Этот протокол представляет собой упрощённую технику анастомоза шва от конца до стороны для трансплантации шейного сердца у мышей, обеспечивая надёжную и воспроизводимую модель для изучения иммунологии трансплантации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трансплантация сердца мышей шейки матки с использованием метода анастомоза от конца к боку для изучения иммунологии трансплантации
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гетеротопическая трансплантация сердца мышей является важной доклинической моделью в исследованиях трансплантации. Трансплантация гетеротопического сердца шейки матки у мышей обладает явными преимуществами, включая прямой визуальный и ощупываемый мониторинг жизнеспособности трансплантата, снижение хирургической травмы и более быстрое послеоперационное восстановление. Таким образом, она стала всё более ценной платформой для изучения иммунологии трансплантации, особенно ценной для животных с тяжёлыми физиологическими состояниями из-за генетической модификации или индукции лекарств, а для экспериментов, требующих вторичной или комбинированной трансплантации органов, шейная область часто становится единственным возможным местом. Традиционные методы трансплантации шейной матки, будь то методы сквозного шва или с помощью манжет, требуют постоянной перевязки общей сонной артерии и наружной яремной вены реципиента, что может нарушить перфузию мозга и привести к появлением чужеродных веществ или гемодинамических нарушений. Чтобы устранить эти ограничения, в этой статье рассматривается усовершенствованная методика трансплантации шейного отдела сердца с использованием сосудистого анастомоза от конца к боку. Метод сохраняет общую сонную артерию и наружную яремную вену реципиента, поддерживая нормальную перфузию мозга и избегая осложнений, связанных с постоянной перевязкой сосуда. Этот протокол подробно описывает этапы от извлечения донорского сердца до анастомоза реципиента и послеоперационного ухода. Репрезентативные результаты демонстрируют высокий уровень успеха хирургического вмешательства (96,7%) и эффективность модели в изучении отторжения аллотрансплантата. Эта техника предлагает физиологически релевантную и технически доступную модель для исследователей в области иммунологии трансплантации.
Введение
За последние полвека иммунология трансплантации продолжает оставаться центральным направлением для иммунологов и специалистов по трансплантации. Сегодня трансплантация твердых органов широко применяется и является самым эффективным методом лечения терминальных стадий заболеваний органов. Однако отторжение трансплантата не было окончательно решено и до сих пор остаётся одним из главных препятствий при трансплантации и одной из главных причин потеритрансплантата 1. Следовательно, преодоление или смягчение отторжения, одновременно снижая или избегая системной иммуносупрессии, остаётся значительной задачей и ключевой целью исследований в этой области.
Модели трансплантации органов васкуляризированных животных, особенно мышиных, сыграли ключевую роль в развитии иммунологии трансплантации и стали важной научной основой для клиническогоперевода 2. Например, многие иммуносупрессивные препараты, используемые сегодня в клинической практике — такие как циклоспорин, такролимус и рапамицин — впервые были успешно валидированы в моделях трансплантациимышей 3,4.
Модель гетеротопической трансплантации сердца (ГТ) у мышей является одной из самых широко используемых доклинических моделей, предпочитаемой благодаря большому количеству доступных генетических штаммов и исследовательских реагентов, а также относительно простой процедуре и простому послеоперационному мониторингу. Таким образом, он служит ключевой платформой для изучения механизмов острого отторжения, индуцирования толерантности к иммунитету и оценки новых иммуносупрессантов invivo 5,6.
Первая гетеротопическая модель HT у мышей была создана Корри и др.7 в 1973 году. В этой модели донорское сердце помещается в брюшную полость реципиента, при этом трансплантатная аорта и легочная артерия (ПА) анастомозированы конец в сторону от брюшной аорты реципиента и нижней полой вены (IVC) соответственно. Этот метод оставался стандартной техникой для абдоминальной ГТ на протяжении десятилетий. Из-за необходимости учитывать сторонние аллотрансплантаты в исследованиях допусков был исследован второй участок для ГТ. Это привело к разработке шейных моделей ГТ у мышей, которые предлагают другие преимущества, такие как прямая визуальная оценка жизнеспособности трансплантата, меньшую хирургическую травму и снижение риска послеоперационнойинфекции 5,8,9. В 1991 году Чен и др.8 впервые описали модель гетеротопической HT шейки у мышей, включающую ручной анастомоз донорской аорты и ПА на общую сонную артерию (CCA) и наружную яремную вену (EJV) соответственно. Однако эта модель не получила широкого распространения из-за значительной технической сложности, вызванной серьёзным несоответствием между донорской аортой и реципиентом CCA, что делало сосудистый анастомоз крайне сложным.
Также в 1991 году Мацуура и др.9 ввели технику без шва манжет для сосудистого анастомоза в модели шейки матки HT. Этот метод упрощает процедуру, устраняя технически сложное ручное сосудистое шво, что облегчает её освоение. Впоследствии было сообщено о многочисленных технических доработках техникиманжеты 10,11. В настоящее время метод манжеты широко используется при ГТ шейки матки, особенно исследователями без опыта микрососудистого шва. Однако техника манжеты вводит искусственные материалы, которые могут вызывать локальное воспаление и мешать иммунологическим оценкам, а также создавать технические трудности в сосудах малогокалибра 5,6. Недавно Ляо и др.12 предложили метод без манжет рукава при шейной матке ГТ, при котором сосуды донора и реципиента непосредственно анастомозируются с помощью рукавного метода. Избегая искусственных материалов и учитывая мелкие сосуды, этот подход предоставляет физиологическую и воспроизводимую платформу для вторичной трансплантации сердца.
Тем не менее, как конец до конца, так и безшовные методы манжеты требуют постоянной перевязки односторонних CCA и EJV реципиента. Это нарушает одностороннее кровоснабжение центральной нервной системы в головном мозге, что может привести к неврологическим осложнениям, таким как нарушение направления игемиплегия 13,14,15. Кроме того, такие сквозные подходы могут привести к изменению гемодинамики, таким как высокоскоростные артериальные струи, и несут более высокий риск тромбоза и стеноза, что негативно влияет на долгосрочное выживание трансплантата. Кроме того, техника с манжетой также несёт врождённый риск тромбоза из-за наличия манжеты.
Чтобы устранить эти ограничения, мы применили усовершенствованную технику ручного шва от конца к боку, при которой восходящая аорта и ПА донора анастомозируются соответственно на CCA и EJV получателя. Этот метод сохраняет целостность и непрерывность основных шейных сосудов реципиента, тем самым поддерживая нормальную перфузию мозга и соблюдая принцип 3R (Замена, Редукция и Очищение) в исследованиях на животных. Используя эту методику, мы достигли успеха хирургического вмешательства примерно 96,7% (29/30, при этом только одна смерть от кровоизлияния). Осложнения, связанные с ишемией мозга, не наблюдались ни у одной из мышей-реципиентов после операции. Этот метод очень похож на стандартные модели брюшной полости и особенно подходит хирургам с опытом наложения сосудов для создания моделей ГТ шейки матки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Уход за животными соответствовал международным стандартам, и все процедуры проводились в Институте трансплантации органов, больнице Тунцзи, Медицинском колледже Тунцзи, Хуачжунском университете науки и технологий, Китай. Этическое одобрение исследования было получено Комитетом по этике животных больницы Тунцзи (номер одобрения: TJH-202310010). Соответствующие инструменты, используемые для исследования, перечислены в Таблице материалов.
1. Предоперационная подготовка
- Стерилизуйте операционную ультрафиолетовой лампой на 30 минут. Продезинфицируйте операционный стол 70% этанолом и автоклавуйте все хирургические инструменты (121 °C в течение 20 минут).
- Используйте взрослых самцов мышей C57BL/6 и BALB/c (весом 20–25 г; 8–10 недель). Для сингенной трансплантации используйте мышей C57BL/6 как доноров и реципиентов. Для аллогенной трансплантации используйте мышей BALB/c в качестве доноров и мышей C57BL/6 в качестве реципиентов.
- За час до операции введите мыши предоперационную анальгезию с помощью подкожной инъекции бупренорфина (0,05 мг/кг).
ПРИМЕЧАНИЕ: Донорской мыши не проводится предоперационная анальгезия, так как донор эвтаназируется сразу после процедуры удаления сердца. - Приготовьте раствор анестетика, содержащий кетамин (20 мг/мл) и ксилазин (2 мг/мл). Анестезия мыши подготовленной кетаминовой анестезией с помощью инъекции внутрибрюшника с объёмом дозы 5 мкл/г. Подтверждайте эффективность анестезии, наблюдая медленное и регулярное дыхание, потерю рефлекса выпрямления и отсутствие педального рефлекса.
- Побрить шерсть с грудной и брюшной областей. Закрепите мышь в положении на спине на грелке, чтобы поддерживать температуру тела. Дезинфицируйте место операции, чередуя повидон-йод и 70% этанола в течение трёх циклов. Удлините шею пациента, втянув верхние резцы вверх шелковой нитью 6-0 для оптимального экспозиции.
- Наденьте стерильные хирургические перчатки. Сделайте овальное отверстие, немного больше места разреза, на стерильной занавеске. Затем используй его, чтобы закрыть мышь-получатель.
2. Сбор донорского сердца
- Сделайте разрез по средней линии живота, затем поперечный (крестовидный) разрез, чтобы полностью открыть брюшную полость.
- Аккуратно отведите тонкий кишечник влево стерильным ватным тампоном, увлажнённым физиологическим раствором, чтобы обнажить брюшную аорту и IVC.
- Введите 0,3 мл гепаринизированного физиологического раствора (300 МЕ/мл) в IVC и подождите 1 минуту для системной гепаринизации. Перерезайте брюшную аорту и IVC для эксгвинации донора.
- Разрезать диафрагму вместе с передней стенкой грудной клетки, чтобы сделать U-образный разрез через грудную клетку с помощью ножниц, чтобы открыть грудную полость.
- Введите 2 мл холодного физиологического раствора (4 °C) в сердце через внутригрудный IVC, чтобы вывести остаточную кровь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Основная цель этого этапа — вызвать гипотермию и заставить сердце остановить учащённое биение. Вторая цель — тщательно вымыть кровь из сердца, особенно из коронарных артерий. - Накройте сердце кусочком стерильной марли, пропитанной холодным физиологическим раствором (4 °C). Мягкое опускание этой марли способствует оптимальному обнажению аорты и PA. Кроме того, марля, пропитанная холодным физиологическим раствором, поддерживает гипотермию трансплантата во время последующего вскрытия.
- Определить и изолировать внутригрудную ИВК. Перевязывайте швом 6-0 и перерезайте вдально от перевязки с помощью микроножниц.
- Определите и удалите тимус, чтобы обнажить дугу аорты и PA. Идентифицируйте и изолируйте верхнюю полую вену. Перевязывайте швом 6-0. Перерезайте его дистально от перевязки.
- Идентифицируйте и изолируйте восходящую аорту. Пересечьте аорту проксимально к номинантной артерии, чтобы увеличить длину сосуда.
- Определите и изолируйте PA. Пересечь его прямо вплотную к её раздвоению. Перевязать все сосуды позади сердца (лёгочные вены) шёлком 6-0. Аккуратно вырежьте сердце с помощью микроножниц.
- Аккуратно переместите сердце и погрузите его в холодный физиологический раствор (4 °C), поместите на лёд для хранения до пересадки.
3. Операция реципиента
- Изоляция сосуд-реципиента
- Сделайте продольный разрез диаметром 1 см с правой стороны шеи, простирающийся от верхней границы середины правой ключицы до нижней границы нижней нижней челюсти.
- Отрезать правую долю поднижнечелюстной железы. Перерезать правую грудино-ключо-сомышлевидную мышцу, чтобы создать достаточный карман для имплантации донорского сердца.
- Определите и выделите правильный EJV и правильный CCA. Мобилизуйте EJV, прижигая его ветви. Затем изолируйте CCA от окружающих тканей. Избегайте повреждения сопутствующего блуждающего нерва при вскрытии CCA.
- Артериальный анастомоз
- Одновременно окклюзируйте EJV и CCA двумя микрососудистыми зажимами, один из которых накладывается на краниальные концы обоих сосудов, другой — на хвостовых. Сначала приложите краниальный зажим, затем хвостовый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микрососудистые зажимы предпочтительно вводятся справа от мыши слева, при этом ручки зажима располагаются справа. Такое расположение способствует последующему сосудистому анастомозу и помогает снизить сжатие трахеи. - Поверните мышь на 90° по часовой стрелке. Сделайте продольный разрез на ККА, убедившись, что длина совпадает с диаметром восходящей аорты донора. Промыйте просвет гепаринизированным физиологическим раствором, чтобы тщательно удалить остатки тромбов.
- Для создания анастомотического окна используйте шов 11-0. Пропустите иглу через стенку сосуда на расстоянии, примерно равном диаметру донорского сосуда, аккуратно поднимите стенку сосуда швом и затем вырежьте небольшой участок микроножницами.
- Поместите донорское сердце в шейный карман. Закрепите восходящую аорту донора к реципиенту CCA, наложив два шва 11-0 с иглами на проксимальных и дистальных концах. Разместите донорское сердце справа от реципиента и накройте его влажной стерильной марлей.
- Используя дистальный шов, выполните непрерывный шов на задних стенках в направлении от дистального до проксимального направления с помощью 6–8 швов.
- После завершения задней стенки шва поверните мышь на 180°. Отразите сердце донора слева от реципиента и накройте его влажной стерильной марлей. Завершите анастомоз, зашивая передние стенки сосудов в проксимально-дистальной стороне 6–8 швов. Промите просвет физиологическим раствором перед тем, как завязать последний узел, чтобы удалить воздушные пузырьки.
- Одновременно окклюзируйте EJV и CCA двумя микрососудистыми зажимами, один из которых накладывается на краниальные концы обоих сосудов, другой — на хвостовых. Сначала приложите краниальный зажим, затем хвостовый.
- Анастомоз вена
- Сделайте продольный разрез на EJV, соответствующий диаметру донорской PA. Промыйте просвет гепаринизированным физиологическим раствором, чтобы тщательно удалить остатки тромбов.
- Закрепите донорскую ПА к реципиенту EJV, наложив два шва 11-0 с иглами на проксимальный и дистальный концы.
- Используя проксимальный шов, непрерывно накладываете швы на задние стенки в проксимально-дистальном направлении 5–7 швами.
- Продолжайте с тем же швом, чтобы закрыть передние стенки снаружи в дистальном или проксимальном направлении 5–7 петельями. Завяжите шов на проксимальной вершине. Промите просвет физиологическим раствором перед тем, как завязать последний узел, чтобы удалить воздушные пузырьки.
- Реперфузия
- Сначала освободите дистальный зажим, затем проксимальный зажим, чтобы начать реперфузию. После реперфузии сердечный трансплантат должен сразу покраснеть. Нормальный ритм и схватки обычно восстанавливаются в течение 1–2 минут.
- После подтверждения гемостаза аккуратно разместите сердечный трансплантат в подкожном кармане, чтобы избежать перекрута сосудов. Закройте кожный разрез швами 5-0.
- Послеоперационный уход
- Поместите мышь в чистую клетку и поставьте её в инкубатор для младенцев с температурой 34 °C для облегчения восстановления. Следите за мышью каждые 1–2 часа, пока она не проснётся спонтанно, затем возвращайте её в клетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное прогревание необходимо для предотвращения дыхательной подавления, вызванной гипотермией, и для облегчения восстановления после анестезии. - Вводите послеоперационную анальгезию с помощью подкожной инъекции бупренорфина (0,05 мг/кг) каждые 12 часов в течение первых 48 часов после операции.
- Ежедневно отслеживайте пульсации сердечного трансплантата и фиксируйте его выживаемость.
- Поместите мышь в чистую клетку и поставьте её в инкубатор для младенцев с температурой 34 °C для облегчения восстановления. Следите за мышью каждые 1–2 часа, пока она не проснётся спонтанно, затем возвращайте её в клетку.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Было проведено тридцать случаев с использованием этой модифицированной модели; Процент успешности операции составил 96,7% (29/30). Только одна смерть произошла из-за интраоперационного кровоизлияния. Оставшиеся 29 случаев были включены для анализа времени операции и результатов трансплантации. Осложнения, связанные с ишемией мозга, не наблюдались ни у одного реципиента после операции. Сбор донорского сердца был завершён за 6,4 ± 0,7 минуты, а операция реципиента — за 28,7 ± 1,2 минуты. В...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Модель шейного ГТ с использованием метода анастомоза от конца к боку обладает рядом преимуществ. По сравнению с методом сквозного шва или методом манжеты, этот подход полностью сохраняет непрерывность CCA и EJV, тем самым сохраняя нормальную гемодинамику мозга и эффективно избегая осложнений, связанных с ишемией мозга. Конечно-боковой анастомоз также избегает технических сложностей, вызванных несоответствием диаметров сосудов донора и реципиента. По сравнению с абдоминальной ГТ, этот мет...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81700571).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1mL шприц | Becton Dickinson Medical Devices Co., Ltd | B309628 | |
| Иглы для швов 11-0 | Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | H1101 | Для сосудистой анастомозы |
| 3mL шприц | Becton Dickinson Medical Devices Co., Ltd | B309657 | |
| Иглы для швов 5-0 | Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | CR537 | Для закрытия кожи |
| Шелковый шов 6-0 | Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 2650182 | |
| Каuter для остановки кровотечения | Ningbo Shunye Medical Co., Ltd. | BDD-YE-DT-1 | |
| Бупренорфин | Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Pharmaceutical Co., Ltd | H12020275 | Обезболивающее |
| Ватные палочки | Fuqing Health & Integral Medical | 20230R | |
| Изогнутые микроклещи | RWD life Science Co. | F11031-11 | Хирургический инструмент |
| Изогнутые микроножницы | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 54108B | Хирургический инструмент |
| Марлевые бинты | Yubei Medical Materials Co., LTD | 21080274 | |
| Гепариновый натрий (инъекция) | North China Pharmaceutical Co., LTD | 2101131-2 | |
| Микроклещи | World Precision Instruments Co., Ltd. | 555408NT | Хирургический инструмент |
| Микроклип для сосудов | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5481T | |
| Накладка для микроклипа для сосудов | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5480 | |
| Клещи для иглы | RWD life Science Co. | F31025-13 | Закрытие живота |
| Соль | Zhejiang Tianrui Pharmaceutical Co.,Ltd | 716092103 | |
| Прямые микроклещи | RWD life Science Co. | F11029-11 | Хирургический инструмент |
| Хирургический микроскоп | Leica | M650 | |
| Хирургическая платформа | Индивидуальный, магнитный | ||
| Тканевые клещи | RWD life Science Co. | F12002-12 | Хирургический инструмент |
| Ножницы для тканей | RWD life Science Co. | S12003-09 | Хирургический инструмент |
Ссылки
- Slepicka, P. F., Yazdanifar, M., Bertaina, A. Harnessing mechanisms of immune tolerance to improve outcomes in solid organ transplantation: a review. Front Immunol. , (2021).
- Cravedi, P., et al. Advancing mouse models for transplantation research. Am J Transplant Off J Am Soc Transplant Am Soc Transpl Surg. , (2024).
- McDaid, J., et al. The utility of animal models in developing immunosuppressive agents. Eur J Pharmacol. , (2015).
- Guo, Y., et al. Efficacy of single-agent immunosuppressive regimens in a murine model of vascularized composite allotransplantation. Transpl Int Off J Eur Soc Organ Transplant. , (2020).
- Alegre, M. L., et al. Best practices of heart transplantation in mice. Am J Transplant Off J Am Soc Transplant Am Soc Transpl Surg. , (2025).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. J Invest Surg. , (2013).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. , (1973).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. , (1991).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. , (1991).
- Fukunaga, N., Bissoondath, V., Rao, V. Submandibular gland-preserving technique for heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. , (2018).
- Fukunaga, N., Bissoondath, V., Rao, V. Custom-made clamp facilitating stabilization of cuffs in murine heterotopic cervical heart transplantation. Transplantation. , (2019).
- Liao, M., Liu, K., Riella, L. V., Borges, T. J. Cuff-free suture-based cervical model for secondary heterotopic heart transplantation to evaluate donor-specific immune tolerance in mice. J Vis Exp JoVE. , (2026).
- Comi, A. M., et al. Impact of age and strain on ischemic brain injury and seizures after carotid ligation in immature mice. Int J Dev Neurosci. , (2009).
- Ratschiller, T., et al. Heterotopic cervical heart transplantation in mice. J Vis Exp Jove. , (2015).
- Struys, T., et al. In vivo evidence for long-term vascular remodeling resulting from chronic cerebral hypoperfusion in mice. J Cereb Blood Flow Metab Off J Int Soc Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Dun, H., et al. Cervical heterotopic heart transplantation in mice using a novel suture technique. JHLT Open. , (2025).
- Li, W., et al. Mouse heterotopic cervical cardiac transplantation utilizing vascular cuffs. J Vis Exp. , (2022).
- Lin, C. H., et al. The neck as a preferred recipient site for vascularized composite allotransplantation in the mouse. Plast Reconstr Surg. , (2014).
- Wang, Q., Liu, Y., Li, X. K. Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. , (2005).
- Gu, X., et al. Improved cuff technique for cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. , (2007).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , (2014).
- Li, Y., et al. A highly reproducible cervical cuff technique for rat-to-mouse heterotopic heart xenotransplantation. Xenotransplantation. , (2017).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Exp Clin Transplant Off J Middle East Soc Organ Transplant. , (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
