Формирование органоидных структур островков, полученных из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, из свежей ткани поджелудочной железы

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (BMSC) в органоидные структуры с островков поджелудочной железы с использованием лизата свининой ткани поджелудочной железы. Органоидоподобные структуры формируются через 22 дня. Этот простой и экономичный метод формирует структуры, морфологически схожие с островками поджелудочной железы для экстракорпоральных исследований и скрининга лекарств.

Аннотация

Как распространённое хроническое заболевание по всему миру, сахарный диабет (СД) характеризуется нарушением баланса глюкозы в организме. При сахарном диабете 1 типа (ТД1) аутоиммунные ответы полностью разрушают β-клетки поджелудочной железы, что приводит к полной недостаточности инсулина. Пациентам с этим заболеванием требуется пожизненное дополнительное лечение инсулином. Данное исследование направлено на создание надёжной и экономичной платформы для создания органоидных структур островков поджелудочной железы из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (BMSC). Эта платформа может не только облегчить нехватку донорских островков для трансплантации, но и служить моделлю in vitro для исследований, связанных с диабетом.

Оптимизировав процесс приготовления лизата свининской поджелудочной ткани (центрифугирование при 12 000 об/мин в течение 30 минут при 4 °C, затем фильтрация 0,22 мкм для стерилизации), BMSC были успешно индуцированы для дифференцировки в органоидоподобные структуры островков поджелудочной железы. Морфологическая валидация подтвердила, что только индуцированные BMSC образуют компактные, пухлые и высокопрозрачные островкообразные заполнители, тогда как неиндуцированные BMSC демонстрируют значительную вакуолизацию и снижение прозрачности.

Динамический мониторинг показал, что клеточные агрегаты (диаметром 50–100 мкм) образуются на 16-й день культуры и к 22-му дню превращаются в капсуловидные структуры (диаметром 200–300 мкм). Этот метод прост в эксплуатации, экономичен и не требует сложного оборудования. Полученные органоиды морфологически схожи с поджелудочными островками, что служит инструментом для исследований in vitro и сопутствующего скрининга на наркотики.

Введение

В качестве трёхмерных (3D) in vitro моделей органоидоподобные структуры островков поджелудочной железы стали ключевыми инструментами в исследованиях диабета и регенеративной медицине, благодаря своей способности близко имитировать многоклеточный состав и пространственную структуру естественных островков поджелудочной^{железы 1}. Такие модели не только предоставляют уникальную платформу для понимания биологии развития островков и патологических механизмов^{диабета 2,3}, но и поддерживают разработку терапии замещения клеток и систем скрининга^{лекарств 4}. С учётом роста глобальной распространённости диабета — особенно абсолютного дефицита инсулина, вызванного необратимым повреждением β-клеток при диабете 1 типа — традиционная заместительная терапия инсулином может контролировать симптомы, но не может излечить заболевание. Тем временем трансплантация островков сталкивается с острой нехваткой доноров, что делает развитие масштабируемых альтернативных источников островков^{приоритетом 1,5}. Используя направленный потенциал дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток или взрослых стволовых клеток, органоидно-подобная технология островков поджелудочной железы может помочь решить это ^{ограничение 6,7,8}.

В последние годы был достигнут значительный прогресс в системах культуры, похожих на органоидные островки поджелудочной железы, основанные на человеческих эмбриональных стволовых клетках (hESC) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC^). Множество исследований подтвердили, что оптимизируя индукционные протоколы и условия культуры, стволовые клетки могут дифференцироваться в островкообразные клетки с функциями секреции инсулина, чувствительными к^{глюкозе. 10}. Прорывы в технологиях химического перепрограммирования позволили создавать hiPSC без генетической манипуляции, что повысило трансляционный^{потенциал 11}. С точки зрения систем культуры, 3D-культура в сочетании с специфическими комбинациями внеклеточного матрикса и факторов роста может способствовать самоорганизации клеток-предшественников островков в органоидные структуры, состоящие из α, β и δ^{клеток 12}. Тем не менее, существующие технологии по-прежнему сталкиваются с множеством проблем, включая нестабильную эффективность дифференцировки, недостаточную функциональную зрелость и отсутствие сосудистых сетей и иммунной микросреды — ключевые ограничивающие^{факторы 13} , ограничивающие более широкое применение.

Несмотря на достижения в исследованиях органоидной структуры островков поджелудочной железы, в этой области остаются несколько критически важных научных вопросов¹⁴. Во-первых, отсутствие стандартизированных определений органоидов и процедур построения затрудняет прямое сравнение результатов в разных^{лабораториях 15}. Во-вторых, современные системы культуры не могут полностью воспроизвести сложный клеточный состав и точное пространственное расположение родных островков^{поджелудочной железы 16}. В-третьих, основные проблемы, такие как функциональная стабильность при длительной культуре органоидов и выживаемость после трансплантации, остаются недостаточно^{изученными 17}. Кроме того, большинство существующих протоколов по-прежнему используют матричные материалы животного происхождения, которые страдают от неопределённого состава и больших вариаций от партий к партии, что затрудняет контроль качества в^{клинических приложениях 18}. Эти знания и технические пробелы серьёзно затрудняют перевод органоидных структур островков поджелудочной железы из фундаментальных исследований в клиническую практику.

Этот протокол предназначен для создания стабильного, доступного и повторяемого подхода к созданию органоидных конструкций на островках поджелудочной железы с использованием мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (BMSC). Установленный метод предназначен для лабораторных экспериментальных исследований и доклинического скрининга лекарственных средств. Текущие стратегии дифференцировки островков, вызванных BMSC, страдают от множества ограничений, включая чрезмерные затраты, непоследовательные операционные стандарты и ограниченную применимость. Большинство существующих индукционных систем опираются на дорогостоящие рекомбинантные цитокины, профессиональные культурные матрицы и высокоточные устройства для культурирования, что значительно ограничивает их широкое применение. Для решения этих недостатков в настоящем протоколе в качестве основного индукционного фактора используется лизат свининской ткани поджелудочной железы. Эта оптимизированная и упрощённая стратегия выращивания позволяет эффективно дифференцировать BMSC на островчатые структуры с использованием рутинного лабораторного оборудования и условий.

По сравнению с традиционными методами, основанными на hESC, iPSC или коктейлях с высокой стоимостью факторов роста, нынешняя стратегия обладает несколькими заметными практическими преимуществами. Это устраняет необходимость в дорогих реагентах и сложных установках культуры, снижает экспериментальные затраты и обеспечивает стабильные результаты с минимальной межпартийной вариативностью⁽10,11,12,13). В отличие от систем на основе ксеногенной матрицы, этот протокол использует упрощённый тканевой лизат, что улучшает экспериментальную управляемость и воспроизводимость в^{лабораториях 15, 16, 17, 18}. Кроме того, BMSC легко доступны, устойчивы в культуре и не имеют этических ограничений, связанных с плюрипотентными стволовыми клетками, что делает этот подход особенно подходящим для рутинного лабораторного использования.

Существующие исследовательские подходы в области моделирования органоидов поджелудочной железы поляризованы: передовые платформы для клинической трансформации являются дорогими и технически сложными, тогда как упрощённые альтернативные модели не поддерживают глубокий функциональный анализ. Протокол, предложенный в этой работе, устраняет этот исследовательский разрыв, предлагая стандартизированную промежуточную техническую схему. Этот подход сохраняет основные физиологические свойства островков поджелудочной железы и полностью совместим с традиционными лабораторными условиями. Он служит практическим инструментом для исследователей, специализирующихся на механизмах развития островков, моделировании диабетических заболеваний и предварительной оценке кандидатов на лекарства, особенно для команд, оснащённых рутинной инфраструктурой для культивирования клеток, но не имеющих профессиональных платформ для культуры стволовых клеток. Хотя этот метод не может генерировать полностью васкуляризированные или иммунологически компетентные органоиды для конкретных передовых исследований, он хорошо подходит для предварительного экспериментального скрининга, механистических исследований и академической подготовки в области биологических исследований островков.

Эта работа направлена на создание экономичной и стандартизированной системы культурирования органоидных структур островков поджелудочной железы, с целью предложить достоверную трёхмерную модель исследований для исследований, связанных с диабетом. Систематически анализируя, как разнообразные режимы индукции и культурные среды влияют на эффективность формирования органоидов и морфологические особенности, это исследование пытается преодолеть основные технические препятствия, ограничивающие прогресс в этой области. Основные исследовательские цели охватывают три ключевых аспекта: создание универсального протокола культуры, применимого к обычным базовым лабораториям без сложных инструментов, разработку количественных стандартов оценки для оценки качества органоидов и оптимизацию стратегий культуры для поддержания морфологической и функциональной стабильности органоидов в долгосрочной инкубации. Результаты этого исследования могут предоставить прочную техническую поддержку для экспериментальных исследований in vitro, одновременно строя практическую и надёжную модель для изучения механизмов развития островков и скрининга препаратов, вызывающих гипогликемию.

Протокол

Все экспериментальные процедуры соответствовали рекомендациям по благополучию лабораторных животных, утверждённым Этическим комитетом Гуансийского медицинского университета (Approval No: SYXK 2014-0003), и соответствовали этическим нормам ухода и использования животных, указанным в Международных руководящих принципах биомедицинских исследований с участием животных, разработанных Советом международных организаций медицинских наук (CIOMS).

Все операции, связанные с обработкой тканей и реагентами, должны выполняться в шкафу класса II биобезопасности для предотвращения загрязнения. Дайте минимум 8 часов для завершения обработки свежих тканей и подготовки органоидного индуктора структуры на островках поджелудочной железы. Держите все образцы и реагенты на льду на протяжении всего эксперимента.

1. Экспериментальная подготовка

1. Усыпить 7-дневных крыс Sprague Dawley (SD) с помощью вывиха шейки матки. Анестезия домашних свиней с помощью внутривенной инъекции пентобарбитала натрия в дозе 20 мг/кг и подтверждения адекватной анестезии путём исчезновения рефлекса отмены педали и стабильной частоты дыхания.
2. Обрабатывать ткань поджелудочной железы свинины в шкафу класса II биобезопасности в стерильных условиях. Обрабатывайте свежую свинину поджелудочную железу в течение 24 часов после сбора. Собранные образцы тканей храните при 4 °C в полной среде DMEM (как показано в таблице 1) до обработки.
3. Предварительно настройте охлаждаемую центрифугу на 4 °C и выберите режим низкоскоростной центрифугации, чтобы избежать повреждения клеточных препаратов. Храните наконечники пипеток объемом 1000 мкл, наконечники пипеток на 200 мкл и центрифугные трубки на 50 мл в морозильнике при температуре −20 °C до использования в эксперименте. Подготовьте достаточное количество стерильных фильтров 0,22 мкм и одноразовые стерильные шприцы объемом 20 мл. Стерилизуйте офтальмологические ножницы, изогнутые щипцы, стеклянные чашки Петри и ампулы с помощью высокотемпературного автоклавирования (121 °C, 20 минут).
4. Перед экспериментальным применением полностью подготовленный лизат поджелудочной железы аликотируете. Для оптимальной экспериментальной консистенции пипетка 100 мкл гомогената в отдельные микроцентрифугальные трубки по 1,5 мл для отдельного хранения и последующего использования.

2. Обработка свежей ткани поджелудочной железы для подготовки органоидоподобного индуктора структуры на островках поджелудочной железы

1. Собирайте свежие образцы поджелудочной железы свинины и немедленно переносите их на сухой лёд для поддержания биоактивности тканей. Приобретённые ткани сначала многократно промываются стерильным физиологическим раствором с помощью пипетирования. После начальных этапов очистки используется 3 мл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) для дальнейшего тщательного промывания, чтобы полностью устранить остатки крови и загрязнителей тканей.
2. Удалите и сбрасуйте остатки жидкости из стерильных культурных пластин, затем дополните пластины 2 мл среды DMEM. Предварительно обработанные ткани поджелудочной железы измельчаются на однородные фрагменты размером 1 мм³ стерильными офтальмологическими ножницами (рисунок 1A,B). Все измельчённые части ткани собираются в центрифугную трубку объёмом 50 мл, после чего проводится аккуратное вверх-вниз пипетирование в течение 10 раз для достижения однородного смешивания.
3. Гомогенизация тканей проводится с помощью стерильного стеклянного пестика (рисунок 1C). В процессе помола фрагменты ткани поджелудочной железы равномерно смешиваются с DMEM-средой в соотношении объёма 1:1. Полностью гомогенизированная тканевая суспензия переносится в центрифугную трубку объемом 50 мл и подвергается высокоскоростному холодильному центрифугированию при температуре 21 600 × г в течение 30 минут при температуре 4 °C.
4. После центрифугирования очищенный супернатант медленно извлекается стерильной пипеткой. Полученный супернатант затем проходит через стерильный фильтр диаметром 0,22 мкм для удаления мелких тканевых остатков и нерастворённых примесей (рисунок 1D). Очищенная жидкость в итоге делится на микроцентрифугальные трубки объёмом 1,5 мл с фиксированным объёмом 100 мкл на пробирку для герметичного сохранения и последующих экспериментов (рисунок 1E).
5. Храните алицитированный органоидоподобный индуктор поджелудочной железы при −20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Индуктор остаётся стабильным в течение 1 года при надлежащих условиях хранения. Оценивайте индукционную активность подготовленного лизата с помощью визуального осмотра и функциональной индукции. Идентифицировать активный лизат по его прозрачному, бледно-розовому виду без явных осадков; Распознать потерю активности из-за видимых осадков и неспособность индуцировать типичное образование органоидов островков.

3. Подготовка индукционной среды

1. Подготовьте индукционную среду свежим перед процедурой клеточной культуры. Комбинируйте самостоятельно приготовленный органоидный индуктор островков поджелудочной железы с высокой глюкозой DMEM средой, содержащей 10% сыворотки плода крупного рогатого скота (FBS-H-DMEM), строго в соответствии с пропорциями, указанными в таблице 1.
2. Поместить культивированные образцы органоидов поджелудочной железы в клеточный инкубатор, поддерживаемый при постоянной температуре 37 °C с насыщением CO₂ 5% для непрерывного культивирования.

4. Морфологическое наблюдение и мониторинг роста органоидов

1. Микроскопическое наблюдение проводится в запланированные периоды на протяжении всего периода культуры, включая день 1, 3, день 7, 10 и день 15 после посева клеток.
2. Световой микроскоп используется для отслеживания морфологических изменений, условий роста и клеточной жизнеспособности органоидоподобных структур поджелудочной железы во время каждой сессии обнаружения, чтобы фиксировать динамические характеристики роста этих конструкций.

5. Прохождение и криоконсервация органоидов

1. Пропустить семянные 3 BMSC при плотности 1 × 10–⁵ клеток на колодец в 6-колодцевых культивационных пластинах и культивировать в полном среде на ночь, чтобы клетка могла прикрепиться до индукции.
2. Добавьте 1 мл трипсина, содержащего 0,02% ЭДТА, в систему культуры. Аккуратно пипетируйте поверхность посевной чаши 5–8 раз, чтобы отделить органоиды поджелудочной железы от блюда.
3. Добавьте 2 мл среды 10% H-DMEM-F12, чтобы прекратить пищеварение трипсина. Центрифугуйте смесь при 1 500 × г в течение 5 минут при 4 °C с помощью охлаждённой центрифуги. Аспирируйте и отбрасывайте супернатант после центрифугирования.
4. Добавьте вдвое больше объёма свежей среды 10% FBS-H-DMEM к клеточной грануле для получения прохождения 1:2.
5. Проведите криоконсервацию органоидных культур следующим образом: суспензировать полученную клеточную гранулу в 1 мл безсывороточного раствора криоконсервации. Храните восстановленные органоиды при −80 °C для краткосрочного хранения (до 1 года) и в жидком азоте для длительного хранения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорректируйте объём свежего носителя, чтобы получить разные соотношения проходов. Например, используйте тот же объём материала, что и начальный для пассажа 1:1, или добавьте в 3 раза больше начального объёма для пассажа 1:3.

Результаты

Фиксация динамики роста органоидных культур на островках поджелудочной железы со временем крайне важна, особенно в первые недели культуры, так как это позволяет предсказывать работу системы культуры в последующих экспериментах. На рисунке 2 показан пример культуры за 22 дня, где BMSC были эффективно выделены из костного мозга 7-дневных сосальных крыс и успешно использованы для создания органоидных структур поджелудочной железы на островках....

Обсуждение

Сахарный диабет — это глобальное метаболическое расстройство, которое в основном классифицируется на сахарный диабет 1 типа (ЦМ1) и сахарный диабет 2 типа (ДД2). ТД1 — это аутоиммунное заболевание, характеризующееся селективным разрушением β-клеток поджелудочной железы, приводящим к абсолютному дефициту^{инсулина.} Пациентам требуется пожизненная экзогенная инсулиновая терапия, но они всё равно сталкиваются с риском тяжёлой гипогликемии и микроваскулярных

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,22 и мю; m Стерильный фильтр	Мерк Миллипор	SLGP033RB	Стерильная фильтрация лизата поджелудочной железы для удаления примесей и мусора
0,25% трипсина (в пределах 0,02% EDTA)	Wisent	325-043-CL	Лёгкая диссоциация органоидов островков поджелудочной железы для операции прохода
Микроцентрифугальные трубки объёмом 1,5 мл	Корнинг Аксиген	AXY-20-1500	Алицитирование и хранение лизата ткани поджелудочной железы (100 μ L на трубку)
10 μ Наконечники L Pipette	Эппендорф	22491653	Жидкостный перенос для антител и растворов малого объёма ферментов
1000 & mu; Наконечники L Pipette	Эппендорф	22491651	Жидкостный перенос для реагентов и суспензий клеток
-20&°; морозильник	Haier	HYC-326	Хранение реагентов (например, FBS, трипсин) и наконечников пипеток
200 и мю; Наконечники L Pipette	Эппендорф	22491652	Точный перенос жидкости для реагентов малого объёма (например, алицитирование лисата)
10 μ Наконечники L Pipette	Haier	DW-86L626	Длительное хранение лизата ткани поджелудочной железы и криоконсервированных органоидов
Центрифугные трубки объемом 50 мл	Корнинг	430829	Высокоскоростная низкотемпературная центрифугирование лизата и суспензии клеток поджелудочной железы
6-колодцевые культурные плиты	Корнинг	3516	Культура органоидов островков поджелудочной железы и BMSC
Шкаф биобезопасности класса II	Haier	HR40-IIA2	Стерильная обработка тканей поджелудочной железы свиньи и операции по культуре органоидов
CO2 Инкубатор	Термо Фишер Сайентифик	3111	Инкубация органоидов островков поджелудочной железы при 37°; C, 5% CO<суб>2 среда
Изогнутые щипцы	Shanghai Huaqi Medical Instruments Co., Ltd.	HQ-1302	Обращение с тканями поджелудочной железы во время обработки, стерилизация при высоких температурах
Средний уровень DMEM (высокий уровень глюкозы)	Wisent	318-025-CL	Используется для индукционной культуры органоидов на островках поджелудочной железы
DMEM средний уровень глюкозы (низкий уровень глюкозы)	Wisent	319-015-CL	Базальная среда для культуры BMSC и обработки тканей
Сыворотка для плода быка (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10099141C	Добавлено в DMEM с соотношением объёма 10% для культивирования клеток и прекращения пищеварения
Средний H-DMEM-F12	Wisent	315-080-CL	Используется для прекращения пищеварения трипсина во время прохода органоидов
Высокотемпературный автоклав	Haier	GR80DA	Стерилизация инструментов (121° C, 20 мин) и стеклянную посуду
Световой микроскоп	Олимп	CX43	Наблюдение и визуализация органоидов островков поджелудочной железы при различных увеличениях (и времени; 4, и раз; 10 и раз; 20)
Офтальмологические ножницы	Shanghai Huaqi Medical Instruments Co., Ltd.	HQ-1201	Разрезание ткани поджелудочной железы свинины на 1 мм и sup3; фрагменты, стерилизованные с помощью высокотемпературного автоклавирования
Раствор пенициллина-стрептомицина	Термо Фишер Сайентифик	15140122	Используется в соотношении объёма 1% для предотвращения бактериального загрязнения в культурной среде
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10010023	Промывочный буфер для промывания тканей поджелудочной железы свинины и промывания клеток
Рефрижераторная центрифуга	Эппендорф	5810R	Высокоскоростное центрифугирование при 4°°; C — подготовка лизата поджелудочной железы и сбор клеточных гранул
Решение для криоконсервации без сыворотки	Сучжоу Синсаймай Биотехнология Ко., Лтд.	#C40050	Используется для криоконсервации органоидов островков поджелудочной железы, ресуспензия клеточных гранул до -80&°; Хранилище C