнему применению в традиционной медицине и растущей значимости в фармацевтической, биомедицинской, косметической и пищевой^{науке 1,2,3}. Это лекарственное растение содержит широкий спектр биологически активных компонентов, включая полисахариды, фенольные соединения, антрахиноны, витамины, минералы, ферменты и другие низкомолекулярные метаболиты, которые могут способствовать его терапевтическим и^{функциональным свойствам 1,2,3}. Среди этих компонентов ацеманнан уделяется особое внимание из-за его биоматериального потенциала и сообщается о роли в восстановлении тканей, иммуномодуляции и регенеративных^{применениях 4,5}. Параллельно фенолы и другие антиоксидантно-активные соединения связаны с свободными радикалами, защитными и биологически поддерживающими эффектами препаратов алоэ вера. ^2,3.

В последние годы наблюдается растущий интерес к включению алоэ вера в передовые системы формулирования и биоактивные материалы. Гидрогели на основе алоэ вера, биоматериальные чернила, нанокомпозиты и трёхмерные напечатанные каркасы были исследованы для применения в заживлении ран и поддержке тканей благодаря их высокой гидратационной способности, биосовместимости и многофункциональным биологическим^{свойствам} 4,6,8,9,10,11. Экспериментальные исследования показали, что материалы, содержащие алоэ вера, могут способствовать управлению ранами, способствуя созданию влажной среды, улучшая физико-химические свойства формулы и обеспечивая антиоксидантную или антимикробную поддержку при выбранных in vitro, in vivo и зависящих от формулы^{условиях} 4,7,8,9,10,11. Кроме того, алоэ вера исследовалась в области консервирования и формулирования пищевых продуктов, где гелевые покрытия и связанные с ними системы связаны с улучшением окислительной стабильности, улучшением сенсорного качества и повышенной микробиологической^{эффективностью 12,13}. Эти разработки свидетельствуют о том, что алоэ вера всё больше рассматривается не только как традиционный травяной продукт, но и как многофункциональный натуральный материал с широким потенциалом, ориентированным на^{формулировку} 2,3,12,13.

Биологическая значимость алоэ вера также распространяется на антимикробные и микробиологически ориентированные приложения. Недавние исследования описывают ингибирующие эффекты препаратов, содержащих алоэ вера или алоэ вера, на клинически важные микроорганизмы, включая Propionibacterium acnes, Enterococcus feecalis, виды Candida и клинические изоляты, выделенные из рановых^{инфекций 14, 15, 16, 17}. Ранее исследования in vitro также показали активность внутреннего геля Aloe vera против эталонных штаммов Helicobacter pylori и клинических^{изолятов 18}. Кроме того, гибридные системы, содержащие алоэ вера, обладают комбинированными антимикробными, антиоксидантными и заживляющими ранами, что дополнительно подтверждает многофункциональный характер этого растительного^{материала 19}. Однако биологические характеристики алоэ вера зависят от нескольких методологических факторов, включая используемую часть растений, процедуру экстракции, концентрацию, условия обращения, свежесть геля, а также наличие только внутреннего геля или компоненты, связанные с латексом^{, 2,20}. Эти факторы особенно важны, поскольку внутренний гель и наружные части листьев различаются как по составу, так и по токсикологическому^{профилю 20}.

Несмотря на растущее количество литературы, важные методологические пробелы сохраняются. Во многих опубликованных исследованиях антиоксидантное поведение, физико-химические свойства, микробиологическая оценка и антимикробная эффективность часто оцениваются отдельно, а не в рамках единого интегрированного рабочего процесса. Однако для исследований, ориентированных на формулировку, эти параметры тесно связаны. Препарат может проявлять благоприятную антиоксидантную активность, но при этом требовать тщательной микробиологической оценки и физико-химической характеристики, прежде чем его можно будет признать пригодным для дальнейшей экспериментальной разработки. Поэтому лабораторные рабочие процессы, сочетающие оценку, связанную с редоксированием, оценку pH, тестирование на основе посевов с невыявленным ростом при определённых условиях и предварительный антимикробный скрининг, могут предоставить более практичную и информативную основу для ранней характеристики свежих формул алоэ вера.

Соответственно, целью данного исследования было оценить свежие составы экстракта алоэ вера с внутри геля, приготовленные в различных концентрациях, с точки зрения характеристик pH, общей антиоксидантной ёмкости, невыявленного роста на основе культуры при определённых лабораторных условиях, а также предварительного антимикробного скрининга с помощью дисковой диффузии и качественного двухкратного разбавления трубок. Интегрируя эти оценки в единый экспериментальный рабочий процесс, исследование было разработано для предоставления практического базового подхода к предварительной характеристике алоэ вера.-на основе формулировок, предназначенных для исследований комплементарной медицины.

Протокол

1. Серия экстракта и разбавления алоэ вера

1. Соберите зрелые листья растения алоэ вера, выращенного при комнатной температуре, и тщательно промыйте их под проточной водой, чтобы удалить остатки.
2. В шкафу с биобезопасностью уровня 2 (BSL-2) дезинфицируйте поверхность листьев 70% этанолом, используя стерильные перчатки. После нанесения 70% этанола дайте поверхности листа полностью высохнуть на воздухе не менее 2 минут перед асептическим разрезом.
3. С помощью стерильного скальпеля удалите дистальный кончик и края листа, дайте жёлтому латексному экссудату полностью высочиться примерно на 30 минут, после чего продольно филейте лист. Аккуратно отделяйте и собирайте только прозрачный внутренний гель, избегая наружной корки и остаточного слоя латекса.
4. Аккуратно переместите внутренний гель алоэ вера в стерильную ёмкость и гомогенизуйте с помощью периодического вихря примерно 5-10 минут при примерно 2 500 об/мин (или эквивалентном средне-высоком режиме вихря); процедуру выполняйте при комнатной температуре, если только для конкретного прибора не требуется контроль температуры.
5. В асептических условиях приготовьте свежие составы экстракта Алоэ вера . внутри геля в концентрациях 5%, 10%, 15% и 20% (w/v) с использованием стерильной дистиллированной воды; Например, подготовьте 5% (w/v) как 5 г геля до итогового объёма 100 мл и аналогично скорректируйте оставшиеся концентрации.

2. Измерение pH

1. Выполните калибровку трёхточечного pH-метра с использованием стандартных буферных решений pH 4.01, 7.00 и 10.01 с отслеживаемостью NIST перед каждой серией измерений.
2. Измерьте pH для каждой концентрации при комнатной температуре (20–25 °C); Записывайте как минимум три технических повторения на одну концентрацию.

3. Измерение общей антиоксидантной ёмкости (TAC)

1. Используйте формулы экстракта алоэ вера, подготовленные на этапе 1 (5%, 10%, 15% и 20%) для измерения TAC.
2. Перед анализом доводите все реагенты и образцы до комнатной температуры (20–25 °C) для обеспечения аналитической согласованности.
3. Калибруйте автоматический биохимический анализатор (Rel Assay, Турция) в соответствии со стандартными операционными процедурами производителя перед началом анализа.
4. Загрузить реагенты общей антиоксидантной ёмкости (TAC) на основе метода Эреля в реагенты анализатора.
5. Извлекайте образцы из алоэ вера . в соответствующие чашки или реакционные ямы с помощью откалиброванных микропипеток. (Объём образца: 5 мкл)
6. Инициировать TAC-анализ с использованием запрограммированного протокола анализатора для радикального катионного метода ABTS, следуя объёмам реагентов и настройкам инкубации, указанным производителем.
7. Дайте реакции пройти автоматически, при этом антиоксиданты, присутствующие в образце, уменьшают окрашенный радикальный катион, что приводит к снижению поглощения.
8. Измерьте изменение поглощения спектрофотометрически на заданной длине волны, определённой методом TAC. (Длина волны: 660 нм)
9. Вычислите общие значения антиоксидантной ёмкости с помощью программного обеспечения анализатора, сравнивая изменения поглощения образца с кривой калибровки, эквивалентной Trolox.
10. Экспресс-TAC получает эквиваленты моль-тролокса / л на единицу объёма экстракта.
11. Выполняйте все измерения в дублировании для обеспечения аналитической надёжности.

4. Культурная оценка невыявленного роста внутреннего геля Aloe vera .

1. Инокуляция по 10 мкл каждого экстракта на кровяной агар, эозин метиленовый голубой агар и декстрозный агар Сабуро с помощью калиброванного контура (10 мкл) (метод подсчёта колоний).
2. Для оценки невыявленного роста на основе культур асептически наносите стандартизированный аликвот 50 мкл с помощью калиброванной микропипетки на кровяные агар, эозин метиленовый голубой агар и декстрозные пластины Сабуро и аккуратно распределяйте его с помощью стерильной одноразовой петли (10 мкл) (оценка размножения на основе культуры с использованием метода прямой капельницы).
3. Инкубировать пластины агара крови и эозин метиленово-синего агара аэробно при 37 °C и аэробно — пластины агара Сабуро декстроза при 25–28 °C, затем визуально осматривать пластины на предмет роста через 24, 48 и 72 часа. Инкубировать по одной неинокуляционной пластине каждой среды параллельно в качестве отрицательного контроля.

5. Оценка антимикробной активности тестовой смеси алоэ вера

1. В стерильных условиях приготовьте однородный тестовый раствор, смешав 70% стерильный экстракт иннер-геля алоэ вера с раствором 30% N-ацетил-L-цистеина (10% w/v в стерильной воде).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта смесь снижает высокую вязкость геля, соскребавшего с листа, и приобретает более жидкую консистенцию. Рассмотрим эту составную формулу как предварительную фильтрационную смесь. Поэтому антимикробные результаты интерпретируют с учётом совокупной активности обоих компонентов.
2. Тщательно выкрутите гомогенизированную смесь до получения однородного раствора.
3. Субкультивировать ранее криоконсервированные стандартные бактериальные запасы Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 и Escherichia coli. ATCC 25922, хранится при -80 °C, на стандартном кровяном агаре (для грамположительных бактерий) и стандартном эозин-метиленовом синем агаре (для грамотрицательных бактерий), и инкубируется при 37 °C в течение 18–24 часа.
4. В конце инкубации подготовьте бактериальные суспензии, отрегулированные до мутности Макфарланда 0,5 с использованием стерильного физиологического раствора из выращиваемых колоний, следуя стандартным рекомендациям по подготовке инокуля для тестирования на антимикробную^{чувствительность 38}.
5. Инокулировать агаревую пластину Мюллера-Хинтона равномерно с каждой стандартизированной бактериальной суспензией с помощью стерильного мазка.
6. Примените стандартизированный объём 15 мкл стерильной тестовой смеси алоэ вера/NAC на каждый стерильный 6-мм антимикробный диск с помощью откалиброванной микропипетки. Одинаковый объём нагрузки, время поглощения (не менее 2 минут) и время сушки на воздухе (примерно 5 мин) применялись ко всем дискам по репликам для обеспечения процедурной согласованности. Этот объём был выбран как практическая нагрузка для дисков диаметром 6 мм при диффузионном экранировании на основе растительных экстрактов и оставался постоянным для всех экспериментов.
7. Поместите диски, пропитанные экстрактом, на поверхность инокуленных агарных пластин с помощью стерильных щипцов.
8. Инкубировать пластины при 37 °C в течение 18–24 часа в аэробных условиях.
9. После инкубации вручную измерите диаметр каждой зоны торможения, включая диаметр диска, с помощью линейки до ближайшего миллиметра. Проведите эксперимент в виде единого описательного измерения, указывая зафиксированные диаметры зон как индивидуальные наблюдаемые значения. Проведите измерения путем визуального осмотра пластин согласно стандартным рекомендациям по диффузии^{дисков 38}.
10. Приготовьте двойное последовательное разбавление (1/2, 1/4, 1/8 и 1/16) тестовой смеси алоэ вера/NAC 70:30 (v/v) в бульоне Мюллера-Хинтона.
11. Инокуляйте каждую трубку 500 мкл соответствующей стандартизированной бактериальной суспензии McFarland, приготовленной в стерильном физиологическом растворе. Подготовьте отдельную серию разбавления для каждого эталонного штамма и инкубируемые пробирки в условиях, указанных ниже.
12. Инкубировать инокуляционные трубки при 37 °C в течение 18–24 часа.
13. Оценивайте рост микроорганизмов визуально по мутности относительно контроля бульона; интерпретировать анализ качественно, а не как формальное определение MIC.
14. Используйте диск с ципрофлоксацином (5 мкг) в качестве положительного контроля параллельно с дисками, пропитанными алоэ вера/NAC. Примените тот же положительный контрольный диск для Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 и Escherichia coli ATCC 25922 для подтверждения восприимчивости при условиях диффузии диска.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнять все микробиологические процедуры в условиях BSL-2 и сразу после инкубации фиксировать все наблюдения диаметра и мутности зоны для последующего описательного анализа. Этот протокол сочетает асептическую подготовку A. vera.экстракт с помощью комплементарных биохимических и микробиологических анализов для поддержки разработки растительных формул для местного и дополнительного применения в медицине. Рабочий процесс разработан так, чтобы быть практичным для рутинных лабораторий: pH и редокс-скрининг (TAC) могут проводиться вместе с культурой стерильности и двумя широко используемыми антимикробными анализами (диффузия диска и разбавление трубки).

Результаты

pH экстракта Aloe Vera. в различных концентрациях

Профиль pH показал немонотонную картину по концентрациям. Средние значения pH составляли 6,47, 6,60, 6,26 и 6,28 для формул 5%, 10%, 15% и 20% соответственно. Общие различия в группах были значимы (p = 0,024). Формулы с 5% и 10% показывали относительно более высокие значения pH, тогда как формулы 15% и 20% были сгруппированы с более низкими значениями pH (p < 0,05) (Таблица 1 <...

Обсуждение

Настоящее исследование обеспечивает интегрированный лабораторный рабочий процесс для предварительной характеристики свежих экстрактов экстракта алоэ вера с внутри геля путем сочетания измерения pH, анализа общей антиоксидантной ёмкости (TAC), оценки невыявленного роста на основе культур и описательного антимикробного скрининга. Рост концентраций свежего внутригельного алоэ вера был связан с более высокими значениями TAC, при этом при краткосрочном мониторинге культуры в...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
(-)80 С Глубокая морозильная камера	Thermofisher/USA	Хранение образцов	TSX40086A
Vortex	Thermofisher/USA	Подготовка образцов	88882010
Кровяной агар	RTA/Турция	Инокуляция культур	2001
Эозин-метилено-синий агар	RTA/Турция	Инокуляция культур	2010
SDA агар	RTA/Турция	Инокуляция культур	2036
Агар Мюллера-Хинтона	RTA/Турция	Инокуляция культур	2022
Бульон Мюллера-Хинтона	RTA/Турция	Разбавление культур	1018
Пипетки	Thermofisher/USA	Подготовка образцов	4642090N
pH-метры Hanna	Hitachi/ЯПОНИЯ	Анализ образцов	HI2211-02
Инкубатор для микротитрационных плит Rel Assay	Rel Assay(Турция)	Анализ TAC образцов	M201 (Smart Model)
TAC наборы	Rel Assay(Турция)	Набор	RL0017