$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Это исследование было одобрено Комитетом по научной этике Службы здравоохранения Консепсьона. Человеческая костная ткань была получена из головок бедрен, пожертвованных пациентами, проходящими операцию по замене тазобедренного сустава в травматологической больнице Консепсьона, Чили, после письменного информированного согласия. Образцы хранились при −80 °C до использования. Все процедуры соответствовали институциональным рекомендациям по этическому использованию человеческих тканей в исследованиях. Вся человеческая костная ткань была получена с бедренных головок, пожертвованных пациентами травматологической больницы Консепсьона, Чили, с информированного согласия и одобрения Научного этического комитета Службы здравоохранения Консепсьона. Все процедуры соответствуют институциональным рекомендациям по использованию человеческих тканей.
1. Синтез GelMA
- Растворить 10 г желатина типа A в 100 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS, pH 7,5) при 60 °C при постоянном перемешивании.
- Уменьшите температуру до 50 °C и добавьте 5 мл ангидрида метакрила со скоростью 0,5 мл/мин, аккуратно перемешивая 1–3 часа.
- Разведите реакционную смесь на 5× с PBS, предварительно нагретым при 40 °C, чтобы остановить реакцию.
- Диализ раствора с помощью мембраны 12–14 кДа против 3–5 л дистиллированной воды при 40 °C в течение 5–7 дней, заменяя воду ежедневно.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Важный этап) Обеспечьте полную ежедневную замену воды для удаления неотреагированного ангидрида метакрила.
- Лиофилизируйте диализованный раствор в течение 24 часов и храните лиофилизированный GelMA при 4 °C до использования.
2. Подготовка гидрогеля GelMA
- Подготовьте партии 10 мл гидрогелей GelMA при 5, 10 или 15% w/v%.
- Растворить 0,5, 1,0 или 1,5 г лиофилизированного GelMA в 9,5 мл деионизированной воды при температуре 50 °C.
- Охладите раствор до 37 °C.
- Добавьте 0,5 мл раствора фотоинициатора Irgacure 2959 (0,5 w/v% абсолютного этанола).
- Аккуратно перемешайте и поддерживайте раствор при 37 °C до стерильной фильтрации через мембранный фильтр из целлюлозы ацетата толщиной 0,22 мкм.
3. Децеллюляризация костей.
- Оттаивание бедра постепенно опускается до 25 °C. Разрежьте каждую головку бедра пополам, а затем на мелкие кусочки.
- Погрузите кусочки в стерильную дистиллированную воду при 60 °C и соникайте в течение 15 минут (40 кГц, непрерывно).
- Промывайте образцы в 300 мл дистиллированной воды, предварительно нагретой при 60 °C, встряхивая при 200 об/мин в течение 5 минут.
- Центрифуга при 1850 × г в течение 15 минут при 25 °C. Повторите промывку и центрифугу три раза.
- Стерилизуйте ткань с помощью соникации (40 кГц, непрерывно) в течение 10 минут при 60 °C в растворе, содержащем 3% перекиси водорода и 0,02% пероксиуксусной кислоты.
- Перенесите ткань в 300 мл этанола 70% и сониковать (40 кГц, непрерывно) на 10 минут при 21 °C.
- Промыйте образцы дважды дистиллированной водой на 300 мл, встряхните при 200 об/мин 10 минут при 60 °C и центрифугайте при 1850 × г в течение 15 минут при 25 °C.
- Сначала предварительно заморозьте кость при -80 °C в течение 4 часов, затем лиофилизуйте децеллюляризованную кость в течение 24 часов в широком основании, чтобы обеспечить равномерное сушение и избежать чрезмерной высоты образца при 0,05 мбар при -40–-60 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Критический этап) Убедитесь, что высота образца внутри контейнера не превышает 2–3 см, чтобы предотвратить неполную лиофилизацию.
4. Подготовка частиц костей
- Поместите децеллюляризованные фрагменты кости в колбы Эрленмайера объёмом 250 мл в стерилизационный раствор и гомогенизируйте с помощью гомогенизатора до получения однородного белого раствора (Дополнительное видео 1).
- Центрифугуйте при 1850 × г в течение 15 минут при 25 °C, сбросьте супернатант и дважды промыйте гранулу дистиллированной водой 300 мл при 25°C при перемешивании при 200 об/мин в течение 10 минут. Проведите финальную центрифугу при 1850 × г в течение 15 минут при 25 °C.
- Лиофилизируйте (0,05 мбар при -40–-60 °C) полученный материал в течение 48 часов и храните при -80 °C до использования.
- Механически измельчите лиофилизированную кортикальную или медуллярную кость с помощью стерилизованной керамической ступки до получения мелкого порошка (рисунок 1).
- Пропустите порошок через сетку или решето диаметром 200 мкм, взвесьте готовый материал и храните при -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Критический этап) Убедитесь, что порошок полностью сухой перед просеиванием, чтобы предотвратить скопление и неправильный выбор размера частиц.
Дополнительное видео 1: Процедура гомогенизации костей. Гомогенизация децеллюляризованных фрагментов кости с помощью гомогенизатора до образования равномерной белой суспензии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Рисунок 1: Подготовка микрочастиц костей. (A) Децеллюляризованные фрагменты кости после гомогенизации с помощью гомогенизатора OV5 и хранения при -80 °C. (B,C) Стерилизованный керамический раствор, используемый для измельчения децеллюляризованной кости в мелкий порошок. (D) Окончательные децеллюляризованные костей микрочастицы после просеивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
5. Изготовление костного геля
- Приготовьте 10 w/v% GelMA, растворив 1 г GelMA в 9,5 мл деионизированной воде при 50 °C.
- Охладите раствор до 37 °C и добавьте раствор фотоинициатора Irgacure 2959.
- Поддерживайте раствор при 37 °C и проводите стерильную фильтрацию с помощью фильтра 0,22 мкм.
- Добавьте деклелюляризованные костные микрочастицы (DBMP) при 1% w/v.
- Аккуратно смешивайте и пипетуйте вверх и вниз, избегая образования пузырей, при 40 °C, пока не получится однородная суспензия для образования костного геля (BG).
- Храните уровень глюкозы при 4 °C до 2 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Критический этап) Поддерживайте гидрогель выше температуры гелирования (≥37 °C) перед включением клетки, чтобы избежать преждевременного затвердевания.
6. Первичная культура остеоцитов
- Удаление костного мозга и первичная промывка
- Извлечение и измельчение костного мозга из внутренней части головки бедра с помощью стерильных хирургических инструментов (рисунок 2).
- Переложите измельченную ткань в стерильную чашку Петри.
- Промыйте ткань трижды α-MEM культурной средой с добавлением антибиотико-антимикотического раствора (100 мкг/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицин, 0,25 мкг/мл амфотерицин).
- Прополосните один раз Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
ПРИМЕЧАНИЕ: (Критический этап) Минимизировать время между извлечением и обработкой тканей для сохранения жизнеспособности клеток.
- Ферментативное пищеварение
- Инкубировать ткань в растворе коллагеназы типа I в течение 25 минут при 37 °C с мягким перемешиванием.
- Мойка с помощью HBSS.
- Повторите шаги 6.2.1–6.2.2 ещё два раза (три раза в сумме расщепления коллагеназы).
- Инкубировать ткань в этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА) с концентрацией 0,5 мМ в течение 25 минут при 37 °C.
- Мойте с помощью HBSS и повторяйте этап EDTA ещё два раза.
- Проведите последнее пищеварение коллагеназы типа I (25 минут при 37 °C), затем промывку HBSS.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Устранение неполадок) Неполное пищеварение может привести к низкому выходу клеток; При необходимости продлите ферментативную инкубацию на 5–10 минут.
- Восстановление и культивирование клеток
- Соберите раствор коллагеназы и перенесите окончательную промывку HBSS в центрифугную трубку объемом 50 мл.
- Центрифуга при 1 000 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Сбросьте супернатант и снова подвесьте гранулу в 2 мл полного α-MEM.
- Засеять суспензию клетки в две колбы T75 и инкубировать при 37 °C с 5% CO₂.
ПРИМЕЧАНИЕ: Заменять посевную среду каждые 2–3 дня до достижения достаточного слияния (рисунок 3).
Рисунок 2: Извлечение костного мозга ткани. (A) Головка бедра, полученная при операции по замене тазобедренного сустава, показывающая медуллярную область, используемую для выделения клеток. (B) Измельченные медуллярные кости, помещённые в стерильную чашку Петри перед ферментативным перевариванием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Первичная культура остеоцитов. Остеоциты присоединяются и размножаются монослоем внутри T75 после выделения из мозговой кости человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
7. 3D клеточная культура
- Предварительно разогрейте количество гидрогеля BG при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Важный шаг) Убедитесь, что рабочая зона свободна от сквозняков; охлаждение ускоряет преждевременное гелирование.
- Отключили остеоциты и центрифугу при 500 × г в течение 5 минут в трубке объёмом 15 мл.
- Ресуспензировать гранулу в 200 мкл культурной среды и смешать с гидрогелем BG для получения конечной плотности клетки не менее 1000 клеток/мкл (далее — биоинк).
- Аспирировать 50 мкл биочернил с помощью пипетки на 1000 мкл и поддерживать температуру при 37 °C до осаждения.
- Пипетка — 50 мкл биочернил на конструкцию в каждую яме культивационной пластины (дополнительное видео 2); Дайте примерно 5 минут физическому гелированию при комнатной температуре (рисунок 4).
- Каждую скважину подвергайте УФ-свету 365 нм на 1 минуту для достижения необратимой перекрёстной сшивки (0,30 Дж/см²).
- Добавьте культурную среду и инкубуйте конструкции при 37 °C, при 5%CO2 для необходимых временных точек. Используйте отдельную пластину для каждой временной точки.
Рисунок 4: Подготовка конструкции с использованием 3D-клеточной культуры. Скважинная пластина, содержащая клеточную GelMA формируется сразу после пипетирования и после перекрёстного сшивания УФ (365 нм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Дополнительное видео 2: Подготовка 3D-конструкций с клеточными элементами. Осаждание смесей гидрогель-ячеек в 12-луночную пластину с использованием простой пипетной техники перед УФ-перекрёстным сшиванием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
8. Тестирование биосовместимости
- Живые/мёртвые пятна
- Выращивайте каркасы с клеточными клетками в нужные временные интервалы.
- Аккуратно мойте стерильным PBS.
- Инкубировать конструкции в течение 30 минут в темноте с раствором живого/мёртвого вещества, содержащего 0,2% этидий-гомодимера-1 (EthD-1) и 0,05% кальцеина AM в PBS.
- Снимок немедленно сделан с помощью флуоресцентного микроскопа с фильтрами для кальцеина AM (~495/515 нм) и EthD-1 (~495/635 нм). Стандартные наборы флуоресцеиновых изотиоцианатов (FITC) и Texas Red совместимы с обнаружением кальцеина AM и EthD-1 соответственно.
- Идентифицировать живые клетки по зелёной цитоплазматической флуоресценции и мёртвые клетки по флуоресценции красного ядра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Плоские изображения можно обрабатывать с помощью ImageJ (Фиджи). Объектив, время экспозиции, усиление и интенсивность освещения оставались постоянными для всех сравниваемых образцов и регулировались только для предотвращения насыщения сигнала. Чтобы минимизировать неправильную интерпретацию, вызванную автофлуоресценцией, для всех образцов в каждом эксперименте сохранялись одинаковые настройки сбора, а контрольные наблюдения конструкций микрочастиц из каркасов и костей без клеток использовались для распознавания фонового флуоресцентного паттерна, связанного с биоматериалом. Эти методы контроля позволили нам отличить сигнал, полученный от частиц, от истинно округлой клеточной окрашивания при интерпретации изображения.
- Количественная оценка Alamarblue
- Приготовьте рабочее раствор с 5% alamarblue в полной среде.
- Инкубировать каркасы в растворе alamarBlue в течение 2,5 часов при 37 °C и 5% CO₂, защищённых от света.
- Перенесите 100 мкл супернатанта на пластину с 96 лунками в тройном экземпляре, включая контрольные элементы.
- Измерьте флуоресценцию при возбуждении 360/40 нм и излучении 460/40 нм.
- Нормализовать значения флуоресценции для контроля для определения относительной метаболической активности.
