Метод адаптации Euglena gracilis к субстратам на основе маниоки для гетеротрофного выращивания

Краткое содержание

Этот протокол описывает поэтапный метод адаптации Euglena gracilis к субстратам на основе маниоки и последующую оценку роста, жизнеспособности и производства биомассы на различных продуктах маниоки в условиях гетеротрофного культивирования.

Аннотация

Обработка маниоки приводит к образованию питательных побочных продуктов, которые остаются недоиспользуемыми из-за переменного состава, цианогенных соединений и активных микробных сообществ. Этот протокол предлагает многоступенчатую стратегию адаптации для формирования линейки Euglena gracilis, устойчивой к маниоке, подходящей для гетеротрофного выращивания в субстратах, полученных из маниоки. Метод начинается с одновременного воздействия культур Euglena на автоклавную и неавтоклавную массу маниоки, а также с градиентом концентрации гарри 10–30 г/л для оценки устойчивости к микробной сложности и нагрузке на субстрат. Затем культуры подвергаются более высокому градиенту концентрации 30–50 г/л для оценки эффективности с более плотными субстратами. Полученная линия сравнивается с неадаптированным диким сортом по пяти продуктам маниоки; Гарри, высушенная целлюлоза, гранулы, кожуры и корм для животных для оценки консистенции роста в полевым материалах. Протокол включает измерение изменений pH, уровней цианида с использованием колориметрических полосок и подготовку высушенной биомассы для анализа белков на основе количественного определения общего содержания азота. Вместе эти процедуры обеспечивают воспроизводимую основу для адаптации Euglena gracilis к субстратам, полученным из маниоки, а также для оценки эффективности штаммов на различных продуктах маниоки. Этот метод позволяет развивать устойчивые линии водорослей для использования в биопроцессе и валоризации отходов, ориентированных на маниоку.

Введение

Маниока (Manihot esculenta) — крупная пищевая и промышленная культура по всей Западной Африке, образующая переработанные побочные продукты, такие как гарри, сушёная целлюлоза, кожура и^{гранулы 1}.

Субстраты, полученные из маниоки, в основном состоят из ферментируемых углеводов и остаточных питательных веществ, а также из незначительного содержания белка и клетчатки, хотя состав может варьироваться в зависимости от условий обработки и исходного^{материала 2,3}. Они остаются недостаточно используемыми из-за своего гетерогенного состава, наличия цианогенных гликозидов и разнообразия микробных сообществ, возникающих при традиционной обработке и^{ферментации 4}. Эти характеристики создают трудности для прямого выращивания микроорганизмов и ограничивают интеграцию побочных продуктов маниоки в стандартизированные рабочие процессы биопереработки. Несмотря на обилие побочных продуктов, полученных из маниоки, в настоящее время не хватает воспроизводимых и биоустойчивых методов культивирования микробных систем на этих химически сложных и микробно активных субстратах. Система культивации, способная обогащать или детоксикировать такой популярный источник пищи, при этом надежно работая в таких условиях, поддержит более устойчивые рабочие процессы переработки маниоки и циклическое использование ресурсов.

Euglena gracilis — это одноклеточный жгутик в составе^{Euglenozoa 5} , известный своей гибкой пелликулой, динамической морфологией и обратимыми способностями к кистированию в ответ на значительные колебания доступности питательных веществ, осмотического давления и химического^{состава 6}. Его метаболическая адаптивность также позволяет синтезировать запасной полисахарид^{парамилон 6} и регулировать клеточный pH посредством метаболизма органических кислот. Эти метаболические особенности, особенно накопление парамилона, могут повышать накопление энергии и устойчивость к стрессу, поддерживая выживание и адаптацию при переменных питательных и химических условиях, характерных для субстратов, полученных из маниоки. Эти признаки позволяют E. gracilis сохраняться в химически изменяющихся пресноводных условиях, что делает его перспективным кандидатом для выращивания на гетерогенных, нерафинированных^{субстратах 7}.

При воздействии химически сложных или микробно активных субстратов неадаптированные культуры E. gracilis часто проявляют стрессовые реакции, такие как повышенная ферментация и снижение подвижности, тогда как адаптированные популяции могут сохранять более стабильную морфологию и метаболическую^{активность 8}. Взаимодействие с сопутствующими микробными сообществами может дополнительно влиять на физиологическую работу при длительном воздействии сложных субстратов. Эти характеристики подчёркивают значимость адаптационных подходов при выращивании E. gracilis на материалах, полученных из^{маниока 9}.

Для решения этих проблем этот метод использует поэтапную адаптационную стратегию, предназначенную для постепенной акклиматизации E. gracilis к субстратам, полученным из маниоки. Подход включает контролируемое воздействие растущей сложности субстрата и микробной активности, что позволяет отбирать популяции, способные поддерживать жизнеспособность и рост при гетерогенных условиях культивирования. Эта конструкция позволяет E. gracilis взаимодействовать с соответствующей микробиотой и потенциально получать от неё преимущества, а также адаптироваться к росту концентрации сред.

После адаптации протокол ведёт к сравнительной оценке адаптированных и неадаптированных линий E. gracilis по нескольким продуктам, полученным из маниоки. Эта сравнительная структура позволяет оценить последовательность роста, морфологическую стабильность и физиологические реакции в условиях, релевантных для полевых условий субстрата, поскольку процесс адаптации постепенно готовит E. gracilis к преодолению вариативности питательных веществ, химических стрессоров и микробной активности, характерных для побочных продуктов маниоки.

Метод включает стандартизированный мониторинг pH и уровней^{цианида 10} во время культивации, а также подготовку собранной биомассы для дальнейшего анализа белков с помощью количественной оценки общего содержания^{азота 11}, что позволяет сравнивать питательный потенциал между субстратами и штаммами. Вместе эти измерения помогают оценить метаболическую стабильность, взаимодействия субстратов и характеристики биомассы во время культивации и адаптации на основе маниоки, чтобы показать, что адаптированная линия E. gracilis может устойчиво и стабильно расти на различных побочных продуктах маниоки.

Этот метод наиболее подходит для лабораторных или прикладных исследовательских условий с доступом к базовой микробиологической инфраструктуре и локально доступным субстратам, полученным из маниоки. Практические аспекты включают необходимость постоянного обращения с разнородными средами, доступ к микроскопии для мониторинга состояния культуры и тщательный контроль смешивания для предотвращения сдвигового стресса во время культивации.

Протокол

В этом протоколе используются непатогенные протисты и растительные субстраты, полученные из маниоки. Выполнять все процедуры в соответствии с требованиями институциональной биобезопасности и химической безопасности для цианогенных растительных материалов.

1. Приготовление и ферментация среды на основе маниоки

ВНИМАНИЕ: Материалы, полученные из маниоки, могут содержать цианогенные гликозиды и при определённых условиях выделять цианистый водород. Выполните все этапы взвешивания, гидратации, смешивания и отбора проб в химическом вытяжном контейнере. Наденьте лабораторный халат, нитриловые перчатки и защитные очки. Деконтаминировать рабочие поверхности после обработки субстратов маниоки и утилизировать твёрдые и жидкие отходы как опасные химические отходы согласно институциональным рекомендациям.

1. Подготовьте подвески гарри
   Примечание: Дикий тип Euglena gracilis культивировался при постоянных тёмных условиях при 28°C с орбитальными колебаниями при 120 x g. Состав гетеротрофной питательной среды был подготовлен в виде определённой формулы, состоящей из 1,5% глюкозы, 0,5% экстракта дрожжей, 0,1% KH2PO4, 0,1% MgSO4, 0,2% (NH4)2SO4, 0,01% CaCL2.2H2O плюс 0,4 мл/л витаминного раствора (витамин B1: 2,50 г/л; Витамин B12: 12,5 мг/л; Витамин B6: 0,5 мг/л; витамин B7: 0,025 мг/л) и 2,0 мл/л раствора следовых металлов (Na2EDTA.2H2O: 25,00 г/л; FeCl3.6H2O: 21.00 г/л; ZnSO4.7H2O: 11.0 г/л; MnCl2.4H2O: 4.0 г/л; CuSO4.5H2O: 0.39 г/л; H3BO3: 0,285 г/л; Na2MoO4.2H2O: 0.9 г/л).
   1. Маркируйте каждую стерильную колбу с вентиляционной крышкой объемом 500 мл типом субстрата (гарри), целевой концентрацией (10, 20, 30, 40 или 50 г ^L-1), идентификацией репликации и планируемым условием стерилизации (автоклавированной или неавтоклавной).
   2. Поставьте весовую лодку на аналитический вес и нажмите TARE/Zero, чтобы установить дисплее на 0,000 г.
   3. Взвешивайте гарри, чтобы соответствовать итоговому рабочему объёму (например, для 300 мл весить 3,0 г на 10 г ^L-1, 6,0 г для 20 г ^L-1, 9,0 г для 30 г ^L-1, 12,0 г для 40 г ^L-1 или 15,0 г для 50 г ^L-1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный диапазон концентраций (10–50 г ^L-1) был разработан для охватки условий от исходного роста до высокой нагрузки на субстрат, что позволяет оценивать адаптацию при возрастающей физико-химической сложности.
   4. Асептически добавьте взвешенный гарри в каждую стерильную колбу объемом 500 мл с 300 мл деионизированной или дистиллированной воды и снова наместите вентилируемую крышку.
   5. Перемешайте каждую суспензию в течение 3 минут, пока смесь не станет гомогенизированной, используя один из следующих способов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: E. gracilis чувствителен к механическому сдвигу; поэтому были выбраны условия смешивания для минимизации стресса, вызванного волнением, при сохранении достаточного контакта между клетками и субстратом.
      1. Для ручного смешивания затяните вентилируемую крышку и крутите колбу вручную по кругу в течение 3 минут, пока твердые частицы не равномерно распределятся.
      2. Для магнитного перемешивания асептически добавьте стерильную батончик для перемешивания, поставьте колбу на тарелку и установите скорость на 200 x g, чтобы образовать неглубокий вихрь без брызг.
   6. Дайте суспензии увлажниться без помех в течение 10 минут при комнатной температуре (25 °C).
   7. Непосредственно перед ферментацией аккуратно гомогенизуйте смесь, сначала затянув вентиляционную крышку и прокрутив колбы вручную 5 раз, чтобы вновь взвесить осевший материал.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гарри, использованный в этом исследовании, был коммерчески доступным продуктом из маниоки. Согласно информации о питательной ценности, предоставленной производителем, он в основном состоял из углеводов с небольшим содержанием белка и незначительным содержанием жира. Этот состав отражает типичные обработанные субстраты маниоки, используемые в пищевых и промышленных условиях.
2. Подготовьте дополнительные материалы из продукта маниоки
   1. Маркируйте каждую стерильную колбу объёмом 500 мл с вентиляционной крышкой типом субстрата (сушёная целлюкоза, гранулы, кожуры или корм для животных), концентрацией (30 г ^L-1), идентификацией репликации и условием стерилизации (автоклавная или неавтоклавная).
   2. Поставьте весовую лодку на аналитический вес и нажмите TARE/Zero, чтобы установить дисплее на 0,000 г.
   3. Взвешивайте подложку так, чтобы получить 30 г ^L-1 в зависимости от рабочего объёма (например, для 300 мл вес 9,0 г).
   4. Асептически добавьте взвешенный субстрат в каждую стерильную колбу с 300 мл деионизированной или дистиллированной воды и снова нанесите вентилированную крышку.
   5. Увлажняйте и смешивайте каждую подвеску, используя один из следующих способов.
      1. Для ручного смешивания затяните крышку вентиляции и аккуратно покрутите колбу 10 раз в 3 минуты в период гидратации.
      2. Для магнитного перемешивания асептически добавьте стерильную батончик и перемешивайте при температуре 200 x g, пока материал не будет заметно увлажнён и равномерно распределён.
   6. Визуально осмотрите каждую суспензию и убедитесь, что твёрдые вещества гидратированы и не осталось крупных сухих комков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не фильтруйте среду маниоки, если это не требуется для дальнейших аналитических измерений.
3. Аэробно ферментирующие среды на основе маниоки
   1. Убедитесь, что каждая фляга оснащена стерильной газопроницаемой вентиляционной крышкой, чтобы обеспечить газообмен и минимизировать загрязнение окружающей среды.
   2. Размещайте фляжки вертикально при комнатной температуре (25 °C) в специально отведённом месте, вдали от прямого солнечного света и от потока воздуха с интенсивным трафиком.
   3. Инкубировать без перемешивания минимум 72 часа.
   4. Запишите дату и время начала брожения для каждой колбы и условия.
4. Подготовьте автоклавные носители
   1. После ферментации убедитесь, что в каждой колбе объемом 500 мл содержится жидкость ≤300 мл (≤ две трети общего объёма), чтобы предотвратить перекипание во время стерилизации.
   2. Ослабьте вентилируемую крышку до положения «затягивающее пальцем», подходящее для автоклава, и прикрепите индикаторную ленту автоклава на колбу.
   3. Загрузите колбы в автоклав в безопасный для автоклава лоток и выберите жидкий цикл P13.
   4. Убедитесь, что параметры стерилизации достигают 121 °C на 30 минут (жидкая стерилизация) и запустите цикл.
   5. После завершения цикла дайте давлению в камере автоклава восстановить атмосферное давление перед открытием двери. Снимите фляжки с помощью термостойких перчаток и дайте им остыть до комнатной температуры.
   6. Храните охлаждённые колбы на ночь при комнатной температуре перед прививкой.
      ВНИМАНИЕ: Горячие жидкости и пар могут вызвать ожоги. Открывайте дверь автоклава медленно и снимайте колбы только после того, как давление выровняется и жидкости остынут.
5. Подготовьте неавтоклавные носители
   1. Используйте ферментированную маниоку напрямую без автоклава, чтобы сохранить местные микробные сообщества.
   2. Инокуляция неавтоклавных сред сразу после 72-часового периода ферментации для минимизации нежелательного загрязнения окружающей среды.
   3. Поддерживайте единообразную обработку между репликами, используя один и тот же тип сосуда (стерильные колбы с вентиляцией 500 мл), одинаковый рабочий объём (300 мл) и одинаковую продолжительность ферментации (≥72 часа) для всех условий субстрата.

2. Создание стартовых культур E. gracilis

1. Поддержание запасных культур E. gracilis .
   1. Инокуляция E. gracilis в свежую гетеротрофную питательную среду и инкубировать культуры в полной темноте при 28 °C с непрерывным орбитальным колебанием при 120 x g , пока культуры не достигнут среднего логарифмического роста.
   2. Исследуйте культуры с помощью микроскопа с составным светом (brightfield) 100×–400× полного увеличения (10× глазных с 10×–40× целями) для подтверждения активной подвижности, типичной удлинённой морфологии клеток и низкого уровня инцистности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность оценивалась на основе наличия целостных клеток с определёнными клеточными границами и минимальным количеством мусора. Активная подвижность определялась как наблюдаемое направленное движение клеток в поле зрения. Морфологическая стабильность оценивалась на основе преобладания характерных форм клеток и низкой частоты схлопнувшихся или крайне неправильных форм.
   3. Исключайте культуры с избыточным содержанием клеточного мусора, аномальной морфологией или повышенной инцистой до использования в адаптационных экспериментах.
2. Подготовьте инокулюм к адаптации
   1. Аккуратно гомогенизируйте закваски, затянув крышку вентиляционного отверстия и покрутив колбы вручную в течение 15 секунд, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек без вызвания сдвигового напряжения.
   2. Определите плотность клеток с помощью гемоцитометра Нойбауэра.
      1. Аккуратно смешайте культуру, помешав вручную 15 секунд.
      2. Пипетта 1,0 мл культуры в стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
      3. Очистите гемоцитометр и каверслиз 70% этанолом и дайте высохнуть на воздухе.
      4. Нанесите пипетку 10 мкл культуры на две сетки гемоцитометра и разместите накладку на влажный образец.
      5. Используя микроскопию яркого поля (10× объектива), фокусируйтесь на сетке и подсчитайте ячейки в определённом наборе квадратов (например, 4 угловых квадрата большой сетки).
      6. Применяйте стандартные правила границ (подсчёт ячеек, касающихся верхней и левой границ; исключать ячейки, касающиеся нижней и правой границ).
      7. Повторяйте подсчёты во второй камере (и/или перезарядку) и вычисляйте среднее количество ячеек/мл.
      8. Вычислите плотность ячеек с помощью следующего уравнения: ячейки/мл= (средние ячейки на квадрат × 10⁴× коэффициент разбавления)/1
         Примечание: Для улучшения визуализации клеток разведите образец деионизированной водой по необходимости (например, возьмите аликвот 100 мкл образца и разведите в 600 мкл деионизированной воды и повторите оценку плотности клетки)
   3. Скорректируйте объёмы инокуляции для достижения конечного инокуля 5% (v/v) во всех экспериментальных средах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранные соотношения инокулума выбираются для обеспечения достаточной начальной плотности клеток и поддержания культур.
   4. Подготовьте отдельные инокулы для каждого лечебного состояния, чтобы поддерживать единую начальную плотность клеток между экспериментальными группами.

3. Первоначальная адаптация в автоклавных и неавтоклавных медиа маниоки

1. Инокулятные адаптационные медиа
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объёмы инокулума были отобраны для баланса достаточной начальной плотности клеток с чувствительностью к эффектам адаптации, при этом меньшие объёмы использовались на ранней адаптации, а большие — для поддержания стабильности культур во время рутинного пассажа.
   1. Добавьте подготовленный E. gracilis inoculum в автоклавную и неавтоклавную маниоковую среду, приготовленную при конечных концентрациях гарри 10 ^gL-1, 20 ^gL-1 и 30 ^gL-1.
   2. Используйте равные объёмы инокуляции во всех условиях обработки для стандартизации начальной плотности клеток.
   3. Чтобы смешать культуры, затяните вентиляционную крышку и аккуратно покрутите колбу по кругу в течение 15 секунд, чтобы распределить клетки.
   4. Инкубировать культуры в полной темноте при температуре 25 °C, чтобы начать гетеротрофный рост.
2. Поддержание условий культуры
   1. Для неавтоклавных сред минимизировать перемешивание, чтобы сохранить структуру местного микробного сообщества и стратификацию субстрата.
   2. Смешивайте все культуры один раз в день, аккуратно помещая вручную в течение 15 секунд, чтобы поддерживать контакт между клетками E. gracilis и подвешенным материалом маниоки.
      ВНИМАНИЕ: Избегайте сильного встряхивания или постоянного перемешивания, чтобы предотвратить сдвиговое напряжение и непреднамеренное нарушение взаимодействия микробных субстратов.
3. Мониторинг ранней адаптации
   1. Каждые 48 часов асептически собирайте образцы по 1 мл из каждой культуры с помощью стерильных наконечников пипетки.
      1. Затяните вентилируемую крышку и аккуратно покрутите колбу в течение 15 секунд перед отбором проб, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток и взвешенного материала.
      2. Перенесите аликвот культуры в стерильную микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
      3. Разбавлять образец деионизированной водой по мере необходимости для улучшения визуализации отдельных клеток. (например, 100 мкл образца, разбавленного в 600 мкл деионизированной воды).
      4. Подготовьте микроскопический стекло с влажным монтажом, нанеся 10 мкл разбавлённого образца на чистый стекло для микроскопа и накрыв крышкой.
   2. Оценивайте культуры с помощью световой микроскопии
      1. Анализировать образцы с помощью микроскопа с использованием композитного света (яркое поле) при 100×–400× полном увеличении (10× глазной с объективами 10×–40×).
      2. Оценивать подвижность клеток, морфологию и частоту инцистирования как индикаторы адаптационного статуса.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность оценивалась на основе наличия целостных клеток с определёнными клеточными границами и минимальным количеством мусора. Активная подвижность определялась как наблюдаемое направленное движение клеток в поле зрения. Морфологическая стабильность оценивалась на основе преобладания характерных форм клеток и низкой частоты схлопнувшихся или крайне неправильных форм.
4. Исполняйте серийный пассаж во время адаптации
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интервалы отбора проб и переноса предоставлены в виде определённых диапазонов для учёта изменчивости динамики роста при сохранении единого экспериментального времени между репликами.
   1. Каждые 7 дней асептически перемещайте 20% (v/v) каждой культуры в свежеприготовленную массу маниоки с той же концентрацией гарри и условием стерилизации.
   2. Поддерживайте стабильные объёмы передачи между проходами для сохранения давления селекции.
   3. Повторяйте серийное прохождение до тех пор, пока культуры не покажут устойчивый рост, устойчивую подвижность и низкую частоту инцистирования в среде маниоки ^L-1 объемом 30 г.
      Точка паузы: культуры могут оставаться нетронутыми до 24 часов между рутинным смешиванием и отбором проб.

4. Отбор с высокой концентрацией (30–50 г/л)

1. Подготовьте подложки с высокой нагрузкой
   1. Приготовьте медиа маниоки на основе гарри в конечных концентрациях 30 ^gL-1, 40 ^gL-1 и 50 ^gL-1 , следуя процедурам, описанным в Методе 1.
   2. Дайте субстратам полностью гидратироваться в период ферментации, чтобы обеспечить равномерное воздействие клеток на растворённые и частицы компонентов.
   3. Аккуратно подвесьте оседшие частицы, аккуратно покрутив колбы вручную в течение 10–15 секунд непосредственно перед прививкой.
2. Инокуляция культур с высокой нагрузкой
   1. Инокулировать каждую среду с высокой концентрацией маниоки 5% (v/v) линии E. gracilis , ранее адаптированной к 30 ^gL-1 garri.
   2. Стандартизировать объёмы инокуляции во всех концентрациях, чтобы сохранить сопоставимую начальную плотность клеток.
   3. Инкубировать культуры в полной темноте при температуре 25 °C с непрерывным орбитальным колебанием при 120 x g для поддержания гетеротрофных условий роста.
   4. Смешивайте культуры один раз в день мягким ручным поворотом в течение 15 секунд, чтобы поддерживать контакт между клетками и подвешенным субстратом без вызвания сдвигового стресса
3. Производительность монитора при высокой нагрузке на подложку
   1. Каждые 48 часов проверяйте культуры на предмет видимых изменений мутности, пигментации и взаимодействия между клетками E. gracilis и осадочным материалом маниоки.
   2. Асептически собирайте мелкие аликвоты и исследуйте клетки с помощью микроскопа с помощью композитного светового микроскопа при полном увеличении 100×–400× (10× глаз с объективами 10×–40×).
   3. Оценить подвижность, морфологию клеток и частоту инцистирования как показатели физиологической толерантности к повышенной концентрации субстрата (см. метод 2).
4. Подтверждение адаптации к высоким концентрациям субстрата
   1. Выявить культуры, поддерживающие устойчивую подвижность, стабильную морфологию и низкую частоту кистирования при концентрациях маниоки ≥40 г ^L-1.
   2. Определить культуры, соответствующие этим критериям, как линию грацилиса , адаптированную к маниоке, для последующего экспериментального обследования.

5. Сравнительное тестирование роста в продуктах из маниоки

1. Подготовить парные условия теста
   1. Для каждого продукта из маниоки, включая гарри, сушёную мьюлоть, гранулы, кожуру и корм для животных, подготовьте два одинаковых сосуда с одинаковой концентрацией и объёмом субстрата.
   2. Инокулятируйте один сосуд с приспособленной к маниоке линии E. gracilis , а парный — неадаптированным диким штаммом.
   3. Используйте равные объёмы инокуляции для каждого парного состояния, чтобы обеспечить сопоставимую начальную плотность клеток между линиями
2. Поддерживайте парные культуры
   1. Инкубировать все парные культуры в полной темноте при температуре 25 °C с непрерывным орбитальным колебанием при 120 x g для поддержания гетеротрофных условий роста.
   2. Смешивайте культуры один раз в день мягким ручным инверсией, чтобы поддерживать контакт между клетками и подвешенным субстратом.
   3. Фиксируйте видимые изменения, включая мутность, пигментацию и узоры оседания, на протяжении всего инкубационного периода.
3. Зафиксированные морфологические различия
   1. На определённых интервалах отбора проб асептически собирайте аликвоты из каждой культуры для микроскопического анализа (см. Метод 2.2 для анализа аликвотов и микроскопического анализа)
   2. Анализировать образцы с помощью микроскопа с использованием композитного света (яркое поле) при 100×–400× полном увеличении (10× глазной с объективами 10×–40×).
   3. Документируйте различия между адаптивными и дикими культурами по подвижности, частоте инцистирования и общей морфологии клеток.

6. Мониторинг pH

1. Сбор образцов pH
   1. На днях 0, 3, 6, 9 и 12 асептически извлекайте по 1 мл культуры из каждого экспериментального состояния с помощью стерильных наконечников пипетки.
   2. Дайте образцам постоять нетронутыми 2 минуты, чтобы обеспечить оседание взвешенных веществ.
   3. Аккуратно перенесите очищенный супернатант в чистую трубку микроцентрифуга, не нарушая оседшийся материал.
2. Измерение pH
   1. Калибруйте pH-метр в соответствии с инструкциями производителя с использованием соответствующих стандартных буферов перед измерением.
   2. Вставьте калиброванный pH-зонд в очищенный супернатант, не нарушая остаточный оседлый материал.
   3. Фиксируйте значения pH сразу после стабилизации pH.
   4. Тщательно промывайте зонд деионизированной водой между образцами, чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение.

7. Цианидное тестирование с использованием колориметрических полосок

ВНИМАНИЕ: Супернатанты, содержащие цианид, опасны. Проводите все этапы отбора проб и тестирования в вытяжной вытяжке или хорошо проветриваемом помещении. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки и защиту глаз. Избегайте прямого контакта кожи с образцами и тест-полосками, а также утилизируйте использованные полоски и жидкие отходы в соответствии с институциональными рекомендациями по утилизации опасных химических отходов.

1. Сбор образцов цианида
   1. На 0, 4, 8 и 12 днях асептически извлекайте 1 мл посевного супернатанта из каждого экспериментального состояния с помощью стерильных наконечников пипетки.
   2. Дайте образцам постоять нетронутыми 2 минуты, чтобы обеспечить оседание взвешенных веществ.
   3. Аккуратно собирайте очищенный супернатант, не нарушая частицы.
2. Проведите колориметрический анализ цианида.
   1. Погрузите колориметрический тест на цианидную тест-полоску в очищенный супернатант на срок, указанный производителем.
   2. Удалите полоску и дайте полному цвету проявить цвет на рекомендованное время в условиях окружающей среды.
   3. Сравните разработанную полоску с эталонной шкалой, предоставленной производителем, чтобы определить концентрацию цианида.
3. Зафиксируйте уровни цианида
   1. Фиксируйте концентрацию цианида для каждого образца во всех точках времени согласно эталонной шкале.
   2. Фотографируйте каждую проявленную тест-полоску рядом с эталонной шкалой или сохраняйте полоску согласно рекомендациям производителя для дальнейшей проверки.

8. Поддержание и консолидация адаптированных культур E. gracilis

1. Комбинированные адаптированные культуры
   1. После успешной адаптации при концентрациях маниоки ≥40 ^gL-1 garri визуально подтверждается наличие жизнеспособных клеток E. gracilis в каждой культуре репликации.
   2. Аккуратно объедините все реплицированные колбы адаптированной линии в один стерильный сосуд с помощью асептической техники для создания однородной мастер-культуры.
2. Подготовка материала для обслуживания
   1. Приготовьте свежую среду на основе маниоки в выбранной концентрации поддержания, следуя процедурам, описанным в Методе 1.
   2. Выбирайте либо автоклавные, либо неавтоклавированные носители в зависимости от экспериментальных требований.
   3. Сохраняйте одинаковое условие стерилизации во всех последующих проходах, чтобы обеспечить стабильность микробного воздействия.
3. Культуры для поддержания вакцинации
   1. Инокуляйте свежие материалы для обслуживания 20% (v/v) консолидированной мастер-культуры.
   2. Аккуратно смешивайте культуры вручную, чтобы равномерно распределить клетки, не вызывая сдвигового стресса.
   3. Инкубировать культуры в полной темноте при температуре 25 °C с непрерывным орбитальным колебанием при 120 x g для поддержания гетеротрофных условий роста.
4. Выполняйте регулярное обслуживание и проход
   1. Поддерживайте культуры с помощью мягкой ручной инверсии один раз в день, чтобы предотвратить длительное осаждение клеток и субстрата.
   2. Каждые 30 дней консолидуйте поддерживающие культуры, смешивая реплицированные фляжки с помощью асептической техники.
   3. Повторная вакцинация свежих поддерживающих средств с использованием консолидированной культуры, как описано в разделе 8.3.
5. Мониторинг стабильности культуры
   1. В каждом проходе оценивайте морфологию и подвижность клеток с помощью микроскопа составного света (brightfield) при 100×–400× полном увеличении (10× глазных с 10×–40× объективами).
   2. Сдвигаются в сторону увеличения кистирования, накопления клеточных обломков или снижения подвижности как индикаторы снижения стабильности культуры.

9 Сбор биомассы для анализа белков в следующем сегменте

1. Сбор образцов культуры
   1. В нужной конечной точке перенесите культурные объёмы в стерильные центрифугные трубки.
   2. Убедитесь, что образцы соответствуют полной культуре, аккуратно перемешивая колбы перед переносом.
2. Сбор биомассы с помощью центрифугирования
   1. Центрифуга берет образцы с ≥3 500 × г в течение 10 минут для гранулирования биомассы. Повторяйте этот шаг, если осадки ещё не полностью осели.
   2. Подтвердите формирование компактной клеточной гранулы на дне трубки.
3. Удалить супернатант
   1. Аккуратно декантируйте или убирайте пипетку, не нарушая гранулу.
   2. Утилизация супернатанта согласно протоколам лабораторных отходов.
4. Подготовка биомассы для дальнейшего анализа
   1. Сохраняйте клеточную гранулу для дальнейшей обработки (например, сушки, хранения или анализа белка).
   2. Если гранулы не обработаны сразу, храните при 4 °C для краткосрочного использования или замораживайте при длительном хранении.

10. Обработка данных и архивирование

1. Организация набора данных
   1. Внесите все количественные измерения, включая pH, концентрацию цианида, оценку жизнеспособности, количество клеток и значения биомассы, в разметированную электронную таблицу.
   2. Сохраняйте изображения микроскопии и связанные с ними заметки наблюдения, используя стандартизированные имена файлов, указывающих тип субстрата, концентрацию, идентичность деформации, номер реплицирования и дату отбора пробы (например, NAG40G_WT1_05-01-25).
2. Подготовка наборов данных для анализа
   1. Проверьте, что все экспериментальные репликации и запланированные временные точки представлены и завершены в наборе данных.
   2. Оцифровывайте все рукописные лабораторные записи и делайте резервные копии всех электронных файлов для безопасного хранения и предотвращения потери данных. Анализ данных и генерация рисунков выполнялись с помощью программного обеспечения для электронных таблиц (Microsoft Excel) и, где это было применимо, R (R Foundation for Statistical Computing). Все основные анализы могут быть воспроизведены с помощью расчётов на основе электронных таблиц, при этом R используется только для дополнительной визуализации.

Результаты

Следующие репрезентативные результаты иллюстрируют ожидаемые результаты при успешном применении описанного протокола, а также диапазон результатов, наблюдаемых в неоптимальных условиях. Репрезентативные данные, соответствующие этим результатам, показаны на рисунках 1, рисунке 2, рисунке 3, рисунке 4, рисунке 5, рисунке 6, рисунке 7. Вместе эти результаты дают практические рекомендации для интерпретации динамики роста, жизнеспособности, морфологии и белковых результатов при адаптации E. gracilis к субстратам на основе маниоки в гетеротрофных, полностью тёмных условиях культивирования. Кроме того, эти результаты подтверждают ключевые биологические результаты протокола, включая успешную адаптацию, устойчивый рост, высокую жизнеспособность, стабильную морфологию, стабильную работу по субстратам и измеримое производство белка.

В ходе экспериментов использовалось по три реплики на каждую обработку (все типы среды маниоки). Мы признаём, что количество репликий зависит от усмотрения и логистических ограничений любой группы, следующей вышеуказанным протоколам. Успешное применение этого протокола приводит к устойчивому гетеротрофному росту E. gracilis в средах на основе гарри в полностью тёмных условиях. Положительные результаты характеризуются плавными, сигмоидальными траекториями роста, ограниченной дивергенцией между репликатами и стабильной плотностью клеток в поздних фазах. Морфологические признаки, указывающие на положительные результаты и стабильно наблюдавшиеся в адаптированных популяциях, включали округлость клеток и толстые клеточные мембраны. В отличие от этого, нездоровые коллапсированные клетки обычно выглядят неправильно, фрагментированными или структурно поврежденными и связаны с снижением жизнеспособности, что отличает их от целых округлых или полуинцистированных форм, наблюдаемых в адаптированных культурах. Для справки приведены репрезентативные изображения дикого типа E. gracilis с характерной удлинённой морфологией (рисунок 8), чтобы отличить исходную клеточную структуру от адаптированных или изменённых форм. Культуры, выращенные с 30 г ^L-1 гарри, демонстрировали более высокий интегрированный рост, измеряемый площадью под кривой роста (AUC), по сравнению с более низкими концентрациями, что свидетельствует о более эффективном использовании субстрата маниоки и успешной физиологической адаптации (см. рисунок 1).

Неоптимальные результаты обычно наблюдаются при более низких концентрациях гарри (10–20 г ^L-1), где рост заметен, но его масштаб уменьшается и он более варьируется между репликами. При более высоких концентрациях (40–50 г ^L-1) культуры могут достигать повышенной максимальной плотности клеток; однако эти состояния часто характеризуются задержкой стабилизации или повышенной временной изменчивостью (см. рисунок 2).

В успешных экспериментах жизнеспособность клеток остаётся высокой на протяжении всего периода культуры, с лишь незначительными колебаниями в середине эксперимента. Тесты исключения Trypan Blue показывают, что культуры, поддерживаемые при 30 г ^L-1 гарри, сохраняют большую долю жизнеспособных (неокрашенных) клеток по сравнению с нежизнеспособными (с синим окрашением) клетками в течение выбранных временных моментов (см. рисунок 3). Отклонения от этого паттерна, включая увеличение доли окрашенных клеток, снижение подвижности или сдвиги в сторону округлых или коллапсов морфологий, могут указывать на неоптимальные условия и служить ранними триггерами для устранения неполадок. Оценки жизнеспособности и морфологии основывались на согласованных критериях наблюдения, включая целостность клеток, направленную подвижность и относительную распространённость вытянутых и округлых или свернутых форм.

Субоптимальные результаты характеризуются временным снижением жизнеспособности, чаще всего наблюдаемым при более высоких концентрациях гарри. Частичное восстановление может наблюдаться в более поздние временные моменты; однако эти условия демонстрируют повышенную вариабельность жизнеспособности в течение культурного периода (рисунок 4). Эти модели роста показывают, что концентрации промежуточных субстратов (например, 30 г ^L-1) обеспечивают баланс между доступностью питательных веществ и стрессом, что приводит к более стабильному росту. Эти тенденции отражают влияние условий предварительной обработки и поэтапной адаптации на производительность культуры, поскольку постепенное воздействие растущей сложности субстрата способствует улучшению физиологической стабильности и воспроизводимому росту. Низкие концентрации ограничивают производство биомассы, а более высокие — к большей изменчивости и задержке стабилизации.

Морфологическая оценка обеспечивает качественный показатель статуса адаптации. Положительные результаты включают появление и сохранение округлых или полуинцистированных клеток с пониженной подвижностью, которые сохраняются целыми при повторяющем субкультурировании (рисунок 5).

В отличие от этого, субоптимальные культуры, в основном связанные с дикими штаммами или ранними стадиями адаптации, демонстрируют резкие переходы от удлинённых, подвижных клеток к неправильным или коллапсированным морфологиям, совпадающим с понижением стабильности роста.

При применении протокола к дополнительным субстратам, полученным из маниоки, включая пульпу, гранулы и кожуры, адаптированные культуры E. gracilis демонстрируют воспроизводимый рост на различных типах субстратов. Положительные результаты характеризуются более ранней стабилизацией кривых роста и снижением снижения на поздних стадиях по сравнению с культурами дикого типа (рисунок 6).

К субоптимальным результатам относятся задержка начала роста или повышенная вариабельность репликации, особенно в субстратах с большей физической гетерогенностью.

Успешная реализация протокола приводит к получению биомассы E. gracilis с измеряемым содержанием сырого белка, количественно оценённым с помощью внешнего лабораторного анализа с использованием метода сгорания (Dumas). Проценты белков, наблюдаемые в адаптированных культурах, сопоставимы с теми, что измеряются в культурах дикого типа, при этом более высокий общий выброс белка соответствует увеличению накопления биомассы (см. рисунок 7).

Мониторинг химии среды поддерживал взаимодействие культуры и субстрата во время адаптации и подтверждал включение измерений pH и цианида в протокол. Значения pH показали постепенные сдвиги со временем, что указывает на метаболическую активность и использование субстрата, с более стабильными тенденциями в адаптированных культурах. Измерения цианида дополнительно подтвердили это: адаптированные культуры показали снижение обнаруживаемых уровней, тогда как культуры дикого типа оставались более вариабельными. Вместе эти результаты демонстрируют, что эти этапы мониторинга эффективно фиксируют изменения в химии медиа, связанные с адаптацией, и поддерживают интерпретацию культурного перформанса. Хотя основные механизмы не были исследованы, это представляет собой важную область для будущих исследований, особенно для промышленных применений.

Долгосрочный рабочий процесс поддержания и консолидации обеспечивал дальнейшую жизнеспособность адаптивной линии Euglena gracilis на протяжении длительного периода культуры. Культуры, поддерживаемые через многократное пассажирование, стабильно сохраняли подвижность, характерную морфологию и стабильное поведение роста на протяжении всех циклов поддержания. Хотя долгосрочная эффективность количественно не оценивалась, эти наблюдения являются репрезентативным доказательством того, что адаптированная линия может надежно сохраняться при заданных условиях.

Вместе эти результаты подтверждают, что протокол адаптации поддерживает устойчивый рост, жизнеспособность и производство биомассы E. gracilis на субстратах на основе маниоки, обеспечивая стабильную эффективность и снижение уровня цианида со временем.

Все рисунки и таблицы предоставлены как отдельные файлы и не встроены в рукописный документ. Предпочтения по размещению рисунков и таблиц указаны в тексте рукописи с помощью примечаний в скобках (например, (Рисунок 1)). Если не указано иное, все рисунки и таблицы должны быть размещены ниже раздела Representative Results в итоговой публикации.

Все фигуры представлены как отдельные файлы, а многопанельные фигуры представлены как единое комбинированное изображение. Микроскопические изображения включают масштабные полосы в каждой панели. Цифры данных включают маркированные оси с определёнными единицами измерения, а полоски ошибок указаны в соответствующих легендах рисунков.

Все таблицы подаются как отдельные .xls или .xlsx файлы и содержат необработанные или суммирные числовые данные без декоративного форматирования.

Рисунок 1: Динамика роста E. gracilis , культивируемой при 10, 20 и 30 ^gL-1 garri в полностью тёмных условиях. Средние плотности клеток показываются со временем для каждой концентрации субстрата. Полоски ошибок обозначают SEM в биологических репликах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Ростовые показатели E. gracilis при повышенных концентрациях гарри (30–50 г ^L-1). Траектории плотности клеток иллюстрируют различия в пиковой плотности, времени стабилизации и вариабельности при более высоких концентрациях субстрата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Тенденции к жизнеспособности клеток E. gracilis , культивируемого в 30 ^gL-1 garri, измеренных по исключению Trypan Blue.Пропорция жизнеспособных клеток показана по выбранным временным точкам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Колебания жизнеспособности E. gracilis , культивируемые при более высоких концентрациях гарри. В течение экспериментального периода наблюдаются временные изменения жизнеспособности клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Репрезентативная морфология адаптивных популяций E. gracilis . Репрезентативные изображения инвертированного света показывают округлые и полуинцистированные клетки, наблюдаемые после адаптации. Шкала = XX мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Характеристики роста адаптивного и дикого типа E. gracilis на субстратах, полученных из маниоки. Траектории роста показаны для адаптированных и диких культур, выращиваемых на различных продуктах маниоки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Содержание сырого белка и общий выброс белка биомассы E . gracilis, выращенного в маниоке. Содержание белка количественно оценивалось с помощью внешнего анализа с использованием метода SGS Combustion (Dumas). Общий выработка белка показана вместе с накоплением биомассы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8: Репрезентативная морфология дикого типа E. gracilis при стандартных условиях (увеличение в 40 раз). Репрезентативное изображение здорового, неадаптированного Euglena gracilis с характерной удлинённой морфологией при световой микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Центральным фактором успеха в этом протоколе является баланс между концентрацией субстрата маниоки и физиологической стабильностью при гетеротрофном культивировании E. gracilis. Материалы, полученные из маниоки, вводят физическую гетерогенность, остаточные частицы и переменную кинетику высвобождения питательных веществ, которые напрямую влияют на поведение роста и стабильность^{культуры 2,3}. Среди этапов протокола подготовка подложки и выбор концентрации являются наиболее чувствительными контрольными точками. Как показали репрезентативные результаты, концентрации промежуточных субстратов надежно поддерживают устойчивый рост с ограниченным расхождением по репликам, тогда как низкие концентрации ограничивают накопление биомассы, а более высокие концентрации увеличивают временную вариабельность и временные стрессовые реакции. Эти результаты подчёркивают, что максимальная нагрузка на субстрат не всегда обеспечивает оптимальную или стабильную производительность культивации при работе с разнородными агропромышленными материалами. Выбранные этапы предварительной обработки и диапазоны концентрации субстрата были разработаны для постепенного вызова E. gracilis при растущей химической и микробной сложности. Наблюдаемые различия в стабильности роста и жизнеспособности при этих условиях подтверждают обоснованность такого поэтапного подхода и подтверждают, что концентрации промежуточных субстратов обеспечивают баланс между доступностью питательных веществ и физиологическим стрессом.

Обработка культур во время гетеротрофного роста дополнительно влияет на результаты адаптации. Регулярное, но мягкое смешивание в полностью тёмных условиях было критически важным для поддержания контакта между клетками E. gracilis и подвешенным субстратом, при этом избегая чрезмерного сдвигового напряжения. Недостаточное смешивание способствовало осадконакоплению и локализованным градиентам питательных веществ, что запутало как показатели роста, так и жизнеспособности, особенно в неавтоклавированных^{средах 12}. Эти наблюдения совпадают с предыдущими отчетами, показывающими, что пространственная гетерогенность и неравномерное воздействие субстрата могут затруднять физиологические реакции в системах культивирования микроорганизмов. Поэтому протокол делает акцент на рутинной инверсии, а не на постоянной агитации, как на практическом компромиссе между однородностью и целостностью культуры.

Для учёта вариабельности, присущей субстратам на основе маниоки, протокол включает несколько точек устранения неполадок и гибкости. Автоклавирование ферментированной маниоки улучшало кратковременную консистенцию, снижая микробную нагрузку и изменяя структуру субстрата, особенно на ранних стадиях адаптации. В отличие от этого, неавтоклавные среды могут эффективно использоваться после успешной адаптации, при условии, что плотность инокулума и смешивание достаточны для поддержания стабильного роста. Такой поэтапный подход согласуется с предыдущими исследованиями, показывающими, что постепенное селективное давление позволяет микробным популяциям выдерживать растущую сложность окружающей среды со^{временем 13,14}. Продольный мониторинг был необходим в этом контексте, поскольку временные сокращения роста или жизнеспособности часто восстанавливались в последующих переходах без ущерба общей успешности адаптации.

Анализы жизнеспособности и морфологический мониторинг служили быстрыми диагностическими инструментами на протяжении всего процесса адаптации. Исключение Trypan Blue обеспечивало количественный показатель физиологической прочности, тогда как микроскопическая оценка подвижности и ферментации обеспечивала раннее предупреждение о неоптимальных условиях, таких как чрезмерная нагрузка субстрата или задержка^{акклиматизации 15}. Важно, что протокол акцентирует внимание на тенденциях во времени, а не на измерениях по одной точке, поскольку краткосрочные колебания жизнеспособности или морфологии не всегда предсказывали долгосрочный сбой культуры. Эта продольная перспектива оказалась критически важной для различия временных стрессовых реакций от устойчивого физиологического ухудшения. Снижение заметных уровней цианида, наблюдаемое во время культивации, указывает на частичную детоксикацию субстратов, полученных из маниоки, при описанных условиях. Эти сокращения могут быть результатом сочетания деградации, испарения и микробной активности, связанной с ферментацией. Хотя специфические биохимические механизмы и кинетика удаления цианида не были непосредственно изучены в данном исследовании, эти наблюдения подтверждают включение мониторинга цианида как практического индикатора трансформации субстрата и целесообразности культуры во время адаптации.

Следует учитывать несколько ограничений метода. Во-первых, процент сырого белка сам по себе не полностью отражает питательную ценность или функциональное качество белка, и интерпретация должна учитывать общий выброс биомассы вместе с показателями^{состава 16}. Во-вторых, использование минимально обработанных, разнородных субстратов вносит изменчивость, которую невозможно устранить даже при стандартизированной подготовке. Эта проблема хорошо признана в агропромышленной^{биопереработке 17} и отражает реальные ограничения, а не экспериментальные недостатки. В-третьих, хотя протокол оптимизирован для лабораторного и пилотного выращивания, масштабирование за пределами стендовых объёмов потребует дополнительного контроля динамики смешивания, переноса кислорода и обращения с твердыми телами, а также учёта конфигурации реактора и гидродинамических условий, как было показано для других микроводорослей и протистных^{систем 18}.

По сравнению с существующими методами выращивания E. gracilis, основанными на рафинированных сахарах или строго контролируемых фототрофных системах, этот протокол обладает явным методологическим преимуществом, позволяя выращивать на недорогих субстратах, полученных из маниоки, в полностью гетеротрофных условиях. Этот подход избегает зависимости от очищенных источников^{углерода 19,20} и не требует специализированной инфраструктуры освещения, что расширяет оперативную гибкость выращивания E. gracilis. Это особенно актуально для приложений, ориентированных на эффективность ресурсов, валоризацию отходов и децентрализованное производство в регионах производства маниоки.

Более широкое значение этого метода заключается в его применимости для исследований, связанных с микробной адаптацией, устойчивой биообработкой и валоризацией биомассы. Объединяя постепенное воздействие субстрата с простыми, недорогими инструментами мониторинга, протокол предоставляет воспроизводимую основу для интеграции нетрадиционных субстратов в рабочие процессы по выращиванию микробов. Хотя он разработан для E. gracilis, основные принципы поэтапной адаптации, лонгитюдной оценки эффективности и морфологически обоснованного принятия решений в широком смысле применимы к другим микроводорослим и протистным системам, исследуемым для применения в циркулярной^{биоэкономике 21,22}. Таким образом, этот протокол служит не только методом культивации, но и обобщаемой основой для прикладной микробной адаптации в условиях реальных ограничений субстрата. Этот метод был разработан с приоритетом доступности и поэтому наиболее подходит для лабораторий или прикладных исследовательских учреждений с базовой микробиологической инфраструктурой и доступом к ключевым биологическим ресурсам, в частности культурам Euglena gracilis и субстратам, полученным из маниоки. Кроме того, система обеспечивает временную гибкость, поскольку среда на основе маниоки может готовиться и ферментироваться круглый год без сезонных ограничений. Хотя этот протокол был разработан и валидирован на лабораторном уровне, использование недорогих субстратов, полученных из маниоки, и минимальные требования к обработке поддерживают потенциальную масштабируемость для крупных систем выращивания.

Хотя этот протокол устанавливает воспроизводимую основу адаптации и культивации, дальнейший количественный анализ кинетики роста, продуктивности биомассы и эффективности преобразования субстрата будет важен для оптимизации производительности в масштабируемых или промышленных приложениях.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Автоклав - 533LS паровой стерилизатор	Getinge	533LS	Паровая стерилизация кассавного среды. Стерилизуйте среду с использованием жидкого цикла.
Bright-Line™ гемоцитометр замена покровное стекло	Millipore Sigma	BR723015- 100EA	Специальные толстые покровные стёкла, разработанные для использования в гемоцитометре.
Сушеная кассава пюре	Psaltry International	N/A	Предоставленный субстрат кассавы
Пеллеты кассавы	Psaltry International	N/A	Предоставленный субстрат кассавы
Оболочки кассавы	Psaltry International	N/A	Предоставленный субстрат кассавы
Субстрат кассавы (гарри)	Местный поставщик	N/A	Полученный из кассавы гарри используется как источник углерода с применением деионизированной воды.
Центрифуга Thermo Scientific Sorvall ST16 Центрифуга	Thermo Scientific Sorvall ST16 Центрифуга	75004241	Способна обеспечить ≥3,500 × g, используется для получения биомассы.
Центрифужные пробирки Например, Axygen (A Corning Brand)	Corning	MCT-150-C-S	Стерильные, объём не менее 1,5 мл
Чистая вода Например, UltraPure™ DNase/RNase- свободная дистиллированная вода	ThermoFisher Scientific	10977035	Деионизированная или дистиллированная. Используется для приготовления среды
Комплексный световой микроскоп	Olympus	N/A	Стандартный комплексный микроскоп, подходящий для рутинного наблюдения и подсчёта клеток.
Тест на цианиды Полоски, колориметрические. CN- 10-30 мг/л	MQuant	110044	Полуколичественное обнаружение цианидов. Утилизируйте как опасные отходы
Стерильная стандартная чаша для взвешивания	Fisher Scientific	01-549-750	Используется для взвешивания субстратов кассавы и сухой биомассы.
Euglena gracilis (адаптированная линия)	N/A	N/A	Созданный в этом исследовании адаптированный штамм Euglena, приспособленный к кассавам
Euglena gracilis (дикий тип)	N/A	N/A	Неадаптированный ссылочный штамм. Поддерживайте одинаковые стандартные условия.
Компоненты среды роста Euglena	Различные	N/A	Базальная среда Euglena, приготовленная в соответствии с формулами стандартов лаборатории.
FreeZone 6 литров Консольный морозильный сушильный аппарат	Labconco	70061xxxx	Используется для дегидратации биомассы
Гемоцитометр со стандартными линиями	Weber Scientific	NC1587539	Используется для ручного подсчёта клеток.
Магнитный миксер с нагревательной пластиной	IKA	N/A	Необязательный; улучшает однородность при приготовлении среды и суспензии субстрата.
Микропипетки (P20, P200, P1000)	Eppendorf	N/A	Пипетки с регулируемым объёмом, используемые для асептической передачи жидкостей.
Мини-центрифуга	Eppendorf	N/A	Необязательный; облегчает быстрое осажение при получении биомассы.
Парафильм	Bemis	PM996	Используется для временного пломбирования колб или пластин, когда отсутствуют проточные крышки.
Индикаторы pH полоски	Fisher Scientific	13-640-520	Альтернатива pH-метру для быстрой качественной оценки культуральной среды.
PH-метр с зондиком Thermo Scientific Orion Star A211 Настольный pH метр	Thermo Scientific Orion Star A211 Настольный pH метр	13-645-519	Калибруется перед использованием. Для измерения pH супернатанта культуры
Холодильное хранение (4°C)	Frigidaire	FRT18S6JW7	Краткосрочное хранение среды
Инкубатор с вращающимся движением (в темноте)	Thermolyne	M49235	Орбитальный инкубатор с вращающимся движением, способный обеспечить 100–150 об/мин, температурный диапазон 24–28 °C; используется в темноте для поддержания гетеротрофного роста Euglena.
Распылитель (32 унции)	Boardwalk	BWK03010	Используется для стерилизации на рабочей поверхности и рутинной асептической обработки (70% раствор этанола)
Программное обеспечение для