Методическая статья

Микроваскулярная перфузия, контролируемая лазерной спекл-контрастной визуализацией при ишемии-реперфузии почек у мышей

315 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70762

⸱

27 февраля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, First Affiliated Hospital & Cardiovascular Research Center, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Лазерная система контрастной визуализации использовалась для мониторинга изменений кровотока в почечной микрососудистой области во время односторонней ишемии-реперфузии почек после резекции правой почки у мышей.

Аннотация

Лазерная спекл-контрастная визуализация (LSCI) — это неинвазивная методика измерения поверхностной перфузии крови на больших площадях. Благодаря высокому пространственно-временному разрешению LSCI частично количественно оценивает гетерогенные изменения кровотока в различных областях изображенной области. Здесь мы демонстрируем метод ЛСКИ для записи кровотока во время одностороннего ишемии-реперфузионного повреждения почек (ИРС) у мышей. После правой нефрэктомии положение мыши и фокусная точка цели системы LSCI были корректированы так, чтобы левая почка находилась в поле зрения. LSCI-сканирование проводилось до, во время и после ишемии почек. Кроме того, при выборе интересующих регионов (ROI) одновременно контролировался кровоток в этих областях. Метод LSCI визуализирует микрососудистую перфузию почки и позволяет в реальном времени картировать кровоток. Он может использоваться для мониторинга микрососудистого кровотока и оценки влияния вмешательства на кинетику реперфузии и пространственную однородность во время мышиной почечной ИРИ или других подобных животных моделей.

Введение

Ишемии-реперфузионное повреждение (ИРИ) является одной из ведущих причин острого поражения почек (ОПП), которая связана с высокой заболеваемостью и смертностью упациентов 1,2. Изменение почечной гемодинамики является одним из ключевых факторов индуцированногоОПП 1. Микроциркуляторная дисфункция, вызванная ИК, является основной причиной развития повреждений, приводящей к дефициту кислорода и нарушениям митохондрийклеток 3,4. Поэтому мониторинг изменений кровотока в реальном времени является эффективным методом обеспечения успешной ишемии или реперфузии почек и оценки степени ИРР в животных моделях для этого заболевания.

Существует множество методов измерения микрососудистой перфузии тканей, включая лазерную доплеровскую флоуметрию (LDF)5, аутофлуоресцентную визуализацию с никотинамидом адениндинуклеотиддегидрогеназой (NADH) 6,7,8, инфракраснуювизуализацию 9 и индокианиново-зеленую (ICG)ангиографию 10. Среди них инфракрасная визуализация и автофлуоресценция NADH косвенно измеряют микрососудистую перфузию. LDF, используя оптический зонд, отслеживает только региональныйкровоток 5, а сканирующий LDF недостаточно быстрый для отслеживания изменений тканевой микрососудистой перфузии в реальном времени при I/Rусловиях 11. ICG-ангиография также может выявить закупоренные сосудыпочек 10, но требует применения контрастного вещества, что ограничивает его использование ограниченным числомизмерений 12. Лазерная спекл-контрастная визуализация (LSCI) — это эффективный неинвазивный метод мониторинга микроперфузии почек в реальном времени. Он применялся для получения пространственно разрешённой информации, связанной с динамикой кровотока. Когда когерентный пучок освещается на шероховатую поверхность, отражённые или рассеянные световые волны будут взаимодействовать друг с другом из-за мельчайших различий путей, образуя случайное распределение ярких и тёмных пятен, известное как «пятнистость». LSCI картирует скорость кровотока в поверхностных тканях, анализируя степень размытости «динамической пятнышки», образующейся при облучении тканилазером 12,14,15. В этом исследовании система LSCI работала с длиной волны лазера 785 нм с пространственным разрешением 3 мкм, с регулируемым полем зрения от 6,3 мм × 4,7 мм и 42 мм × 31 мм, а также скоростью изображения до 120 кадров в секунду, что позволило высокоразрешающее, в реальном времени картировать кортикальную микроваскулярную перфузию. Учитывая эти преимущества, LSCI применяется в различных экспериментальных и клинических контекстах для мониторинга кровотока, включаяожоговые раны 16,перфузию сетчатки 17, кровоток вмозге 18,пищевода 19 икишечник 20.

Следует отметить, что LSCI в первую очередь оценивает перфузию в поверхностных тканях, обеспечивает относительные, а не абсолютные значения потока и может зависеть от оптических свойств ткани и артефактов движения. Эти присущие характеристики учитываются при интерпретации изображений.

Эта работа, использующая модель с правой нефрэктомией для облегчения экспозиции и визуализации противоположной почки, отслеживала изменения микрососудистой перфузии до, во время и после ишемии в односторонней модели мышей с использованием LSCI и продемонстрировала пространственную гетерогенность кровотока на поверхности почки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных соответствовали Руководству NIH по уходу и использованию лабораторных животных и Руководству по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского колледжа Университета Шаньтоу. Для устранения гендерных и штамовых различий в эффектах IRI в исследовании использовались только самцы мышей C57BL/6N. Все мыши были сопоставлены по возрасту и весу, чтобы получить сопоставимые результаты. Использовался размер выборки n = 5, что соответствует предыдущим методологическим исследованиям с использованием LSCI для техническойвалидации 21. Животные получили гуманный уход и были усыплены после экспериментов с помощью вдыханияCO2 . Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

Перед началом операции включите лазерную систему контрастной визуализации. Система, использованная в этом исследовании, работает с лазером диаметром 785 нм. Установите рабочее расстояние примерно на 15-20 см над операционным полем. Система рассчитывает кровоток в лазерных петочках перфузии (LSPU) на основе алгоритма пространственного контраста. Убедитесь, что инструмент прогрет и стабилен перед началом.

1. Подготовка животных и лапаротомия

  1. Стерилизуйте хирургический стол перед каждой процедурой. Подготовьте и разместите все необходимые материалы (стерилизованные инструменты и ватные палочки, марлю, предварительно разбавленные анестетики, грелку, сосудистый зажим, физиологический раствор, депиляционный крем, ватные шарики, швы, антисептики для кожи и швы) на хирургическом столе.
  2. Введите мелоксикам (0,2 мг/кг массы тела; подкожную инъекцию) мыши за 30 минут до облегчения боли.
  3. Налейте определённое количество стерилизованного физиологического раствора в чистый контейнер. Затем возьмите кусок марли и вырежьте подходящее отверстие посередине.
  4. Анестезия мыши путём внутрибрюшнической инъекции 2,5% триброметанола (400 мг/кг массы тела; ранее разбавленный стерильным физиологическим раствором).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трибромеэтанол использовался в качестве анестетика во время правой нефрэктомии. А 1% изофлуран использовался для анестезии во время длительных процедур контроля кровотока.
  5. Положите мышь на грелку с помощью скотча и используйте депиляционный крем, чтобы удалить волосы на животе. Во время операции используйте грелку, чтобы поддерживать температуру прямой кишки на уровне 37 °C ± 0,5 °C.
  6. Сначала продезинфицируйте кожу в хирургической области 75% спиртом, а затем йодофором с помощью ватной палочки.
  7. Щипните щипцами, чтобы зажать палец мыши. Когда мышь не проявляет боли, сделайте вертикальный разрез по средней линии живота с помощью ножниц. Аккуратно отдельте кожу от брюшины, затем разрежьте брюшин и войдите в брюшную полость.
  8. Примените ретрактор к мыши для оптимизации видимости и накройте операционное поле марлей, одновременно выравнивая щель, на марле с брюшной полостью, и увлажняйте её физиологическим раствором.

2. Правый нефрэктомия

  1. Используйте ватную палочку, чтобы аккуратно прижать кишечник к одной стороне марли, обнажая правую почку и окружающие ткани. Сложите марлю, чтобы покрыть кишечник, и смочите его обычным физиологическим раствором, чтобы предотвратить пересыхание кишечника.
  2. Используйте наклонные щипцы, чтобы поднять правый мочеточник. Пропустите две нити 6-0 через мочеточник и выполните перевязку в двух позициях.
  3. Перерезайте мочеточник между двумя лигатурами с помощью микроножниц.
  4. После увлажнения ватных шариков обычным физиологическим раствором используйте тонкие щипцы, чтобы поднять ватные шарики, аккуратно поднимать печень вверх и фиксировать ватными шариками, чтобы обнажать почки и кровеносные сосуды с правой стороны.
  5. Используйте наклонные щипцы, чтобы тупо разделить промежностные жировые подушечки по бокам правой почки, пока почечная артерия и вена не будут полностью открыты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одновременно отделяйте массу надпочечниковой ткани, расположенную над почкой.
  6. Аккуратно продвигайте наклонные щипцы под почечную артерию и вену, чтобы создать канал. Затем проведите швом из шёлка размером 6-0 вокруг сосудов, чтобы связать их вместе.
  7. Перерезать окклюзированную почечную артерию и вену, расположенную рядом с почкой. Удалять почку вместе с оставшейся прилипшей тканью.
  8. Удалите ватный шарик, которым удерживают печень.

3. Мониторинг кровотока в почках с помощью лазерной контрастной визуализации (LSCI) во время ишемии-реперфузии

  1. Включите систему LSCI и специальное программное обеспечение прибора.
  2. Нажмите на оригинальное изображение и предварительный просмотр, чтобы увидеть необработаное, необработанное изображение хирургического поля.
  3. Измените положение мышей, поддерживайте анестезию с помощью 1% изофлурана, подаваемого со скоростью 600 мл/мин через носовой конус, и регулируйте увеличение камеры при наблюдении исходного изображения, чтобы получить чёткий обзор целевой почки.
  4. Нажмите на Simultaneous Display, чтобы увидеть изображение кровотока в реальном времени. Установите увеличение на 2,5× и выберите Автоматическую регулировку кровотока для оптимизации изображения. Затем заблокируйте параметры кровотока. Кроме того, настройте запись одного кадра изображения каждые 5000 мс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Влажные ватные шарики могут использоваться для обеспечения стабильного положения почки и защиты окружающих органов и тканей от неё, усиливая различие между областью почки и фоном.
  5. Установите размер параметров квадратной площади в 112 и равномерно расположите 5 квадратных областей в фиксированной ориентации на виде почек. Нажмите на Регистрацию и запись изображения в реальном времени , чтобы начать запись данных о кровотоке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аппарат автоматически записывает лазерные точки перфузии (LSPU), которые отображают единицы кровотока в реальном времени в ROI и могут использоваться для анализа. В процессе обнаружения движение, связанное с дыханием, или изменения окружающей среды могут привести к смещению поля зрения. Если система указывает на это в зоне обнаружения, запись текущего времени следует прекратить. Затем нажмите на Регистрацию изображения в реальном времени и снова запишите .
  6. После записи исходного уровня в 30 минут отдельте жировую ткань вокруг левых сосудов почек. Используйте гемостатические щипцы, чтобы схватить микрозажим и поместить его через левую почечную артерию и вену возле гилюма. Продолжайте мониторинг в реальном времени ещё 30 минут.
  7. Освободите микрозажим для запуска реперфузии. Отслеживайте и фиксируйте восстановление почечного микрососудистого кровотока в реальном времени.
  8. После мониторинга реперфузии кровотока не менее 60 минут прекратите мониторинг и зашвите разрез брюшной полости швом с швом 7-0.

4. Послеоперационное восстановление и уход

  1. Вводите жидкость с внутрибрюшинной инъекцией физиологического раствора 1 мл для предотвращения обезвоживания после операции.
  2. Держите мышей на грелке. Внимательно следите за мышами, пока они не придут в сознание, не станут бодрыми и не смогут выпрямиться.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Целью этой статьи было выявление изменений кровотока в почках при индуцированной ОПП. Поэтому мы использовали распространённую мышиную модель, включающую правую нефрэктомию (рисунок 1A), а затем процедуру IR на противоположной почке (рисунок 1B). Поскольку требовался мониторинг кровотока в реальном времени во время IRI, все манипуляции на мышах выполнялись в области прибора на протяжении всего процесса (рису...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе описывается применение системы LSCI для визуализации динамики кровотока в почечной микрососудистой области в реальном времени во время ИРТ у мышей. Протокол обладает значительным преимуществом по сравнению с традиционными измерениями конечных точек или методами с ограниченным пространственным разрешением, такими как LDF, обеспечивая двумерную карту перфузии, фиксирующую региональную гетерогенность в микроциркуляции почек. Эффективность и удобство LSCI для интраоперационно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Инновационной командной исследовательской программой для университетов провинции Гуандун (2022KCXTD009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Абсорберный контейнер (для анестезии)Shenzhen Laiyue Biotech Co., Ltd, Китай10-0210
Алкоголь, медицина (75%)ХЭНЛИЯ, Синьцзян, КитайН/ДДезинфицирующее средство для кожи
Анестетический вапорайзерMidmarkhttps://www.midmark.com/animal-health/products/anesthesia/detail/matrx-vip-3000-veterinary-vaporizer
Ватные палочкиQingdao Hainuo Biological Engineering Co., Ltd, Китайhttps://www.hainuocn.com/index/detail/448.html
Депиляционный кремVEEThttps://www.veet.com.cn/jingchun/whx
Марлевый бинтWinner Medical Co., Ltd, Шэньчжэнь, Китайhttps://www.winnermedical.com/gauze-bandage.html
ГрелкаRenqiu Dingsheng Heating Equipment Co., Ltd, КитайHD-1902Для поддержания температуры тела
Раствор йодофораТайсинкан, Цзиньсянь, Китайhttps://www.11467.com/nanchang/co/120661.htmАнтисептик для кожи
ИзофлуранRWD Life Science Co., Ltd, КитайR510-22-10Ингаляционный анестетик
Лазерная спекл-контрастная визуализация (LSCI)Hubei Xunwei Optoelectronic Technology Co., Ltd, КитайSIM BFI HR PROЭквивалентная система MoorFLPI-2
МелоксикамQilu Animal Health Products Co., Ltd, Китайhttps://en.qiludb.com/companion_animal/500.html0,2 мг на кг массы тела; анальгетик
Микро-зажимShanghai Medical Instrument(Group) Co., Ltd, КитайW40140Сосудистый зажим
Обычный физиологический раствор (0,9% хлорида натрия)Cisen Pharmaceutical Co., Ltd, Китайhttps://www.cisen-pharma.com/index/shows?catid=42&id=62
Шёлковый плетённый шов (6-0)Yangzhou Fuda Medical Devices Co., Ltd, Китайhttp://www.fdma.com.cn/products_detail/12.htmlДля лигирования сосудов
Шёлковый плетённый шов (7-0)Wego Terumo (Weihai) Medical Products Co., Ltd, Китайhttps://www.weigaoholding.com/Для закрывания раны используются хирургические швы с изогнутой иглой
Шприц (1 мл)Shandong Ande Healthcare Apparatus Co., Ltd, Китайhttps://www.andehealthcare.com/html/chanpinzhanshi/Medication-Delivery/syringes/131.htmlС иглой 26 G
ТриброметанолСигма-ОлдричT48402-100G2,5% раствора; Инъекционный анестетик

Ссылки

  1. Weight, S. C., Bell, P. R., Nicholson, M. L. Renal ischaemia-reperfusion injury. Br J Surg. 83 (2), 162-170 (1996).
  2. Schrier, R. W., Wang, W., Poole, B., Mitra, A. Acute renal failure: Definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy. J Clin Invest. 114 (1), 5-14 (2004).
  3. Kosieradzki, M., Rowiński, W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: Mechanisms and prevention. Transplant Proc. 40 (10), 3279-3288 (2008).
  4. Legrand, M., Mik, E. G., Johannes, T., Payen, D., Ince, C. Renal hypoxia and dysoxia after reperfusion of the ischemic kidney. Mol Med. 14 (7-8), 502-516 (2008).
  5. Zhu, X., et al. Ischemic preconditioning prevents in vivo hyperoxygenation in postischemic myocardium with preservation of mitochondrial oxygen consumption. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1442-H1450 (2007).
  6. Coremans, J. M. C. C., et al. Pretransplantation assessment of renal viability with NADH fluorimetry. Kidney Int. 57 (2), 671-683 (2000).
  7. Fitzgerald, J. T., Demos, S., Michalopoulou, A., Pierce, J. L., Troppmann, C. Assessment of renal ischemia by optical spectroscopy. J Surg Res. 122 (1), 21-28 (2004).
  8. Raman, R. N., Pivetti, C. D., Matthews, D. L., Troppmann, C., Demos, S. G. A non-contact method and instrumentation to monitor renal ischemia and reperfusion with optical spectroscopy. Opt Express. 17 (2), 894(2009).
  9. Gorbach, A. M., et al. Assessment of critical renal ischemia with real-time infrared imaging. J Surg Res. 149 (2), 310-318 (2008).
  10. Ietto, G., et al. Indocyanine green angiography for quality assessment of the kidney during transplantation: An outcome predictor prospective study. Transplant Proc. 53 (6), 1892-1896 (2021).
  11. Bezemer, R., et al. Real-time assessment of renal cortical microvascular perfusion heterogeneities using near-infrared laser speckle imaging. Opt Express. 18 (14), 15054(2010).
  12. Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. Ann Biomed Eng. 40 (2), 367-377 (2012).
  13. Heeman, W., et al. Real-time visualization of renal microperfusion using laser speckle contrast imaging. J Biomed Opt. 26 (05), 056004(2021).
  14. Briers, J. D. Laser speckle contrast analysis (LASCA): A nonscanning, full-field technique for monitoring capillary blood flow. J Biomed Opt. 1 (2), 174(1996).
  15. Boas, D. A., Dunn, A. K. Laser speckle contrast imaging in biomedical optics. J Biomed Opt. 15 (1), 011109(2010).
  16. Stewart, C. J., et al. A comparison of two laser-based methods for determination of burn scar perfusion: Laser Doppler versus laser speckle imaging. Burns. 31 (6), 744-752 (2005).
  17. Tamaki, Y., Araie, M., Kawamoto, E., Eguchi, S., Fujii, H. Noncontact, two-dimensional measurement of retinal microcirculation using laser speckle phenomenon. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35 (11), 3825-3834 (1994).
  18. Kazmi, S. S., Richards, L. M., Schrandt, C. J., Davis, M. A., Dunn, A. K. Expanding applications, accuracy, and interpretation of laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (7), 1076-1084 (2015).
  19. Ambrus, R., et al. Evaluation of gastric microcirculation by laser speckle contrast imaging during esophagectomy. J Am Coll Surg. 225 (3), 395-402 (2017).
  20. Knudsen, K., et al. Laser speckle contrast imaging to evaluate bowel lesions in neonates with NEC. Eur J Pediatr Surg Rep. 5 (1), e43-e46 (2017).
  21. Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neurosci. 23 (1), 80(2022).
  22. Hren, R., Brezar, S. K., Marhl, U., Sersa, G. Laser speckle contrast imaging of perfusion in oncological clinical applications: A literature review. Radiol Oncol. 58 (3), 326-334 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи