Зелёный синтез наночастиц золота и серебра с использованием растительных экстрактов, грибковых фильтратов и бактериальных культур

Краткое содержание

Этот протокол описывает воспроизводимые методы синтеза зелёных частиц для изготовления наночастиц золота и серебра с использованием растительных экстрактов, грибковых фильтратов и бактериальных культур, за которыми следует подтверждение наночастиц с помощью ультрафиолетово-видимой спектроскопии и трансмиссионной электронной микроскопии.

Аннотация

Зелёный синтез металлических наночастиц (НП) с использованием биологических систем предоставляет устойчивую альтернативу традиционным методам химического производства. В этом протоколе представлены воспроизводимые экспериментальные и аналитические процедуры синтеза NP золота (Au) и серебра (Ag) с использованием бактериальных культур, грибковых фильтратов и экстрактов листьев растений в качестве восстановительных и стабилизирующих агентов. AgNPs были синтезированы с использованием экстрактов из Psidium guayaquilensis, Acanthophora spicifera и Earliella sp., демонстрирующих характерные ультрафиолетово-видимые (UV–Vis) полосы поглощения между 405 и 425 нм, подтверждающие формирование NP. Был реализован подход проектирования экспериментов для оценки влияния факторов окружающей среды, включая условия кислорода, pH, концентрацию Au, концентрацию клеток, тип донора электронов и температуру, на синтез AuNP Shewanella oneidensis и Cupriavidus metallidurans. В идеальных условиях (0,2 мМ Au и pH 5) S. oneidensis преимущественно образует сферические AuNPs со средним размером 43,6 ± 11,0 нм и характерным пиком поглощения на расстоянии 520 нм. Образование и морфология NP были подтверждены с помощью УФ-ВИС-спектроскопии и трансмиссиальной электронной микроскопии. Этот рабочий процесс обеспечивает воспроизводимую платформу для биогенного синтеза NP и поддерживает применения в биосенсинге, биоремедиации и антимикробных технологиях.

Введение

Металлические наночастицы (НП) обладают уникальными физико-химическими свойствами, связанными с их большой площадью поверхности, включая характерное электронное, магнитное и каталитическое поведение, а также высокую реактивность. Эти характеристики способствовали их применению в различных областях, включая медицину для диагностики заболеваний и доставку^{лекарств} 1,2,3,4,5,6, косметику для солнцезащитных^{кремов 7}, электронику для транзисторов и солнечных ^{элементов 8}, экологическую инженерию для очистки^{воды 2,9,10}, а также сельское хозяйство для удобрений и^{пестицидов 11,12}. Постоянное расширение числа заявок на NP в разных дисциплинах отражается в увеличении числа связанных публикаций, опубликованных за последние^{годы — 13,14}.

Синтетические методы для металлических NP позволяют точно контролировать важные характеристики, такие как размер частиц, морфология и стабильность, что делает процесс синтеза ключевым фактором производительности NP. Традиционные методы химического синтеза были значительно оптимизированы; однако они часто связаны с токсичными реагентами, высоким энергопотреблением и повышенными производственными^{затратами 14,15}. Эти ограничения стимулировали разработку более экологичных и устойчивых альтернатив. Подходы к зелёному синтезу используют биологические системы, такие как растительные ^{экстракты 16,17}, микроорганизмы, включая грибы и^{бактерии 18}, и^{водоросли 19} в качестве естественных восстановительных и стабилизирующих агентов. В ходе этих процессов металлические соли восстанавливаются до нулевой валентной формы, образуя NP по экологически чистым и экономичным путям. Кроме того, биологически синтезированные NP часто биосовместимы, что облегчает их использование в медицинских, сельскохозяйственных и экологических целях ^8,14.

Выбор подходящего биологического маршрута для синтеза NP зависит от предполагаемого применения, а также от доступной инфраструктуры и эксплуатационных требований. Растительный синтез, как правило, предпочитается для быстрого и недорогого производства NP, поскольку требует минимального стерильного обращения; однако вариабельность состава экстракта может влиять на^{воспроизводимость 20,21}. Грибковый синтез может обеспечивать высокий урожай NP и внеклеточные ферменты, улучшающие стабилизацию NP и дальнейшую обработку, хотя этот подход требует более длительных периодов культивирования и контролируемых условий^{роста 22}. В отличие от этого, бактериальные системы обеспечивают настраиваемый синтез при определённых метаболических условиях и быстрое производство биомассы, что делает их подходящими для механистических исследований и приложений, связанных с NP²². Однако синтез бактерий часто требует строгого асептического обращения, контролируемых условий биореактора и дополнительной обработки на последующей основе при восстановлении внутриклеточных NP^21,22.

Несмотря на упомянутые преимущества, методы зелёного синтеза продолжают сталкиваться с трудностями, связанными с воспроизводимостью и стандартизацией. Кроме того, подробные визуальные пошаговые протоколы для зелёного синтеза металлических NP остаются^{ограниченными 23}, что ограничивает возможности исследователей успешно воспроизводить и внедрять существующие методологии. Цель этой работы — представить воспроизводимые протоколы зелёного синтеза для NP золота (Au) и серебра (Ag) с использованием растительных экстрактов, грибковых фильтратов и бактериальных культур. В частности, для синтеза NP использовались водные экстракты из Psidium guayaquilensis и Acanthophora spicifera, внеклеточные грибные фильтраты из Earliella sp. и бактериальные системы, включающие Shewanella oneidensis и Cupriavidus metallidurans . Представленные протоколы акцентируют внимание на критических этапах подготовки биологических экстрактов, синтеза NP и предварительной характеристики NP. Кроме того, рабочий процесс интегрирует проектирование экспериментов, стандартизированные процедуры подготовки и встроенную характеристику для поддержки воспроизводимого и оптимизируемого биогенного синтеза NP.

Протокол

Исследование проводилось в соответствии с институциональными рекомендациями Высшей политической школы (ESPOL, Эквадор). Биомасса растений, водорослей и грибов, использованная в этом исследовании, была собрана из доступных сред и не включала охраняемые виды или ограниченные территории. Согласно институциональным и национальным правилам, для сбора свободно доступной биомассы в таких условиях не требовались специальные разрешения. См. рисунок 1 для интегрированного экспериментального рабочего процесса, используемого для зелёного синтеза AgNPs и AuNPs с использованием растительных, водорослей, грибковых и бактериальных биологических систем.

Рисунок 1: Интегрированный рабочий процесс для зелёного синтеза наночастиц серебра (Ag) и золота (Au) с использованием биологических систем. Схема экспериментального рабочего процесса для зелёного синтеза AgNPs и AuNPs с использованием растительных, водорослих, грибковых и бактериальных систем. Рабочий процесс иллюстрирует выбор биологического источника, приготовление экстрактов или биомассы, реакцию с металлическими прекурсорами (AgNO₃ или HAuCl₄), условия реакции и формирование NP. Биологические системы включают экстракт листьев Psidium guayaquilensis , экстракт водорослей Acanthophora spicifera , внеклеточный фильтрат Earliella sp. и бактериальные культуры Shewanella oneidensis MR-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте все институциональные рекомендации по безопасности лабораторий при обращении с химикатами и биологическими материалами. Перед использованием ознакомьтесь с техническими характеристиками всех реагентов.

1. Синтез AgNPs с использованием листьев P. guayaquilensis

1. Коллекция листьев
   1. Собирайте свежие листья P. guayaquilensis в сухой сезон в Гуаякиле, провинция Гуаяс, Эквадор (2°10′S, 80°0′W).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ваучерные образцы этого эндемичного вида были захвачены в гербарии GUAY, факультете естественных наук Университета Гуаякиля, Эквадор, и в Нью-Йоркском ботаническом саду (NYBG) Гербарии Стире, Нью-Йорк, США. Дополнительная информация доступна по адресу: http://sweetgum.nybg.org/science/vh/specimen-details/?irn=2602207
2. Приготовление экстракта листьев
   1. Тщательно промой свежий растительный материал дистиллированной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте полное удаление поверхностных примесей.
   2. Сушите листья в сушилке в лотке с принудительным воздушным потоком при 40°C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Низкие температуры сушки минимизируют деградацию термолабильных органических соединений, участвующих в восстановлении Ag⁺ .
   3. Измельчите высушенный материал ручной фрезером для получения мелкого порошка.
   4. Суспензировать 10 г порошкового материала в 200 мл дистиллированной воды.
   5. Нагрейте суспензию при 70°C при непрерывном помешивании в течение 1 часа.
   6. Дайте экстракту остыть до комнатной температуры (RT, ~28°C).
   7. Фильтруйте экстракт в вакууме через качественную фильтрационную бумагу (Grade 1, поровый размер 11 мкм, диаметр 110 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите все твёрдые остатки из растительного материала.
   8. Храните фильтрованный экстракт при 4°C в янтарных бутылках до дальнейшего использования.
3. Изготовление фитогенных AgNP с использованием листовых экстрактов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время экспериментов по оптимизации изменяйте один параметр на анализ, сохраняя оставшиеся параметры постоянными. Оценить концентрацию серебряной селитры (_{AgNO 3}) (1–5 мМ), фракцию экстракта (10%–50% В/В), время реакции (0,5–1 ч) и температуру (25°C–80°C). Оптимизировать параметры синтеза с использованием методологии поверхности отклика на основе центрального композитного DoE. Изучайте каждый фактор на пяти уровнях (-α, -1, 0, +1 и +α). Используйте длину волны пика поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (λ_SPR), который коррелирует с размером NP, в качестве переменной^{отклика 24}. Экспериментальная конструкция состоит из 16 факториальных точек, 8 осевых точек и 5 центральных точек, что даёт 29 экспериментов.
   1. Подготовьте растворы_AgNO3 , растворив соответствующую массу_{AgNO 3} в дистиллированной воде для получения концентраций от 1 до 5 мМ.
      ВНИМАНИЕ:_AgNO3 — коррозийный и сильный окислитель, который может вызывать раздражение кожи и глаз. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и защиту глаз. Избегайте воздействия света и утилизируйте отходы, содержащие агро, в соответствии с требованиями учреждения по безопасности.
   2. Смешайте раствор_{AgNO 3} с растительным экстрактом, чтобы получить фракции экстракта от 10% до 50% (v/v).
   3. Нагрейте и перемешайте реакционную смесь при выбранной температуре (25°C–80°C) для желаемого времени реакции (0,5–1 ч).
   4. Оставьте реакционную смесь на RT 24 часа.
   5. Центрифугуйте коричневую реакционную смесь при 1660 × г в течение 15 минут при RT. Сбросьте супернатант и соберите твёрдую фракцию.
   6. Высушите восстановленные NP в духовке при 60°C.

2. Синтез AgNPs с использованием экстрактов водорослей A. spicifera

1. Коллекция водорослей
   1. Собирайте водоросли A. spicifera в Вальдивии, провинция Санта-Элена, Эквадор (1°57′23.91′′S, 80°43′51.33′′W).
2. Приготовление экстракта водорослей
   1. Подготовьте экстракт водорослей, следуя процедуре, описанной в шаге 1.2. Замените листья растения биомасой водорослей A. spicifera .
3. Изготовление фикогенных AgNP с использованием экстрактов водорослей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите серию из 12 экспериментов, изменяя по одному параметру за раз, сохраняя оставшиеся параметры постоянными. Оцените концентрацию_AgNO3 (1–5 мМ), фракцию экстракта (5–25% v/v), время реакции (1–4 часа) и температуру (25°C–70°C).
   1. Подготовьте растворы_{AgNO 3} и экстракт водорослей, как описано в шагах 1.3.1 и 2.2.
   2. Смешайте раствор_{AgNO 3} с экстрактом водорослей, чтобы получить фракцию экстракта 5–25% (v/v). Нагрейте и перемешайте реакционную смесь при выбранной температуре (25°C–70°C) для желаемого времени реакции (1–4 часа).
   3. Дайте раствору остыть до RT 24 часа. После центрифугирования соберите твёрдую фракцию и высушите её в духовке, как описано в шагах 1.3.5 и 1.3.6.

3. Синтез AgNPs с использованием Earliella sp.

1. Сбор и поддержание культуры
   1. Перенос активно растущих мицелиальных фрагментов Earliella sp. на пластины картофельной декстрозы агар.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Грибной штамм, использованный в этом исследовании, был выделен из образцов окружающей среды, собранных на территории ESPOL, Эквадор. Изолят был таксономически идентифицирован на основе морфологических характеристик и сохранён в культурной коллекции Биотехнологического исследовательского центра Эквадора (CIBE, ESPOL) под внутренним кодом E2. Поскольку этот штамм хранится в институциональной коллекции и не был размещён в международном хранилище, отсутствует RRID или внешний номер присоединения.
   2. Инкубировать тарелки при 28°C в течение 48 часов.
   3. Перенесите фрагмент мицелия в бульон картофельной декстрозы и инкубуйте культуру под постоянным перемешиванием при 150 об/мин в течение 5 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап способствует выработке биомассы и секреции внеклеточных метаболитов.
   4. Фильтруйте грибковую культуру через стерильную фильтрующую бумагу, чтобы отделить мицелиальную биомассу от внеклеточного бульона. Соберите фильтрат для последующего синтеза NP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внеклеточный бульон содержит биомолекулы, которые во время синтеза AgNP функционируют как восстановительные и стабилизирующие агенты.
2. Изготовление микогенных агНП
   ПРИМЕЧАНИЕ: Генерируйте 14 экспериментальных условий, изменяя один параметр на анализ, сохраняя при этом постоянное соотношение объёма между грибковым бульоном и раствором_AgNO3 . Оцените концентрацию_AgNO3 (1–10 мМ), pH (4–10 с корректировкой с помощью HCl или NaOH), время реакции (1–4 часа) и температуру (25°C–70°C).
   ВНИМАНИЕ: Соляная кислота (HCl) и гидроксид натрия (NaOH) очень коррозийны. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты и медленно корректируйте pH при постоянном помешивании, чтобы избежать брызг и локального перегрева. Используйте 1 М кислотных или щелочных растворов во время корректировки pH.
   1. Смешайте грибной внеклеточный бульон с раствором_{AgNO 3} в желаемой концентрации (1–10 мМ) с использованием соотношения объёма от 2,5% до 10% (v/v) для получения итогового объёма реакции 50 мл. Скорректируйте итоговый объём реакции в соответствии с исследуемым условием эксперимента.
   2. Перемешайте реакционную смесь при выбранной температуре (25°C–70°C) для желаемого времени реакции (1–4 часа). Дайте раствору остыть до RT 24 часа. После центрифугирования соберите твёрдую фракцию и высушите её в духовке, как описано в шагах 1.3.5 и 1.3.6.

4. Синтез AuNP с использованием C. metallidurans и S. oneidensis

1. Сбор и поддержание культуры
   1. Инокулятируйте замороженные клеточные запасы, сохранившиеся в 20% глицерине при −80°C либо C. metallidurans CH34, либо S. oneidensis MR-1, на триптические соевые агарные пластины в аэробных условиях. Инкубировать тарелки при 28°C в течение 24 часов.
   2. Выберите отдельную колонию с каждой пластины и инокулируйте её в 250 мл триптического соевого бульона в аэробных условиях. Инкубировать культуру при 28°C в вращающем шейкере, работающем на 120 об/мин.
   3. Забирайте клетки на стационарной фазе через 72 часа инкубации, когда оптическая плотность на 610 нм (_{OD 610}) достигает примерно 1. Центрифугуйте культуры при 10000 × г в течение 10 минут при ~20°C.
   4. Промыйте собранные гранулы дважды стерильным раствором NaCl с 0,9% (w/v). Сконцентрируйте промытые элементы до значения_{OD 610} примерно 7.
   5. Генерируйте аноксические концентрированные ячейки путём дегазации суспензии и заполнения головного пространства газом_N2 .
2. Изготовление бактериогенных AuNP
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте дробную факторную матрицу для оценки влияния факторов окружающей среды на синтез AuNP²⁵. Постройте матрицу с использованием 7 факторов на 2 уровнях, выбранных согласно предыдущим исследованиям^26,27. Организовать эксперименты в ортогональной матрице и рандомизировать порядок экспериментов, чтобы минимизировать смещение комбинаций исследований. Полученный экспериментальный порядок представлен в Таблица 1.
   1. Растворить тригидрат хлорида золота (_{HAuCl 4}) в деионизированной воде для приготовления стандартного раствора при 5 г L⁻¹.
      ВНИМАНИЕ:_{HAuCl 4} токсичен и является сильным окислителем. Обращайтесь со всеми растворами внутри сертифицированного вытяжки с химическими выбросами, надевая соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, перчатки и защитные очки. Избегайте контакта с органическими материалами и утилизируйте отходы в соответствии с институциональными протоколами по опасным отходам.
   2. Подготовьте экспериментальные реакторы, разбавляя стандартный раствор до целевой концентрации в растворе NaCl 0,9% (w/v) и регулируя pH в соответствии с экспериментальными условиями, указанными в таблице 1.
   3. Раздайте 50 мл подготовленного металлического раствора в чистые бутылки с сывороткой объемом 120 мл. Немедленно запечатайте каждую бутылку пробкой из бутиловой резины.
   4. Закрепите пробку с помощью алюминиевого обжимного уплотнения и ручного обжимщика. Стерилизуйте герметичные бутылки с сывороткой, автоклавизируя при 121°C в течение 21 минуты.
   5. Дайте бутылкам остыть до RT и визуально осмотрите каждую бутылку на наличие осадков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбросьте все бутылки с видимыми осадками и подготовьте запасные реакторы.
   6. Установление аноксических условий
      1. Подключите каждую стерилизованную бутылку с сывороткой к газовому коллектору, оснащённой источником азота высокой чистоты (_N2) и вакуумным насосом.
      2. Создайте аноксическое пространство головы, выполняя 21 последовательный цикл продувки для каждого реактора, требующего аноксических условий согласно таблице 1. В каждом цикле применяйте вакуум, затем заполняйте азот примерно в течение 30 секунд, пока внутреннее давление не вернётся примерно до атмосферного давления (~1 атм).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Прямая проверка аноксических условий не требуется; Однако анализ газов в пространстве головы, такой как газовая хроматография, может использоваться для подтверждения удаления кислорода при необходимости.
         ВНИМАНИЕ: Азотный газ может вытеснить кислород и создать опасность удушья в замкнутых помещениях. Обеспечьте адекватную вентиляцию лаборатории и проверьте надёжные подключения газовых труб перед использованием.
      3. Поддерживайте реакторы под небольшим положительным давлением_N2 после финального цикла продувки.
      4. Маркировать реакторы от 1 до 8 в соответствии с экспериментальным порядком. Например, пометь пятое экспериментальное условие как R5.
   7. Добавление доноров электронов и инокуляция
      1. Вводите необходимый объём стерильного раствора жидкого электронного донора аноксического электрона, такого как лактат натрия, в жидкую фазу назначенных реакторов согласно Таблице 1 с помощью стерильного шприца и игли.
      2. Введите необходимый объём газообразного донора электронов, например_H2, в отведённое пространство реактора с помощью газонепроницаемого шприца.
      3. Инокуляция всех биотических реакторов путем асептического введения необходимого объёма концентрированной аноксической микробной культуры в жидкую фазу.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Храните концентрированные культуры при 4°C перед прививкой для поддержания жизнеспособности клеток.
   8. Организация контрольных экспериментов
      1. Подготовьте абиотический контроль, следуя всем шагам, описанным в шаге 4.2, при замене микробного инокулюма на эквивалентный объём стерильной аноксической культурной среды или буфера.
      2. Подготовьте контроль погибших клеток, следуя всем шагам, описанным в шаге 4.2, используя инокулюм, стерилизованный автоклавированием.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте органы контроля для учёта восстановления абиотических металлов и биосорбции. Подготовьте контроль убитых клеток, автоклавируя жизнеспособные клеточные запасы при 121°C в течение 21 минуты, чтобы оценить вклад активных микробных механизмов.
   9. Инкубация и время реакции
      1. Поместите все бутылки с сывороткой в инкубаторы с контролируемой температурой.
      2. Скорректируйте температуру инкубации в соответствии с экспериментальными условиями, указанными в таблице 1.
      3. Поставьте инкубаторы на платформы с вращающимися встряхивателями и инкубируйте реакторы на скорости 120 об/мин.
      4. Дайте реакциям продолжаться 72 часа.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Приостановите эксперимент после инкубации и храните бутылки с сывороткой при 4°C до обработки образца.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Опционально количественно измерить остаточный растворённый металл после биосинтеза NP с помощью индуктивно-связанной плазменной оптической эмиссионной спектроскопии для оценки эффективности удаления металлов и различия образования NP от остаточных растворённых видов.
3. Репликация оптимальных условий
   1. Определить состояние реактора, связанное с максимальным удалением металла после первичного экранирования и анализа данных.
   2. Воспроизведите выбранное оптимальное состояние в трёх независимых реакторных бутылках для подтверждения воспроизводимости.
   3. Выполнить процедуры подготовки, установки реактора и инкубации для трёхкратных верификационных экспериментов в соответствии с шагами 4.1 и 4.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения экспериментов временно храните и маркируйте все растворённые растворы как водные отходы до их утилизации сертифицированными компаниями по управлению отходами в соответствии с национальным Органическим кодексом окружающей среды и институциональными техническими рекомендациями.

Реактор / Бактерии	Температура (°C)	Атмосфера	Электронный донор	Оптическая плотность (OD 610)	pH	[Золото] (мМ)
1 / CMC	37	N2	H2	0.5	1	2
2 / CMC	28	N2	C3H5O 3−	1	1	0.2
3 / SOM	37	O2	C3H5O 3−	0.5	1	0.2
4 / CMC	28	O2	H2	1	1	2
5 / СОМ	37	N2	H2	1	5	0.2
6 / CMC	37	O2	C3H5O 3−	1	5	2
7 / SOM	28	N2	C3H5O 3−	0.5	5	2
8 / CMC	28	O2	H2	0.5	5	0.2

Таблица 1: Фракционная факториальная экспериментальная конструкция, используемая для бактериогенного синтеза AuNP. В этой таблице представлены экспериментальные условия, оценённые для синтеза AuNP с использованием S. oneidensis MR-1 (SOM) или C. metallidurans CH34 (CMC). Переменные включали температуру инкубации, атмосферу в головном пространстве, донора электронов, оптическую плотность инокуля (_{OD 610}), pH раствора и начальную концентрацию Au³⁺ .

5. Характеристика AgNP и AuNP

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ультрафиолетово-видимую (УФ-видимую) спектроскопию как доступный способ подтверждения образования NP через резонанс поверхностного плазмона. Используйте трансмиссионную электронную микроскопию (TEM) для прямой оценки морфологии и размера NP. Дополнительная физико-химическая характеристика может быть проведена с помощью комплементарных методов, таких как динамическое рассеяние света (DLS), рентгеновская дифракция (XRD), инфракрасная спектроскопия преобразования Фурье (FTIR) и энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (EDS), для оценки распределения размеров, кристаллности, химии поверхности и элементного состава, когда требуется более комплексная^{характеристика 28,29}.

1. УФ–Вис-спектроскопия
   1. Инструментальная установка
      1. Включите UV–Vis спектрофотометр и дайте прибору прогреться не менее 15 минут, чтобы обеспечить стабильность сигнала.
      2. Выберите режим спектрального сканирования и настройте диапазон длин волн от 300 до 800 нм, используя интервал передачи данных 1 нм.
2. Подготовка образца
   1. Собирайте аликвоты свежесинтезированных суспензий AgNP или AuNP. Разбавлять образцы дистиллированной водой при необходимости, чтобы поддерживать значения поглощения в пределах линейного диапазона обнаружения.
3. УФ–ВИС измерение NP
   1. Выполните коррекцию базовой линии, используя дистиллированную воду в качестве пустого раствора.
   2. Перенесите подготовленный образец в кювет, поместите его в держатель и запишите спектр ультрафиолет–Vis в диапазоне 300–800 нм.
   3. Определите полосу SPR, соответствующую формированию NP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: AgNP обычно демонстрируют SPR-зоны от 405 до 425 нм, тогда как AuNP обычно имеют SPR-зоны от 520 до 550 нм.
4. Трансмиссионная электронная микроскопия
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте морфологию и размер NP с помощью TEM, работающей при 80 кВ и оснащённой высокоразрешающей цифровой камерой.
   1. Перенесите 1,5 мл NP-суспензии в центрифугную трубку и центрифугу при 5000 × г на 5 минут в RT.
   2. Отбросьте супернатант и оставьте гранулу.
   3. Добавьте 1 мл фиксационного раствора, содержащего 4% параформальдегида и 5% глутаральдегида, приготовленного в буфере какодилата 0,1 М, в гранулу. Инкубировать образец в течение 25 часов при RT. Затем промой гранулу на ночь с буфером натрия какодилата с концентрацией 0,1 млн.
   4. Центрифугуйте образец при 5000 × г в течение 5 минут и выбросьте супернатант.
   5. Добавьте 1 мл 1% (w/v) тетроксида осмия (_{OsO 4}), приготовленного в буфере натрия какодилата толщиной 0,1 м для фиксации в течение 3 часов.
      ВНИМАНИЕ:_{OsO 4} очень токсичен и летуч. Обращайтесь с всеми растворами исключительно внутри сертифицированной вытяжки для химических паров, одновременно нося соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат, перчатки и защитные очки.
   6. Центрифугуйте образец при 5000 × г в течение 5 минут и выбросьте супернатант.
   7. Сушите образец с помощью серии градуированного этанола. Добавьте 50% этанола, инкубируем 15 минут. Повторяйте процедуру последовательно, используя 70% и 90%. Полное обезвоживание с тремя последовательными инкубациями в абсолютном этаноле по 30 минут за инкубацию.
   8. Встраивайте гранулу в эпоксидную смолу в RT согласно инструкциям производителя.
   9. Подготовьте полутонкие срезы (~1 мкм) и покрасьте их толуидиновым синим цветом для предварительного наблюдения.
   10. Вырежьте ультратонкие срезы (~60 нм) алмазным ножом и окрашивайте их уранилацетатом, затем цитратом свинца.
   11. Закрепите секции на ТЭМ-сетках и загрузите их в пропускательный электронный микроскоп.
   12. Получите изображения TEM для оценки морфологии и размера NP.

Результаты

AgNP успешно синтезировались с помощью зелёных и биосинтетических методов с использованием различных биологических редуцирующих агентов, и для каждого метода были определены идеальные условия синтеза. В зелёном синтезе, опосредованном экстрактом листьев P. guayaquilensis , оптимальными условиями были концентрация_AgNO3 5 мМ, соотношение экстракта к металлу 25% (v/v), температура реакции 80°C и время перемешивания 60 минут с последующим периодом отдыха 24 часа. При таки...

Обсуждение

При сравнении изученных маршрутов синтеза с точки зрения осуществимости, контроля размера NP, эксплуатационных затрат, воспроизводимости и общей эффективности процесса, синтез, опосредованный растениями, с использованием экстракта листьев P. guayaquilensis, показал наиболее благоприятный баланс среди изученных методов синтеза AgNP. Этот протокол обеспечивал улучшенный контроль размера NP за счет систематической оптимизации и прямой микроскопической характеристики при работе в мя...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Absolute ethanol	Merck	E7023	TEM dehydration series
Алюминиевые крышки	Dwk Wheaton	224178-01	Для бутылок с сывороткой
Бурые стеклянные бутылки	Duran	2180154	Хранение в защищенном от света месте
Спектрометр АТР-ФТИР	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Спектральный диапазон: 300–3600 см-1
Автоклав	Yamato	SM300	Стерилизация при 121 °C
Бутилорезиновые пробки	Dwk Kimble	73827-21	Газостойкое герметизирование
Центрифуга	BIOBASE	BKC-TH20RL	Настольная центрифуга
Тригидрат хлористого золота (HAuCl4·3H2O)	Sigma-Aldrich	27988-77-8	Предшественник золота
Алмазный нож	Aurion	Dyatom 45	Ультратонкое сечение ТЭМ
Дистиллированная или деионизированная вода	Methrom	N/A	Приготовление раствора
Эпоксидная смола (EMBED 812/Epon)	Aurion	EMBED 812	Среда для встраивания ТЭМ
Фильтровальная бумага, качественная 1-го сорта	Merck Whatman	WHA1001110	Размер поры: 11 µm; диаметр: 110 мм
Инфракрасный спектрометр с преобразованием Фурье (ФТИР)	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Спектральный диапазон: 300–3600 см-1
Система газового манипулятора	Собственное изготовление	N/A	Для циклов промывки
Газостойкая шприцевая иглушка	Hamilton	1001 RN	1 мл
Глутаральдегид	VWR	219859510	5% глутаралядегид, 4% параформальдегид в 0,1 М буфере ртутисодержащего аммония
Глицерин	Sigma-Aldrich	G5516	20% хранение запасов
Ручной штамп	Biomed	USYGQ-20Z	Обжимное герметизирование бутылок с сывороткой
Ручная мельница/измельчитель	Corona	L10000	Измельчение растительной биомассы
Соляная кислота (HCl)	Merck	320331	Корректировка pH
Газ водород (H2)	Linde	Промышленный сорт	Донорный газ электронов
Система ИКП-ОЭС	Varian	Vista-MPX	Количественное определение металлов
Инкубатор	Memmert	SM 400	Инкубация с контролируемой температурой
Лабораторная сушилка	Barnstead	M100	Сушка наночастиц
Цитрат свинца	Merck	7398	Окраска ТЭМ
Азотная кислота (HNO3)	Chem-Lab	CL00.0125	Кислотный реагент
Газ азота (N2)	Linde	Промышленный сорт	Аноксическая среда
Тетраоксид осмия (OsO4)	Merck	201030	Фиксация ТЭМ
Параформальдегид	VWR	101176-014	5% глутаралядегид, 4% параформальдегид в 0,1 М буфере ртутисодержащего аммония
Картофельный декстрозный агар (PDA)	Merck	110130	Культивирование грибов
Картофельный декстрозный бульон (PDB)	Merck	P6685	Микробиологическая среда
Ротационный агитатор	JoanLab	OS-20Pro	Инкубация при контролируемой агитации
Бутылки для сыворотки (120 мл)	Wheaton	223748	Стеклоборосиликат
Селитра серебра (AgNO3)	Sigma-Aldrich	209139	Реагент ACS, ≥99,0%
Буфер ртутисодержащего аммония	VWR	11650	5% глутаралядегид, 4% параформальдегид в 0,1 М буфере ртутисодержащего аммония
Хлорид натрия (NaCl)	Carl Roth	3957.1	0,9% раствор для промывания
Гидроксид натрия (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Корректировка pH
Лактат натрия	Sigma-Aldrich	L7022	Донор электронов/углеродный источник
Стерильные шприцы и иглы	BD	Различные	Стерильное обращение с жидкостью
Нагревательная плита со смешиванием	Biologix	01-310X	Нагрев и смешивание
Толуидиновый синий	EMS	DcU-10	Окраска полутонких секций
Электронный микроскоп просвещения (ТЭМ)	FEI	Tecnai Spirit Twin G20	Оснащен высокоразрешающей цифровой камерой
Сушилка лотка с принудительным воздушным потоком	Собственное изготовление	N/A	Сушка биомассы при 40 °C
Агар триптикасоевый (TSA)	Oxoid	CM01301	Микробиологическая среда
Бульон триптикасоевый (TSB)	Carl