Капсулы с пятью вкусами Sophora flavescens с кишечной оболочкой облегчают экспериментальный колит и изменения, связанные с ферроптозом

Краткое содержание

В мышиной модели язвенного колита пятивкусные капсулы Sophora flavescens с кишечной оболочкой облегчали повреждения толстой кишки и улучшили окислительный стресс, дисбаланс воспалительных цитокинов, сигнализацию JAK2/STAT3 и изменения маркеров, связанных с ферроптозом.

Аннотация

Язвенный колит остаётся сложным в лечении, поскольку эффективные и целенаправленные терапевтические методы ограничены, а окислительный стресс, воспалительные сигналы и регулируемые пути гибели клеток могут способствовать повреждению слизисты. В этом исследовании оценивалось, облегчают ли капсулы с кишечной оболочкой (FSEC) капсулы Sophora flavescens с пятью вкусами при экспериментальном колите и исследовали связанные изменения в окислительном стрессе, воспалении и маркерах ферроптоза. Была установлена мышиная модель язвенного колита с использованием циклического воздействия 2,5% декстрансульфата натрия в сочетании с альфа-вызовом фактора некроз опухоли. Мышей лечили низкой, средней или высокой дозой FSEC или антагонистом TLR4 CRX-526 как положительное контрольное вмешательство. Гистопатология толстой кишки оценивалась с помощью окрашивания гематоксилином и эозином. С помощью биохимических тестов измерялись уровни супероксид-дисмутазы, каталазы, глутатиона, миелопероксидазы и Fe²⁺. Цитокины ткани толстой кишки были количественно оценены с помощью ферментно-связанного иммуносорбентного анализа, экспрессия JAK2 и STAT3 — с помощью иммуногистохимии, а экспрессия GPX4, FTH1 и ACSL4 — с помощью вестерн-блоттинга. Лечение FSEC снизило повреждения слизистой оболочки толстой кишки и инфильтрацию воспалительных клеток, повысило антиоксидантные индексы и снизило уровень миелопероксидаз. FSEC также снизил уровни TNF-α и IL-1α, частично восстановил уровень IL-13 и был связан с ослаблением иммунного окрашивания JAK2 и STAT3. Параллельно FSEC улучшил изменения маркеров, связанных с ферроптозом, включая снижение уровней Fe²⁺ и ACSL4, а также повышение экспрессии GPX4 и FTH1. Эти результаты свидетельствуют о том, что FSEC облегчает экспериментальный язвенный колит у мышей, по крайней мере частично, улучшая статус окислительного стресса, смягчая воспалительную сигнализацию и восстанавливает профиль маркеров, связанных с ферроптозом.

Введение

Язвенный колит (UC) — это хроническое воспалительное заболевание, которое в первую очередь поражает слизистую слизистую оболочку толстой кишки и прямой кишки, характеризуется повторяющимися эпизодами воспаления слизисты, язвами и нарушением барьерной^{функции 1,2,3}. Хотя генетическая восприимчивость, факторы окружающей среды, дисфункция эпителиального барьера и иммунная дисрегуляция связаны с патогенезом UC, механизмы, лежащие в основе устойчивого повреждения слизисты, остаются неполностью изучены. Современные фармакологические методы, включая аминосалициляты, кортикостероиды, иммуносупрессанты и биологические препараты, могут снижать активность заболевания у многих пациентов; однако их клиническое применение может быть ограничено рецидивом после прекращения лечения, побочными эффектами, высокой стоимостью и неполными терапевтическими^{реакциями 3}.

Ферроптоз, железозависимая форма регулируемой клеточной смерти, характеризующаяся перекислением липидов и изменением обмена железа, всё чаще связывается с воспалениями кишечника и повреждением эпителия, связанного с^UC 4,5,6,7,8. Параллельно традиционные формулы китайской медицины привлекают всё большее внимание как дополняющие подходы к лечению УК благодаря их многоцелевому терапевтическому^{потенциалу 9}.

Капсулы с пятью вкусами Sophora flavescens с кишечной оболочкой (FSEC) клинически применяются для лечения лёгкого и умеренного активного УК в традиционной китайской медицине. Предыдущие исследования показывают, что FSEC может улучшать симптомы UC с помощью многокомпонентных и многоцелевых^{механизмов 10}. Однако влияние FSEC на окислительный стресс, воспалительную сигнализацию, активность JAK2/STAT3 и изменения, связанные с ферроптозом, остаются недостаточно охарактеризованными.

Окислительный стресс и воспалительные сигналы являются важными факторами повреждения слизистой кишечника при UC. Чрезмерное образование реактивных видов кислорода может нарушать целостность эпителия, способствовать проникновению воспалительных клеток и ухудшать антиоксидантную защиту. Пути, опосредованные цитокином, такие как сигнализация JAK2/STAT3, способствуют воспалительной амплификации и повреждению^тканей 11,12,13,14,15. Кроме того, окислительный стресс и ферроптоз тесно связаны через изменения антиоксидантной защиты, обмен железа и перекисление^{липидов} 16,17,18,19,20. Таким образом, одновременная оценка индексов оксидативного стресса, воспалительных цитокинов, сигнальных сигналов JAK2/STAT3 и маркеров, связанных с ферроптозом, может дать более полное понимание повреждений слизисты и терапевтических реакций при экспериментальных UC.

В настоящем исследовании была использована модель мышей с циклическим декстранным сульфатом натрия и фактором некроза опухолей альфа-испытанием для оценки эффектов низкой, средней и высокой дозы FSEC. Ключевой методологической достоинственностью этого дизайна является интеграция гистопатологической оценки с измерением индексов окислительного стресса в сыворотке, цитокинов ткани толстой кишки, иммуногистохимии JAK2/STAT3 и анализа вестерн-блот белков, связанных с ферроптозом, в единой экспериментальной рамке. Этот подход был использован для определения, облегчает ли FSEC экспериментальный UC, а также для характеристики связанных изменений в окислительном стрессе, воспалительном сигнале и профилях маркеров, связанных с ферроптозом. Общий экспериментальный дизайн и аналитический рабочий процесс изложены на рисунке 1.

Рисунок 1: Экспериментальный рабочий процесс мышиной модели и дальнейший анализ .Хронический экспериментальный язвенный колит был вызван циклическим воздействием 2,5% декстрансульфата натрия (DSS) в сочетании с вызовом фактора некроз опухоли альфа (TNF-α) в последнюю неделю экспериментального протокола. Мыши были распределены в группах нормального контрольного, модельного, низкодозового FSEC, среднедозированного FSEC, высокодозового FSEC и положительного контроля CRX-526. FSEC вводилась внутрижелудочной гаваней в дозах 108, 216 или 432 мг/кг массы тела. CRX-526 использовался как положительное контрольное вмешательство. После окончательной обработки были собраны образцы для гистопатологической оценки, биохимических анализов, связанных с окислительным стрессом, анализа цитокинов с помощью ELISA, иммуногистохимии и анализа западного блота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Протокол

Все процедуры на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по защите животных и этике Медицинского колледжа Наньчан (одобрение No NY2SC 20250407). Все эксперименты проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных. Химикаты, реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Животные и лечение

В этом исследовании использовались самцы мышей C57BL/6J (дикого типа, 8 недель). Животных содержали в стандартных лабораторных условиях с контролируемой температурой и влажностью, а также им предоставлялся свободный доступ к корму и воде. После акклиматизации хронический колит вызывался при трёх циклах введения 2,5% декстрансульфата натрия (DSS) в питьевой воде. Каждый цикл длился 1 неделю и разделялся двухнедельным периодом восстановления с обычной питьевой водой. В последнюю неделю экспериментального протокола мыши из модельной и лечебной групп получали фактор некроза опухолей альфа (TNF-α; 10 мкг/100 г массы тела, два раза в день) через внутрижелудочный гаваж для дальнейшего усугубления повреждений толстой кишки. Обычные управляющие мыши получали только транспортные средства и не подвергались воздействию DSS или TNF-α.

Пятивкусные капсулы Sophora flavescens с кишечной оболочкой (FSEC) использовались как коммерчески доступное, одобренное китайское патентное лекарство. В состав входили Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f. и Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. Содержимое капсул из той же производственной партии взвешивалось и суспензировалось в стерильной дистиллированной воде для подготовки свежих дозировочных суспензий перед введением. Подвески тщательно смешивались перед каждым гавэжем для равномерного распределения. Источник продукта, номер одобрения, фармацевтические спецификации и информация о контроле качества приведены в Таблице материалов. Качество продукции описывалось в соответствии с утверждённой фармацевтической спецификацией и информацией, предоставленной производителем, включая спецификации капсул, внешний вид, требования к выбросу кишечника и распаду, требования к микробным лимитам и стандарты контроля качества.

Мыши, лечащиеся FSEC, получали низкие дозы FSEC (108 мг/кг массы тела), среднюю дозу FSEC (216 мг/кг массы тела) или высокие дозы FSEC (432 мг/кг массы тела) путём внутрижелудочной гаваджи дважды в день в последнюю неделю моделирования. Уровни дозы выбирались на основе утверждённой клинической дозы, преобразования поверхности тела и площади и предварительных параметров диапазона дозы. Обработанные с помощью транспортных средств мыши получали такой же объём стерильной дистиллированной воды через внутрижелудочную вентиляцию.

Положительная контрольная группа получила антагонист TLR4 CRX-526 в дозе 1 мг/кг путём инъекции в хвостовую вену в последнюю неделю моделирования. CRX-526 использовался в качестве эталонного противовоспалительного вмешательства. В исследование было включено шесть групп (n = 6 на группу): нормальная контрольная, модельная, низкодозовая FSEC, средняя доза FSEC, высокодозовая FSEC и положительные контрольные группы CRX-526. Мышей приносили в жертву через 24 часа после последнего лечения. Эвтаназия проводилась путем вывиха шейки матки под анестезией изофлурана, в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных.

2. Гистологическая оценка с помощью окрашивания гематоксилина и эозина

Ткани толстой кишки были собраны из наиболее поражённой макроскопически области между анусом и илеоцекальной областью. Для каждой мыши один представительный сегмент толстой кишки из этого региона фиксировался в 10% нейтральном буферном формалине, вложенный в парафин, секционированный и окрашенный гематоксилином и эозином. Для гистологической оценки из каждого животного было подготовлено не менее трёх срезов, а в каждом секции изучалось пять неперекрывающихся полей высокой мощности. Поля систематически выбирались случайным образом, сканируя срез от одного края до другого, избегая порванных, сложенных или плохо окрашенных участков. Гистопатологические изменения, включая слизистое язвообразование, разрушение желез, заложенность и инфильтрацию воспалительных клеток, оценивались с помощью световой микроскопии.

3. Измерение биохимических показателей, связанных с окислительным стрессом

Образцы крови (0,5 мл) были собраны в пробирки с антикоагулянтами и центрифугированы при примерно 1160 × г в течение 10 минут при 4 °C. Супернатант был собран и использован для измерения уровней железа в сыворотке, супероксиддисмутазы (SOD), глутатиона (GSH), каталазы (CAT) и миелопероксидазы (MPO) с помощью соответствующих тестовых наборов, указанных в Таблице материалов, согласно инструкциям производителя.

4. Иммуногистохимический анализ JAK2 и STAT3

Срезы ткани толстой кишки, вложенные в парафин (5 мкм), депарафинизовались в ксилоле, регидратировались через серию градуированных этанолов и промывались фосфатно-буферным физиологическим раствором. Извлечение антигена проводилось в буфере цитратов (pH 6,0) с использованием микроволнового нагрева. После охлаждения до комнатной температуры активность эндогенной пероксидазы блокировалась с 3% H₂O₂ на 10 минут. Срезы блокировались 5% нормальной козьей сывороткой на 30 минут при комнатной температуре и инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами к JAK2 и STAT3 при разбавлении 1:50 и 1:80 соответственно. После промывания солевого раствора с буфером фосфатом секции инкубировали вторичным антителом, конъюгированным пероксидазой хрена, согласно инструкциям производителя. Иммунореактивные сигналы визуализировались с помощью 3,3′-диаминобензидина, а ядра противократно окрашивались гематоксилином. Секции были обезвожены, установлены и осмотрены под световым микроскопом.

5. Квантификация цитокинов с помощью ферментно-связанного иммуносубербента

Ткани толстой кишки были разрезаны на 2–3 мм³ части, гомогенизированы на льду в фосфатно-буферном физиологическом растворе и центрифугированы при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C. Был собран супернатант, а концентрации TNF-α, IL-1α и IL-13 измерены с помощью соответствующих комплектов ELISA согласно инструкциям производителя. Значения поглощения измерялись с помощью считывателя микропластин, а концентрации цитокинов рассчитывались по стандартным кривым, полученным для каждого анализа.

6. Вестерн-блот-анализ белков, связанных с ферроптозом,

Из тканей толстой кишки извлекали полные белки, а концентрации белков определялись с помощью анализа на бицинхониновую кислоту. Равные количества белка из каждого образца отделялись SDS-PAGE и передавались на мембраны. После блокировки 5% обезжиренным молоком или эквивалентным блокирующим буфером в течение 2 часов при комнатной температуре мембраны инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против GPX4, FTH1, ACSL4 и белка контроля нагрузки β-актина, как указано в Таблице материалов. На следующий день мембраны были промыты и инкубированы соответствующим вторичным антителом, конъюгированным пероксидазой хрена, в течение 2 часов при комнатной температуре. Белковые полосы визуализировались с помощью хемилюминесцентного субстрата и сфотографировались с помощью системы хемилюминесцентной визуализации. Интенсивность полос была количественно измерена с помощью программного обеспечения для денситометрии. Уровни экспрессии GPX4, FTH1 и ACSL4 были нормализованы до β-актина, а относительная экспрессия белков рассчитана для статистического анализа.

7. Статистический анализ

Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Сравнения между несколькими группами проводились с помощью одностороннего анализа дисперсии, затем последовал пост-хок тест Бонферрони, когда были выполнены предположения нормальности и однородности дисперсии. Значение P < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

FSEC облегчает гистопатологические повреждения и улучшает показатели, связанные с окислительным стрессом, у мышей с язвенным колитом
Как показано на рисунке 2, нормальная контрольная группа демонстрировала целостную слизистую структуру толстой кишки, хорошо организованные железы и минимальную инфильтрацию воспалительных клеток. В отличие от этого, модельная группа демонстрировала тяжёлое повреждение слизистой оболочки, характеризующееся н...

Обсуждение

В этом исследовании изучались эффекты капсул с пятью ароматами Sophora flavescens с кишечной оболочкой (FSEC) на мышиную модель экспериментального язвенного колита (UC) и оценили связанные изменения в индексах, связанных с окислительным стрессом, воспалительных цитокинох, сигнализации JAK2/STAT3 и маркерах, связанных с ферроптозом. Основные результаты заключались в том, что лечение FSEC облегчило гистопатологическое повреждение толстой кишки, улучшило биохимические индексы, связ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
3,3′-Диаминобензидин (DAB) субстратный набор	ZSGB-BIO	ZLI-9018	Хромогенный субстрат для иммуногистохимии на основе HRP.
Антитela ACSL4 (F-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365230	Первичное мышиное моноклональное антитело для вестерн блота; используется в разбавлении 1:500; RRID: AB_10842002.
Решение для восстановления антигена, буфер цитратный, pH 6,0	Beyotime Biotechnology	P0081	Буфер для восстановления антигенных эпитопов путем нагревания для иммуногистохимии на парфиновых секциях.
Комплект для определения количества белка BCA	Beyotime Biotechnology	P0012	Количественное определение белка перед вестерн блотом.
Мыши C57BL/6J	Fujian Anburui Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Самцы SPF, возраст 8 недель; источник животных соответствует предоставленным материалам этики.
Комплект для определения активности каталазы (CAT)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1	Колориметрический набор для измерения активности CAT в сыворотке.
Иммунохимическая система анализа ChemiDoc XRS+	Bio-Rad Laboratories	1708265	Система хемилюминесцентного анализа для выявления вестерн блота.
CRX-526	TargetMol	T27090	Антагонист TLR4, используемый в качестве положительной контрольной интервенции; CAS № 245515-64-4.
Декстрансульфат натрия (DSS), степень колиита	MP Biomedicals	160110	DSS, степень колиита, молекулярная масса 36000–50000 Да; используется в концентрации 2,5% в питьевой воде.
ECL хемилюминесцентный субстрат	Bio-Rad Laboratories	1705061	Clarity Western ECL субстрат для обнаружения вестерн блота на основе HRP.
Набор для ELISA, мышь IL-13	Abcam	ab219634	Колориметрический набор для количественного определения IL-13 мыши; считывание на 450 нм.
Набор для ELISA, мышь IL-1α	Abcam	ab199076	Колориметрический набор для количественного определения IL-1α мыши; считывание на 450 нм.
Набор для ELISA, мышь TNF-α	Abcam	ab208348	Колориметрический набор для количественного определения TNF-α мыши; считывание на 450 нм.
Абсолютный этанол	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Используется для обработки тканей, дегидратации и приготовления реагентов.
Комплект для определения содержания железа (Fe2+)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A039-2-1	Колориметрический набор для определения содержания Fe2+ в сыворотке или тканевых образцах.
Энтеросорбирующие капсулы пятикомпонентного культивированного софоры	Beijing Zhonghui Pharmaceutical Co., Ltd.	Номер утверждения NMPA Z20150002	Китайская патентная медицина; 0,4 г/капсула; формулировка включает софору культурную, землянику, индиго натуральное, белянку пятнистую и glycyrrhiza uralensis; фармацевтическая спецификация YBZ00152015
Комплект для определения содержания глутатиона (GSH)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A006-2-1	Набор для определения содержания глутатиона для измерения GSH в сыворотке.
Антитela GPX4 (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166570	Первичное мышиное моноклональное антитело для вестерн блота; используется в разбавлении 1:500; RRID: не указан в данных поставщика.
Набор для окрашивания гематоксилином и эозином	Solarbio	G1120	Окрашивание H&E парфиновых секций ткани толстой кишки.
Конъюгат антител козьих против мышиных IgG с лошадиной пероксидазой	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	Вторичное антитело для вестерн блота; используется в разбавлении 1:50000; RRID: AB_631736.
Программное обеспечение ImageJ	National Institutes of Health	Версия 1.54	Программное обеспечение для анализа изображений и денситометрии, используемое для количественного определения полос вестерн блота.
Набор для выявления иммуногистохимии	ZSGB-BIO	PV-9000	Половинно-основанный набор HRP для иммуногистохимии на парфиновых секциях.
Антитela JAK2 (D2E12)	Cell Signaling Technology	3230	Кроличное моноклональное первичное антитело для иммуногистохимии JAK2 на парфиновых секциях; RRID: AB_2128522.
Микроплитный анализатор	BioTek Instruments	Synergy H1	Анализатор микроплиты для измерения абсорбции ELISA на 450 нм.
Комплект для определения активности миелопероксидазы (MPO)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A044-1-1	Колориметрический набор для измерения активности MPO в сыворотке.