Сетевая фармакология и экспериментальная верификация для изучения коры циннамоми против остеонекроза бедренной кости, вызванного стероидами

Краткое содержание

Цель данного исследования — изучить потенциальные механизмы коры Cinnamomi в лечении остеонекроза головки бедренной кости путём интеграции сетевой фармакологии, моделирования молекулярной динамики и экспериментов на животных.

Аннотация

Остеонекроз головки бедренной кости (SONFH), вызванный стероидами, вызывает сильную боль и ограниченную подвижность, значительно ухудшая качество жизни пациентов. Кора циннамоми (CC) доказала эффективное облегчение этого состояния, однако механизм действия остаётся неясным. Целью данного исследования является выявление активных соединений CC и изучение их механизмов в SONFH. Активные составляющие были отскринингованы с помощью баз данных HERB 2.0, PubChem и SwissADME, а соответствующие цели предсказывались с помощью базы данных Swiss Target Prediction. Цели для SONFH были выявлены путём пересечения целей из баз данных GEO, DisGeNET, GeneCards и OMIM с целями, связанными с соединениями. С использованием базы данных STRING была построена сеть взаимодействия белков и белков (PPI), а анализ обогащения GO и KEGG проводился через базу данных DAVID. Наиболее перспективные взаимодействия соединения с мишени были подтверждены с помощью молекулярного стыкованного соединения (MD) и молекулярно-динамических симуляций. Исследователи выявили 563 потенциальных мишеней, включая 61 объект, связанный с SONFH, при этом AKT1, HIF-1α и STAT3 выступали в качестве центральных узлов. Анализ обогащения KEGG выделил сигнальный путь HIF-1α как ключевой механизм. Кроме того, эксперименты на животных показали, что активная фракция CC эффективно снижает структурное повреждение головки бедра в модели мыши с SONFH. Результаты свидетельствуют о том, что CC может улучшать SONFH, координируя адаптацию к гипоксии и регулируя ангиогенез и остеогенез.

Введение

Остеонекроз головки бедренной кости (SONFH), вызванный стероидами, — это критическое остеоартикулярное заболевание, вызванное нарушением или снижением кровоснабжения головки бедра по^{причине различных 1}. Гибель костных клеток и компонентов костного мозга приводит к структурному повреждению головки бедра и функциональному нарушению тазобедренного сустава². Клинически пациенты обычно обращаются с болью в бедре и ограниченной^{подвижностью 3}. Без эффективного лечения 80% пациентов с SONFH переходят к коллапсу бедренной головки, требующей полной замены^{тазобедренного сустава 4}. Это создаёт сильное психологическое давление и тяжелое экономическое бремя для^{пациентов 5}. Клиническая практика рекомендует использовать комбинацию антикоагулянтов, фибринолитических препаратов, вазодилататоров и препаратов для понижения липидов для лечения SONFH, которые продемонстрировали определённый клинический потенциал, но в целом ограничивали^{терапевтическую эффективность 6}.

Традиционная китайская медицина (ТКМ) всё больше демонстрирует своё положительное влияние на лечение^{SONFH 7}. ТКМ демонстрирует потенциал для облегчения симптомов, контроля заболеваний, улучшения подвижности суставов и качества жизни^{пациентов 8}. В клинической сфере CC и его компоненты широко используются для улучшения SONFH, демонстрируя заметную^{эффективность 9}. Многочисленные биоактивные вещества, содержащиеся в CC, обладают различными биологическими свойствами, включая противовоспалительные свойства, антиоксидантные, стимулирующие ангиогенез и улучшающие^{микроциркуляцию 10}. Предыдущие исследования в области инженерии костной ткани и метаболизма показали, что циннамальдегид, основной активный компонент CC, способен модулировать сигнальные пути, связанные с ремоделированием^{кости 11}. Первоначальное исследование показало, что таблетки Yougui (YGP) обладают терапевтическим потенциалом для SONFH, способствуя ангиогенезу и усиливая воспалительные^{реакции 12}. Будучи суверенным препаратом в YGP, CC может нагревать ян, приносить пользу ци и разблокировать меридианы, оказывая положительный терапевтический эффект на^{SONFH 13}. Тем не менее, точные механизмы, лежащие в основе его эффективности, остаются неясными. Разъяснение многоцелевой регуляторной сети, которую CC использует для улучшения SONFH, поможет не только понять его фармакологическую особенность, но и способствует разумному клиническому применению и созданию соответствующих средств улучшения. Интеграция биоинформатики с сетевой фармакологией обеспечивает эффективный подход к разъяснению механизмов действия¹⁴.

Сетевая фармакология может выявлять биоактивные компоненты в травах и предсказывать связи между этими компонентами и генными^{мишенями 15}. MD используется для проверки связывающих взаимодействий между кандидатами активными соединениями и ключевыми терапевтическими целями. Молекулярная динамика использует ньютоновскую механику для оценки стабильности и гибкости связывания лиганд-рецепторов с помощью симуляции движения¹⁶. Авторы всесторонне исследовали потенциальные эффекты CC на SONFH с помощью сетевой фармакологии, MD и молекулярно-динамических симуляций. Результаты служат ориентиром для будущих глубоких исследований фармакодинамических материалов и механизма CC для улучшения SONFH. Блок-схема исследования показана на рисунке 1.

Протокол

Все экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по этике экспериментальных животных Чжэцзянского китайского медицинского университета (IACUC-20240708-22) и соответствовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных, изданного Национальными институтами здоровья. В этом эксперименте использовали двадцать 10-недельных самок C57BL/6J весом от 20 до 22 г. Эти мыши были получены в зооцентре Китайского медицинского университета Чжэцзяна. См. таблицу материалов для списка всех реагентов, оборудования и программного обеспечения, используемых в этом протоколе.

Скрининг активных соединений и мишеней CC
Химические соединения CC были идентифицированы с помощью Herb^{2.0 17} с ключевым словом «CC». Химикаты без PubChem ID или с таким же идентификатором фильтровались. Затем объедините и удалите дубликаторы, чтобы получить целевые участки, соответствующие CC. Проведите начальный скрининг с использованием базы данных^{PubChem 18} на основе правила пяти Липински (Mw ≤ 500, miLogP ≤ 5, nOHNH ≤ 5, nOH ≤ 10)¹⁹. Авторы используют базу данных PubChem для определения представления SMILES для каждого химического соединения. Используя базу данных SwissADME, авторы выбирают соединения с ограничением «Высокого» ГИ и ≥2 значения «Да» в^{Druglikeness 20}. Используйте базу данных Swiss-Target^{Prediction 21} для извлечения белков-мишень с вероятностью выше нуля. Затем объедините и удалите дубликаторы, чтобы получить целевые сайты, соответствующие CC.

Составление генных мишеней, связанных с SONFH
Цели, связанные с SONFH, были получены из баз данных: база данных^{DisGeNET 22}; база данных^{GeneCards 23}; база данных^{OMIM 24} и базы данных^{GEO 25}. Авторы скачали и дедуплифицировали гены SONFH из баз данных OMIM и DisGeNET. Всего из базы данных GeneCards было получено 233 мишеней, связанных с заболеваниями, после удаления дубликатов. Все полученные цели имели показатели релевантности выше 0 и были включены для последующих анализов. Минимальный балл релевантности среди полученных генов составил 6,48. Дифференциально экспрессированные гены (DEG), связанные с SONFH, были получены из серии GSE123568 на платформе GPL15207 в базе данных GEO. Пакетные эффекты были корректированы с помощью лимма-пакета в R, а дифференциально экспрессируемые гены (DEG) были идентифицированы с помощью критериев |logFC| > 1 и P < 0.05²⁶. Пакет ggplot2 был использован для создания графика вулкана с целью визуализации распределения DEG, а также была создана тепловая карта для представления результатов. Библиотека целевых заболеваний SONFH была создана путём удаления дублирующихся мишень с помощью пакета Венна в R.

Создание сети PPI
На основе предполагаемых целей активных компонентов CC и связанных с SONFH целей была создана диаграмма Венна в Venny 2.1.0²⁷. С целью получения данных PPI авторы импортировали цели в базу данных STRING²⁸. Ограничением критерия скрининга организма был «Homo sapiens» с индексом доверия ≥0,4. Авторы использовали Cytoscape 3.7.2 для установления ключевых целей сети PPI. Центральность степени (DC) использовалась для анализа ключевых целей сетей PPI. Фильтр параметров более чем вдвое превышает медианное значение. С целью уточнения ключевых целей было использовано дополнение к Cytoscape.

Анализ обогащения проводился с использованием баз данных генной онтологии (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG)
Общие мишени CC и SONFH были проанализированы для анализа обогащения GO и KEGG через базу данных^{DAVID 29}. Для визуализации топ-10 терминов GO и топ-20 путей KEGG был использован Вэй Шэн^{Синь 30} для нарисования пузырьковой диаграммы с точки обогащения.

Строительство сети
Молекулярные механизмы CC в улучшении SONFH были выяснены через сети трава-соединение-мишень (H-C-T) и соединение-мишень-путь (C-T-P). Программное обеспечение Cytoscape 3.10.3 иллюстрировало сети. Сеть H-C-T была разработана с использованием активных соединений CC и их общих целей. Затем используйте инструмент Analyze Network. Для лучшего понимания взаимосвязей между путями, соединениями и целями топ-20 путей вместе с их связанными целями и соединениями были организованы в сеть C-T-P с помощью Network Tools.

Проверка MD
Основные цели: HIF-1α, STAT3, ESR1, AKT1, SRC, ERBB2, CASP3 и EGFR были получены с помощью анализа PPI. Цель была проанализирована базой данных^{Uniport 31} с ограничением Human и рассмотрена базой данных RCSB^{PDB 32}. Были отобраны белковые структуры человека с относительно высоким разрешением. Активные ингредиенты были идентифицированы по сети C-T-P. Соответствующие 3D-структуры были скачаны в формате mol2 из базы данных PubChem. Каждый файл открывался в Chem3D и энергия минимизировалась. Затем авторы использовали программное обеспечение^{AutoDockTools 33} для проведения обезвоживания, гидрогенизации и расчёта зарядов Гастейгера рецепторного белка. И лиганды, и рецепторы сохранялись в формате PDBQT. Основываясь на пространственном расположении и возможности связывания, авторы оценивают осуществимость и стабильность стыковки. С помощью AutoDock Vina предсказывались стыковочная сетка и макромолекула. В ходе этого исследования все вращающиеся связи лиганда свободно вращались, а рецепторы были установлены жёстко. Счёт стыковки указывает на связывающую связь между рецептором и лигандом; Чем ниже счёт, тем выше аффинность связывания. В соответствии с этим принципом авторы выбирают конформации с наиболее благоприятной энергией связывания для изучения связывающих взаимодействий лигандов с белками. Визуальные результаты были представлены PyMOL.

Симуляция молекулярной динамики
Молекулярно-динамические симуляции проводились с использованием GROMACS³⁴ с силовым полем CHARMM36. Белок-лигандный комплекс был центрирован в кубической периодической симуляционной коробке с минимальным расстоянием до растворённого ящика 1,0 нм, а система была решена с использованием водной модели SPC216. Система была нейтрализована добавлением соответствующих противоположений Na⁺ и Cl⁻. Минимизация энергии выполнялась последовательно с использованием алгоритма самого крутого спуска, за которым следовал метод сопряжённого градиента для устранения неблагоприятных атомных контактов. Дальнодействующие электростатические взаимодействия рассчитывались с использованием метода частичной сетки Эвальда (PME) с отсечением 10 Å. Все ковалентные связи, связанные с атомами водорода, были ограничены с помощью алгоритма LINCS. Температура поддерживалась на уровне 300 К с помощью термостата с V-образным масштабированием, а давление контролировалось на уровне 1 бар с помощью баростата Берендсена с изотропным соединением. На этапе уравновесия на лиганд применялись ограничения положения с постоянной силы 1000 кДж·моль⁻¹·нм⁻² . После минимизации энергии система была уравновешена с помощью симуляций NVT на 2 нс и 2 нс NPT, затем симуляции молекулярной динамики производства на 100 нс с временным шагом 2 fs. Атомные координаты записывались каждые 10 пс для дальнейшего анализа траектории.

Экспериментальная валидация в модели мыши SONFH
Животные и создание модели SONFH
Двадцать самок мышей C57BL/6J возрастом 10 недель и весом от 20 до 22 г были получены в зооцентре Китайского медицинского университета Чжэцзяна. Мыши прошли 7-дневный период адаптации в контролируемой среде и получили неограниченный доступ к еде и воде. Все мыши были случайным образом распределены по группам (n = 5 на группу): контрольная группа, группа SONFH + CC низкодозовой (CC-Low, 7,5 г/кг/сут) и группа SONFH + CC с высокими дозами (CC-High, 15 г/кг/сут). Модель SONFH была установлена так, как было описано ранее. Кратко: мыши в группах SONFH, SONFH + CC-Low и SONFH + CC-High получили две внутривенные инъекции липополисахарида (LPS; 20 мкг/кг) на 0-й день. Впоследствии три внутримышечных инъекции метилпреднизолона (MPS; 40 мг/кг) были введены с интервалом в 24 часа, начиная через 24 часа после инъекций LPS. Мышам в группах лечения ежедневно вводили экстракт CC через оральную гаваж в течение 6 недель, начиная с дня последней инъекции MPS. Мыши контрольной группы получали эквивалентные объёмы физиологического раствора в соответствующих временных точках.

Сбор и подготовка образцов
В конце 6-недельного периода лечения мышей усыпляли. Двусторонние головки бедренной кости были тщательно вскрыты и собраны. Для каждого животного левая бедренная головка фиксировалась на 48 часов при 4 °C для последующего декальцификации и вложения парафина. Правая бедренная головка была закреплена и затем напрямую использовалась для микро-КТ без декальцификации.

Гистологический анализ (ABH окрашивание)
После декальцификации и внедрения парафина срезы головки бедра были окрашены с помощью протокола Alcian Blue/гематоксилина (ABH) для оценки изменений остеонекроза. Кратко время секции окрашивались в 1% Alcian Blue (pH 2,5) в течение 30 минут, затем промывались, а затем окрашивались гематоксилином Харриса. После обезвоживания и монтажа стекли снимали под световым микроскопом. Количественная оценка остеонекроза была проведена двумя ослеплёнными наблюдателями с помощью программного обеспечения ImageJ. Отношение пустых лакун было рассчитано как (количество пустых лакун/общее число лакун) × 100% в трёх случайно выбранных высокомощных полях на выборку в субхондральной области. Соотношение ядер пикнотов определялось аналогично.

Микрокомпьютерная томография (Micro-CT)
Трёхмерная костная микроструктура головки бедренной кости была проанализирована с помощью высокоразрешающего микро-КТ-сканера. Фиксированные образцы сканировались с разрешением 10 мкм (70 кВ, 114 мкА). Стандартизированный сферический объем интереса (VOI), охватывающий первичную несущую область, был реконструирован и проанализирован с помощью программного обеспечения CTAn. Были количественно оценены следующие морфометрические параметры: объём кости/общий объём (BV/TV), трабекулярная толщина (Tb.Th) и трабекулярное разделение (Tb.Sp).

Иммунофлуоресцентное окрашивание (IF)
Для оценки микросреды костей было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание парафиновых срезов. После извлечения и блокировки антигена секции инкубировали ночью при 4 °C с такими первичными антителами: кроликовый анти-HIF-1α (1:200), кролик анти-ALP (1:300) и кролик анти-VEGF (1:150). После промывания секции инкубировали смесью вторичных антител, конъюгированных с фторофором: козий антикроличий IgG, маркированный Alexa Fluor 488, козий антикроличий IgG, маркированный Alexa Fluor 555. Ядра были контрокрашены DAPI. Изображения делались с помощью флуоресцентного микроскопа при одинаковых настройках экспозиции. Относительная интенсивность флуоресценции для каждого маркера была количественно измерена с помощью программного обеспечения ImageJ по трём полям на выборку.

Статистический анализ
Все количественные данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Односторонний анализ дисперсии (ANOVA), за которым последовал пост-хок тест Тьюки, был проведён с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (версия 9.0) для определения статистической значимости между группами. P-значение менее 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Идентификация активных компонентов и прогнозируемых целей CC и развитие сети «H-C-T».
Для изучения механизмов ключевых компонентов и целей CC в улучшении SONFH авторы использовали базу данных HERB 2.0 для идентификации всех контрольных компонентов CC. Из 209 кандидатов активных компонентов CC было обнаружено 85 вероятных биоактивных соединений (Дополнительная таблица 1). Используя платформу Swiss Target Prediction и исключая дублирующиеся и недействительные записи, было получено 563 предполагаемых целей, соответствующих этим компонентам CC (Дополнительная таблица 2). Авторы определили активные компоненты и цели CC.

Изучать молекулярные механизмы, участвующие в возникновении и прогрессировании SONFH, а также выявлять потенциальные мишени биомаркеров. Анализ GSE123568 набора данных в базе данных GEO выявил DEG, связанные с SONFH, включая 207 генов повышенной регуляции и 216 пониженных генов. Диаграмма вулкана 425 DEG показан на рисунке 2A, тогда как паттерны экспрессии топ-60 DEG, ранжированных по уровню выражения, представлены в виде тепловой карты на рисунке 2B, при этом интенсивность цвета отражает значения выражения, преобразованные в логарифми. Базы данных DisGeNET, OMIM и GeneCards предоставили 711 целей, связанных с SONFH. Объединив 425 DEG из базы данных GEO, в общей сложности 1136 целей связаны с SONFH. После исключения дубликатов было подтверждено 1115 целей, связанных с SONFH, как показано на рисунке 2C. Авторы предварительно создали библиотеку мишеней для заболеваний для SONFH.

Для выявления целей и первичных компонентов анализ пересечений между 563 целями CC и 1115 целями, связанными с SONFH, выявил 61 обычную цель (рисунок 3A и дополнительная таблица 3), которые были внедрены в Cytoscape 3.10.3 для создания сети «H-C-T» (рисунок 3B). Эта сеть включала 147 узлов и 413 ребер. Топологический анализ показал, что (s)-4-нонанолид (степень:16), изогомогенол (степень:15), нерилацетат (степень:14), мелилотокарпан A (степень:14), 3-метоксициннамальдегид (степень:13) демонстрируют наивысшую связность с белковыми мишенями.

Разработка и топологическая оценка сети PPI.
Для дальнейшего изучения целей CC по улучшению SONFH. Cytoscape 3.10.3 использовался для просмотра сети PPI после того, как 61 идентичная цель была внесена в базу данных STRING. В сети было 463 ребра и 60 узлов. На рисунке 4A узлы переходят по цвету и размеру от светлых и меньших к тёмным и крупнее, что указывает на увеличение степени от низкого к высокому. Плагин MCODE способствовал кластеризации этих целей в два функциональных модуля (рисунок 4A), среди которых кластер 1 содержал 23 узла и 216 рёбер, с оценкой 19,636. Для дальнейшей характеристики архитектуры сети в качестве топологических метрик использовались DC, BC и CC. С медианными значениями этих параметров, установленными как сроговые точки, авторы выделили 8 активных целей (рисунок 4B). Плагин CytoHubba использовал алгоритм MCC для ранжирования узлов, выявляя топ-10 генов. (Рисунок 4C).

Анализ обогащения GO
Для дальнейшего изучения механизмов CC в улучшении ONFH был проведён анализ обогащения GO на 61 потенциальной цели с использованием BP, CC и MF. Всего было обогащено 435 сроков GO, включая 293 срока BP, 41 срок CC и 101 срок MF. Эти результаты приведены в дополнительных таблицах 4, 5 и 6. Рисунок 5A визуально показывает топ-10 обогащённых терминов BP, CC и MF с помощью пузырьковой диаграммы. Результаты показали, что термины BP в основном связаны с передачей сигнала, положительной регуляцией транскрипции РНК-полимеразой II, отрицательной регуляцией апоптотического процесса, положительной регуляцией транскрипции ДНК-шаблонов и отрицательной регуляцией транскрипции РНК-полимеразой II. Анализ показал, что термины MF в основном участвуют в связывании с белками, металлическими ионами и идентичными белками. Результаты CC показали, что большинство мишень в основном находились в цитоплазме, мембране и плазматической мембранах.

Анализ KEGG
Для получения информации о возможных биохимических механизмах, с помощью которых CC может улучшить SONFH, был проведён анализ обогащения путей KEGG для выяснения биохимических механизмов, с помощью которых CC может улучшать SONFH. С помощью критерия скрининга P < 0,05 и FDR < 0,05 было выявлено 48 записей обогащения KEGG (Дополнительная таблица 7). Двадцать наиболее заметно обогащённых путей, определяемых по обогащению складок и подсчету, визуализировались с помощью пузырьковых и барных графиков (таблица 1, рисунок 5B и 5C). Используя Cytoscape 3.10.3, была построена сеть C-T-P с 167 узлами и 589 рёбрами (рисунок 5D). Влияние CC на SONFH в основном связано с инфекцией герпесвируса, ассоциированной саркомой Капоши, сигнальным путём HIF-1, а также липидным и атеросклерозом, что подтверждается анализами функционального GO и обогащения путей KEGG.

Проверка MD
Для оценки возможных взаимодействий между активными соединениями и ключевыми целями 10 соединений из сети C-T-P, включая анетол, мелилотокарпан A, нерилацетат, каприловую кислоту, изогомогенол, 3-метоксициннамальдехид, (s)-4-неанолид, миристицин, борнеол и циннамилацетат, были соединены с ключевыми мишенями AKT1, HIF-1α, STAT3, ESR1, CASP3, SRC и EGFR. Полные результаты стыковки для всех пар соединение–мишень приведены в Дополнительной таблице 8, а подробная информация о соединениях, мишенях и параметрах стыковки приведена в Дополнительной таблице 9. На рисунке 6 представлена тепловая карта распределения энергии связывания.

В целом, несколько пар соединение-мишень проявили относительно благоприятные аффинности связывания, при этом более низкие значения энергии связывания указывают на более стабильные предсказуемые взаимодействия. Примечательно, что результаты стыковки показали явную гетерогенность связывающих сродий как между соединениями, так и между мишенями. Некоторые соединения, такие как мелилотокарпан А, стабильно демонстрировали относительно сильные связывающие аффинности на нескольких мишенях, тогда как другие демонстрировали более умеренные или слабые взаимодействия, что указывает на то, что разные соединения могут неравномерно вносить вклад в прогнозируемые фармакологические эффекты.

Кроме того, наблюдалась вариабельность между целями. Например, некоторые мишени, такие как STAT3 и EGFR, демонстрировали относительно умеренные или слабые сродства связывания с несколькими соединениями, при этом некоторые значения приближались к -5,0 ккал/моль, по сравнению с мишеньями, такими как AKT1 или SRC. Эта закономерность указывает на то, что не все основные мишени обязательно функционируют как прямые партнёры с высокой аффинностью связывающих идентифицированных соединений и могут играть косвенные регуляторные роли внутри сети взаимодействия. Такие различия могут быть связаны с вариациями структурной совместимости между лигандами и белковыми сайтами, а также с присущими характеристиками целей.

Среди изученных пар AKT1 показал наименьшую энергию связи с мелилотокарпаном A (-9,6 ккал/моль), что указывает на потенциально благоприятное взаимодействие. Рисунок 7 иллюстрирует предсказанный режим связывания этого комплекса. В частности, SER205 AKT1 образует водородные связи с мелилотокарпаном A, анетолом и миристицином. Кроме того, мелилотокарпан A предсказывался как образующий водородные связи с GLY309 HIF-1α, LEU438 и THR440 STAT3, SER433 и ARG412 ESR1, а также ARG500 и GLU510 SRC.

Для выявления представительных кандидатов в состав использовалась самая низкая энергия связи для каждой мишени, а порог энергии связи ≤ -5,0 ккал/моль, указывающий на относительно стабильные взаимодействия. На основе этих критериев были определены мелилотокарпан А, анетол и миристицин как потенциальные ключевые соединения. В целом, большинство активных компонентов CC показали потенциальные взаимодействия с отображёнными терапевтическими мишенями, при этом некоторые соединения демонстрировали относительно более сильные тенденции связывания между несколькими мишенями. Однако следует отметить, что MD — это упрощённый вычислительный подход, который даёт предварительные прогнозы потенциальных взаимодействий и может не полностью учитывать гибкость белка и сложные биологические среды. Поэтому эти результаты следует интерпретировать с осторожностью, и наблюдаемые взаимодействия не являются окончательным доказательством прямого связывания.

Симуляция молекулярной динамики
Для дальнейшей оценки стабильности комплексов авторы выбрали комплексы AKT1-мелилотокарпан A, HIF-1α-мелилотокарпан A и STAT3-мелилотокарпан A для молекулярно-динамических моделей. Среди прогнозируемых целей STAT3 и HIF-1α были выбраны для моделирования MD на основе их центральной роли в сети PPI и биологической значимости для патологии SONFH. STAT3 показал один из самых высоких уровней связности в сети PPI, что указывает на потенциальную регуляторную роль в нескольких сигнальных каналах. HIF-1α был выбран потому, что анализ обогащения KEGG определил сигнальный путь HIF-1 как один из наиболее значимых путей, связанных с адаптацией к ангиогенезу и гипоксии при остеонекрозе.

В то же время авторы сосредоточились на AKT1 как на репрезентативной цели из-за их высоких показателей стыковки и прямой связи с патологическими особенностями SONFH, особенно с ангиогенезом, вызванным гипоксией, и регенерацией костей. Из-за ограничений вычислительных ресурсов были выбраны три репрезентативных комплекса для детального MD-симуляции, что является широко применяемой стратегией в молекулярных симуляциях на основе сетевой фармакологии. Отклонение корня среднего квадрата (RMSD) эффективно оценивает конформационную устойчивость белко-лигандынных комплексов, где более низкие значения указывают на большую структурную устойчивость. Как показано на рисунке 8A, комплекс AKT1-мелилотокарпан A завершил релаксацию в течение первых 12 нс и затем достиг стабильного плато, при этом наблюдалась лишь временная флуктуация около 50-55 нс, прежде чем быстро вернуться к равновесию. Общий RMSD на протяжении всей симуляции составлял около 0,369 нм. Рисунок 8B иллюстрирует, что комплекс HIF1A-мелилотокарпан А прошёл релаксацию в течение первых 16 нс, за которым последовало поддержание стабильного плато. Кратковременное колебание произошло между 38 и 42 нс, после чего наблюдалась быстрая стабилизация. Общий RMSD для этого комплекса составил 0,25 нм. На рисунке 8C комплекс STAT3-мелилотокарпан A прошёл релаксацию в течение 0,3 нс и затем достиг стабильного плато. Кратковременное колебание происходило между 5 нс и 80 нс. Общая симуляция составила около 0,21 нм. Как показано в разделе AKT1-мелилотокарпан A, комплексы HIF-1α-мелилотокарпан A и STAT3-мелилотокарпан сохраняли стабильность без заметных изменений, что указывает на относительно стабильное сочетание.

Гибкость аминокислотных остатков в белках оценивалась с помощью среднеквадратичной флуктуации корня (RMSF). Рисунок 9A, среднее глобальное колебание остатков составляло около 0,17 нм, что говорит о том, что стабильность в основном поддерживалась структурным ядром и связующим карманом. Большая гибкость в основном ограничивалась внутренне подвижными областями, такими как терминальные сегменты и области петли, а не карманным ядром. Хорошо известно, что эти регионы по своей природе гибкие. Рисунок 9B показывает, что примерно 94% остатков имели значения RMSF ниже 0,20 нм, а только около 6% превышали 0,30 нм, что указывает на колебания общего белкового хребта и внутренних остатков в стабильном диапазоне. Рисунок 9C показывает, что средний глобальный остаток составлял около 0,17 нм. В данных не было выявлено колебаний свыше 0,15 нм, что свидетельствует о стабильной конформации связывающего кармана на протяжении всего моделирования. Как комплексы AKT1-мелилотокарпан А, так и HIF-1α-мелилотокарпан А были доказаны в сильном и устойчивом взаимодействии.

Водородные связи критически важны для взаимодействия белков и лигандов. Рисунок 10A показывает, что комплексы AKT1-мелилотокарпан A обычно образуют одну водородную связь, при этом количество водородных связей варьируется от 0 до 2. Между мелилотокарпаном A и HIF-1α расстояние менее 0,35 нм. AKT1 часто взаимодействует рядом с мелилотокарпаном A. Комплексы HIF-1α-мелилотокарпан А образуют от 0 до 2 водородных связей, преимущественно одну водородную, как показано на рисунке 10B. На рисунке 10 C количество водородных связей комплекса STAT3-мелилотокарпан А равно 0–4. Чаще всего атомы A между мелилотокарпаном A и HIF-1α находятся на расстоянии менее 0,35 нм. Комплексы HIF-1α-мелилотокарпан A образуют 1–3 пары близких контактов, а иногда даже 7–9 пар. Это указывает на эффективные взаимодействия водородных связей между малой молекулой и целевой белкой. В итоге, как комплексы AKT1-мелилотокарпан А, так и HIF-1α-мелилотокарпан А демонстрируют стабильность и прочность.

CC подавляет воспалительные реакции и апоптоз мышей SONFH
Гистологический анализ с использованием окрашивания ABH выявил выраженные остеонекротические изменения в группе SONFH, характеризующиеся увеличением пустых лакун, пикнотическими ядрами и нарушением трабекулярной архитектуры, тогда как эти патологические особенности заметно облегчались после обработки CC (рисунок 11A). Количественный анализ подтвердил, что соотношение пустых лакун и пикнотических ядер в группах, обработанных CC, было значительно снижено по сравнению с группой SONFH (рисунок 11B–C). Микро-КТ-анализ показал тяжёлую трабекулярную потерю костной ткани в группе SONFH, которая была частично устранена при введении CC (рисунок 11D). Постоянно лечение CC значительно увеличивало уровень бактериального вагиноза/ТВ и туберкулёза. При уменьшении Tb.Sp относительно группы SONFH (рисунок 11E–G). Иммунофлуоресцентное окрашивание показало повышенную экспрессию HIF-1α и снижение уровня ALP в группе SONFH, сопровождавшееся изменением экспрессии VEGF. Лечение CC модулировало экспрессию HIF-1α и VEGF, а также усилило сигналы ALP, что свидетельствует о улучшении костной микросреды и остеогенной активности (рисунок 11H).

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:
Наборы данных, использованные или проанализированные в ходе текущего исследования, доступны по ссылке: https://zenodo.org/records/19730455.

Рисунок 1: Блок-схема стратегии исследования сетевой фармакологии для улучшения CC при SONFH. Рисунок 1 показывает, что исследование выявляет потенциальные цели активных компонентов CC из базы данных, при этом SONFH является основным заболеванием. После их пересечения с заболевающими мишенями была построена сеть «компонент–мишень–путь» и термины GO, KEGG. Затем применяются молекулярное стыкование и симуляция молекулярной динамики для оценки связывающей связи между ключевыми компонентами и основными мишенями, при этом окончательное подтверждение проводится экспериментальной проверкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Скрининг пересекающихся целей, связанных с SONFH. (A) Диаграмма вулкана, показывающая распределение дифференциально экспрессированных генов в образцах заболеваний. Красные точки обозначают повышенную регуляцию генов, синие — пониженные гены, а серые точки — гены без значимой дифференциальной экспрессии. (B) Тепловая карта, показывающая паттерны экспрессии 60 дифференциально экспрессированных генов, с столбцами, соответствующими образцам, и строками, соответствующими генам. (C) Диаграмма Венна, показывающая перекрытие мишеней, связанных с заболеваниями, полученных из различных баз данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Скрининг пересекающихся мишеней между CC и SONFH. (A) Диаграмма Венна, иллюстрирующая распределение 61 общей мишени между предсказанными мишенями активных соединений в CC (жёлтый) и SONFH-связанных с заболеваниями (фиолетовый). (B) Сеть Herb-Compound-Target (H-C-T) иллюстрирует взаимодействия между соединениями и их соответствующими мишенями. Синий квадратный узел обозначает заболевание, зелёные квадратные — активные соединения, а оранжевые квадратные — общие цели. Ребра обозначают взаимодействия между соединениями и их целями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Идентификация кандидатных целей с помощью анализа PPI. (A) Сеть PPI, кластеризованная с помощью плагина MCODE. (B) Схематический рабочий процесс топологического скрининга в сети PPI. (C) Ключевые гены, извлеченные из сети PPI с помощью плагина CytoHubba. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Результаты анализа обогащения GO и анализ обогащения путей KEGG для 61 распространённой цели .(A) Пузырчатая диаграмма, показывающая топ-10 терминов анализа обогащения GO для BP, CC и MF. (B) Пузырьковый график, изображающий топ-20 значительно обогащённых путей KEGG. (C) Распределение 20 лучших обогащённых путей на основе функциональной классификации KEGG. (D) Иллюстративная C-T-P-сеть, изображающая потенциальные механизмы, с помощью которых CC может улучшить остеонекроз головки бедренной кости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Тепловая карта энергии связывания взаимодействий между активными соединениями CC и ключевыми мишенями (ккал/моль). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой картины.

Рисунок 7: Режимы связывания ключевых мишень с определёнными активными соединениями. AKT1-мелилотокарпан A (A1), HIF-1α-мелилотокарпан A (B1), STAT3-мелилотокарпан A (C1), ESR1-мелилотокарпан A (D1), CASP3-мелилотокарпан A (E1), SRC-мелилотокарпан A (F1), EGFR-мелилотокарпан A (G1), AKT1-анетол (H1), AKT1-миристицин (I1). (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2) и (H2) соответственно иллюстрируют свои двумерные режимы связывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8: RMSD MD. (A) значения RMSD для комплексов AKT1-мелилотокарпан A. (B) Значения RMSD комплексов HIF-1α-мелилотокарпан A. (C) Значения RMSD комплексов STAT3-мелилотокарпан A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 9: RMSF MD. (A) Значения RMSF комплексов AKT1-Melilotocarpan A. (B) Значения RMSF комплексов HIF-1α-мелилотокарпан A. (C) Значения RMSF комплексов STAT3-мелилотокарпан A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 10: H-связи MD. (A) Значения водородных связей комплексов AKT1-мелилотокарпан A. (B) Значения H-связей комплексов HIF1A-мелилотокарпан A. (C) Значения H-связей комплексов AKT1-мелилотокарпан A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 11: CC подавляет воспалительный ответ и апоптоз в головке бедренной кости, тем самым улучшая SONFH. (A) Представительные срезы головки бедренной кости, запятнанные ABH. Пустые лакуны обозначены чёрными наконечниками стрелок, а пикнотические ядра — стрелками. (B–C) Количественный анализ отношения пустых лакун (B) и числа пикнотических ядер (C). n = 5. (D) Репрезентативные трёхмерные микро-КТ реконструкции головок бедрен. (E–G) Количественная оценка параметров микро-КТ, включая долю костного объёма (BV/TV), трабекулярное разделение (Tb.Sp) и толщину трабекуляров (Tb.Th). (H) Представительное иммунофлуоресцентное окрашивание HIF-1α, VEGF и ALP в срезах головки бедренной кости; ядра были контрокрашены DAPI. Данные представлены как среднее ± SD (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Термин		Обогащение складками	P-значение	Граф	Идентификаторы пользователей
Рак мочевого пузыря		28.44	1.23E-07	7	CREBBP,CXCL8,NOS2,MMP2,STAT3,F2,PTGS2, HIF1A, ESR1,MMP9,EGFR,MTOR,VEGFA,CASP3, ERBB2,EP300,PPARG,NFE2L2,BCL2L1
Путь сигнализации HIF-1		16.66	6.56E-10	11	SRC, MMP2, STAT3, HIF1A, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA, CASP3, ERBB2, KDR, PDCD4, PTPN6
Резистентность к ингибиторам тирозинкиназы EGFR		16.66	3.84E-07	8	CCR1, CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3 ,EP300,TYK2,PTGS2,HIF1A,MTOR, VEGFA
Перекрёсток Адхеренс		12.54	1.64E-05	7	CREBBP,ABCB1,CASP3,ERBB2,STAT3,PDCD4, EP300,PTGS2,MMP9,EGFR,MTOR,VEGFA
Эндокринная резистентность		11.78	2.35E-05	7	CREBBP,NOS2,NOS3,ERBB2,STAT3, SERPINE1,EP300,HIF1A,EGFR,MTOR,VEGFA
Сигнальный путь AGE-RAGE при диабетических осложнениях		11.55	2.63E-05	7	CCR1,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,CXCR2,PTGS2,EGFR,MTOR,VEGFA
Протеогликаны в раке		11.43	1.19E-10	14	CXCL8,SRC,NOS3,CASP3,STAT3,PPARG,MMP9,BCL2L1,NFE2L2
Релаксин сигнальный путь		10.25	1.02E-05	8	OXTR, NOS2, NOS3, ERBB2, PTAFR, KDR, NOS1, EGFR, VEGFA
Герпесвирусная инфекция, ассоциированная с саркомой Капоши		10.20	1.45E-08	12	SRC,ERBB2,STAT3,KDR,EGFR,MTOR,BCL2L1,VEGFA
Сигнальный путь гормонов щитовидной железы		9.56	7.64E-05	7	NOS2, SRC, NOS3, MMP2, NOS1, MMP9, EGFR, VEGFA
Напряжение сдвига жидкости и атеросклероз		8.21	0.000177	7	CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,EP300,TYK2,MMP9
Гепатит B		8.18	4.41E-05	8	CREBBP,STAT3,EP300,PTPN6,TYK2,EGFR,MTOR,BCL2L1
Сигнальный путь JAK-STAT		7.93	5.35E-05	8	SRC, VDR, STAT3, CYP3A4, ESR1, EGFR, MTOR, VEGFA
Инфекция цитомегаловируса человека		7.34	6.2E-06	10	CREBBP,CASP3,EP300,TYK2,PTGS2,EGFR,MTOR,VEGFA
Липиды и атеросклероз		6.94	0.000035	9	CXCL8,SRC,MMP2,ERBB2,MMP9,EGFR,VEGFA
МикроРНК в раке		6.25	2.06E-06	12	CREBBP,SRC,ERBB2,EP300,PTPN6,PTPRF,EGFR
Химический канцерогенез — активация рецепторов		6.14	0.000265	8	SRC, MMP2, ERBB2, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR
Пути при раке		5.94	6.64E-10	19	CXCL8,NOS3,CASP3,MMP2,STAT3,SERPINE1,VEGFA
Кальциевый сигнальный путь		5.90	0.00011	9	KAT2B, CREBBP, SRC, EP300, HIF1A, ESR1, MTOR
Инфекция вируса папилломы человека		4.00	0.00324	8	SRC, NOS3, MMP2, KDR, MMP9, NFE2L2, VEGFA

Таблица 1: Результаты обогащения KEGG по 20 лучшим обогащённым путям.

Дополнительная таблица 1: Базовая информация об активных соединениях в CC.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 2: Цели 85 активных компонентов в CC.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 3: Информация о 61 общих целях CC-SONFH.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 4: Результаты терминов категории биологических процессов из анализа обогащения GO.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 5: Результаты терминов категоризации клеточных компонентов из анализа обогащения ГО.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 6: Результаты терминов категории молекулярных функций из анализа обогащения GO.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 7: Результаты путей анализа обогащения KEGG.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 8: Энергии связывания молекулярного стыковки (ккал/моль) пар соединение-мишень.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 9: Детали мишень и компонентов для молекулярного стыковкивания.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В этом исследовании авторы получили 85 биоактивных соединений из CC через несколько баз данных и провели скрининг, среди которых основные химические компоненты включают анетол, мелилотокарпан А и миристицин. Для выявления мишень авторы пересекли 563 мишеней для CC с 1116 мишенями, связанными с SONFH, в итоге получив 61 мишень. Авторы импортировали 61 общий мишень в базы данных STRING и DAVID для создания сети PPI и изучения возможных фармакологических путей. Результаты выявили 10 ключевых целей в сети PPI, включая HIF-1α и STAT3. Ишемия и гипоксия — две из основных патогенных характеристик SONFH, согласно более ранним^{исследованиям 35}. CC может оказывать положительное влияние на SONFH через различные биологические процессы, включая ангиогенез и транскрипционную регуляцию. Это может быть достигнуто через сигнальный путь HIF-1α, сдвиг жидкости и атеросклероз, липиды и атеросклероз, сигнальный путь AGE-RAGE при диабетических осложнениях и другие сигнальные пути, согласно анализу обогащения KEGG. Это говорит о том, что CC может действовать на SONFH через эти ключевые цели и связанные с ними пути. Для дальнейшего уточнения, тесно ли компоненты CC связаны с мишенями, основываясь на вышеуказанных результатах исследований фармакологии сети, а именно результатов скрининга активных ингредиентов препарата и результатов скрининга мишени в сети PPI, авторы провели молекулярно-динамические симуляции мелилотокарпана A-AKT1, мелилотокарпана A-HIF-1α, и STAT3-мелилотокарпанные комплексы. Это показывает, что мелилотокарпан A стабильно связывается с AKT1, HIF-1α и STAT3, поэтому CC действительно может оказывать положительное влияние, воздействуя на эти ключевые цели. В целом, благодаря многокомпонентному, многоцелевому и многопутному механизму, CC может оказывать защитное воздействие на качество жизни пациентов с SONFH.

Исследовательская группа сосредоточилась на выяснении механизмов, с помощью которых YGP оказывают терапевтическое воздействие при заболеваниях, связанных с костями. Предыдущие исследования показали, что YGP усиливают формирование костей и улучшают трабекулярную микроархитектуру в головке бедренной кости, активируя β-катенин для подавления остеокластогенеза и стимулирования остеогенеза во время SONFH 36 у кроликов. Кроме того, исследователи обнаружили, что YGP оказывают терапевтическое воздействие на SONFH главным образом, облегчая воспаление и стимулируя^{ангиогенез 12}. YGP могут не только облегчить SONFH, но и улучшить остеопороз. Ингибируя сигнальный путь IL-17/NF-κB и снижая иммунные ответы Th17, YGP успешно останавливают потерю костной ткани, вызванную^{овариэктомией 37}. С помощью экспериментов на животных исследователи подтвердили, что Cornus officinalis, один из компонентов YGP, оказывает влияние на SONFH, подавляя секрецию воспалительных медиаторов и апоптоз костных^{клеток 38}. CC, который может согревать ян, улучшать ци и разблокировать меридианы, является основной травой в YGP, играя ключевую роль в улучшении SONFH и облегчении страданий пациентов. В итоге эти исследования отражают давний акцент на выяснении механизмов YGP при остеонекрозе и на определении CC как основного травы, достойного механистического исследования в SONFH.

Среди предполагаемых активных компонентов анетол, миристицин и другие ингредиенты проявили биологическую активность против заболеваний, связанных с костями. Доказано, что анетол подавляет повышение маркеров резорбции костей. Анетол в конечном итоге снижает дифференциацию остеокластов и резорбционную функцию, ингибируя нижние пути и ключевые регуляторные^{факторы 39}. Исследования показывают, что анетол обладает противовоспалительными свойствами и ингибирует адипогенную дифференцировку в мезенхимальных стволовых клетках человеческого костного мозга (^hBMSCs)40. Миристицин подавляет воспаление и защищает гладкомышечные клетки сосудистых мышц, подавляя пути PI3K/Akt и NF-κB⁴¹. Ферроптоз является одним из ключевых механизмов, лежащих в основе патогенеза SONFH. Ферроптоз — это тип запрограммированной клеточной гибели, вызванной перекислением липид, зависящим от железа. Миристицин предотвращает ферроптоз, тем самым защищая редокс-гомеостаз остеобластных клеточных^{мембран 42}. Другой компонент борнеола доказано подавляет образование актиновых колец, свойственных ресорбировать остеокласты и отражать поляризацию клеток, в течение 30 минут⁴³. Эти данные указывают на то, что эти компоненты могут быть очень важны для защитного эффекта CC в SONFH, и это заслуживает дальнейшего изучения. Среди всех этих ингредиентов Melilotocarpan A был выбран в качестве представительного лиганда, поскольку он демонстрировал наиболее стабильные сродства связывания с несколькими основными мишенями в MD-анализе. Среди ведущих по рейтингу соединений Melilotocarpan A демонстрировал стабильно сильные связывающие взаимодействия с несколькими ключевыми белками сети PPI, что указывает на то, что он может представлять собой основной биоактивный компонент CC.

Кроме того, результаты сети PPI показали, что особенно HIF-1α и STAT3 могут быть основными целями. HIF-1α является центральным медиатором клеточного ответа на гипоксию. В экспериментах SONFH активация HIF-1α усиливает ангиогенез и восстановление костей, тем самым облегчая некроз головки^{бедренной кости 44}. Кроме того, исследования показали, что HIF-1α может оказывать защитное действие на хрящовую ткань при гипоксических^{условиях 45}. Усиление HIF-1α подавляет ферроптоз и активирует STAT3, ускоряя дифференцировку моноцитов костного мозга в^{остеокласты 46}. STAT3 — это активатор передачи сигнала и транскрипции. HBMSC способствуют превращению STAT3 в p-STAT3, тем самым усиливая пролиферацию, миграцию и антиапоптотические эффекты при гипоксических^{условиях 47}. STAT3 усиливает остеогенную дифференциацию и антиапоптотический эффект hBMSC, одновременно увеличивая секрецию сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) для стимулирования регенерации костной^{микрососудистой регенерации 48}. AKT1 — это протеинкиназа, которая выступает ключевым посредником сигнальной передачи ангиогенеза. AKT1 участвует в сцеплении ангиогенеза и остеогенеза и формировании трабекулярной кости⁴⁹. В целом, эти центровые цели сходятся с ангиогенеза, адаптацией к гипоксии, воспалениями и ремоделированием костей, что говорит о том, что CC может оказывать защитное действие против SONFH, модулируя эти мишени и связанные с ними сигнальные пути.

Для изучения механизма CC в улучшении SONFH исследователи провели анализ GO и анализ обогащения KEGG. Результаты ГО показывают, что целевые гены в основном обогащены биологическими функциями, такими как реакция на гипоксию, клеточный ответ на липополисахарид и положительная регуляция ангиогенеза. Анализ обогащения KEGG показал, что фармакологические эффекты CC в SONFH преимущественно связаны с сигнальным путём AGE-RAGE при диабетических осложнениях, сигнальным путём HIF-1α, липидным и атеросклерозом, а также другими сигнальными путями. SONFH возникает, когда кровоток к головке бедра прерывается, что приводит к отсутствию питательной поддержки головки бедра и запускает апоптоз^{клеток 50}. HIF-1 состоит из HIF-1α и HIF-1β, при этом HIF-1α играет ключевую роль в транскрипционном ответе на гипоксические и ишемические^{среды 47}. Предыдущие исследования показали, что через сигнальный каскад VEGF/AKT/mTOR HIF-1α координирует остеогенез и ангиогенез, тем самым критично усиливая остеогенную дифференцировку стволовых клеток, полученных из жира. После возникновения ишемии развивается гипоксия тканей, что приводит к заметному повышению уровня HIF-1α внутри клеток. что повышает уровень экспрессии VEGF и, следовательно, способствует восстановлению и регенерации^{сосудов 51}. Гипоксия нарушает выработку энергии митохондрий и увеличивает образование реактивных кислородных форм (ROS). Эти изменения способствуют остеокластогенезу, ингибируют активность остеобластов и в конечном итоге вызывают апоптоз остеоцитов. Высокая экспрессия HIF-1α смещает метаболизм энергии клетки с оксидативного фосфорилирования на гликолиз, снижает выработку ROS и, следовательно, ослабляет апоптоз в остеобластах^{и остеоцитах 52,53}. Кость отменяет функции гемопоэтической функции костного мозга и накапливает минералы, такие как кальций. Повышенная активность HIF-1α может напрямую увеличить формирование отменных костей⁵⁴. Кроме того, HIF-1α поддерживает выживаемость и гомеостаз хондроцитов при гипоксических^{условиях 45}. В результате сигнальный путь HIF-1α стал терапевтической мишенью для ONFH, с потенциальным терапевтическим применением для ONFH.

В сигнальном пути AGE-RAGE конечные продукты продвинутой гликации (AGE) образуются в результате неферментативного ковалентного сшивания углеводов с белками, жирами или другими биологическими^{макромолекулами 55}. AGE могут повреждать клетки и ткани через воспалительные и окислительные повреждения. Через четыре пути сигналы передаются взаимодействием AGE-RAGE. Это 1) JAK-2-STAT1, (2) PI3K-AKT, (3) MAPK-ERK и (4) NADPH-оксидаза-ROS⁵⁶. В конечном итоге фосфорилированный NF-κB попадает в ядро для транскрибации экспрессии провоспалительных цитокинов, факторов роста, профилброзных цитокинов и окислительного стресса. Исследование показало, что AGE-RAGE способствует апоптозу остеобластов через сигнальный путь MAPK и активацию окислительного стресса, а также ингибирует остеогенную дифференцировку, подавляя уровень стрессовых датчиков эндоплазматического ретикулума, а также через метилирование ДНК/путь^{Wnt 57}. Кроме того, исследования показали, что AGE и RAGE участвуют в кальцификации^{сосудов 58}.

В сигнальном пути липидов и атеросклероза окисленные липиды активируют PPARγ. Это главный регулятор адипогенеза, который подавляет остеогенную^{дифференциацию 59}. Кроме того, несколько исследований показали, что липиды влияют на дифференцировку и созревание остеокластов и остеобластов, тем самым нарушая гомеостаз⁶⁰ костей. Многочисленные фундаментальные исследования продемонстрировали значительное участие апоптоза в физиологических и патологических механизмах SONFH. Последующие in vivo эксперименты на животных дополнительно подтвердили, что активная фракция CC эффективно подавляет апоптоз и воспаление при SONFH, тем самым смягчая прогрессирование заболевания.

В соответствии с этими результатами, сетевая фармакология и экспериментальные анализы показывают, что CC может улучшать SONFH, координируя адаптацию к гипоксии, регулируя ангиогенез и модулируя метаболические процессы. Количественный микро-КТ показал, что вмешательство CC значительно восстанавливало объёмную фракцию костей (BV/TV), снижало трабекулярное разделение (Tb.Sp, Tb.Th) и способствовало восстановлению костной микроструктуры. Анализ обогащения KEGG дополнительно выделил сигнальный путь HIF-1α как ключевой механизм, лежащий в основе этих эффектов. В совокупности эти эксперименты на животных показывают, что CC может облегчать SONFH, регулируя биологические процессы, связанные с гипоксией и воспалением, а также способствуя ангиогенезу и ремоделированию костей, потенциально через ключевые пути, такие как сигнальный путь HIF-1α.

Хотя были получены важные предварительные данные, у этого исследования все еще есть некоторые ограничения. Авторы опирались исключительно на современные методы биоинформатики, включая сетевую фармакологию и MD, а также некоторые эксперименты на животных, чтобы исследовать роль CC в SONFH. Поэтому надёжность и точность предсказаний необходимо дополнительно проверять в экспериментах in vivo и in vitro . Это исследование даёт предварительные подсказки о механизмах, с помощью которых CC улучшает SONFH, требующие дальнейшей экспериментальной валидации. Интегрируя сетевую фармакологию с MD, авторы систематически картировали кандидаты на биоактивные ингредиенты, ключевые мишени и обогащённые пути CC в SONFH. В заключение в этом исследовании рассматривались потенциальные защитные эффекты CC в SONFH с помощью интегративной сетевой фармакологии и валидации in vivo . Результаты показывают, что механизмы были связаны в первую очередь с модуляцией сигнального пути HIF-1 и стимулированием остеогенной регенерации. Как показано на соответствующем рисунке, улучшение CC значительно модулировало экспрессию ключевых белков, включая HIF-1α, VEGF и ALP, в зависимости от дозы, что дополнительно подтверждало его роль в координации адаптации гипоксии, ангиогенеза и остеогенной активности. Эти результаты были подтверждены микро-КТ-анализом, который показал, что вмешательство CC эффективно восстанавливает фракцию костного объёма и улучшает трабекулярную микроструктуру.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
4% PFA	biosharp	BL539A
Абсолютный этенол	Группа Sinopharm Co.Ltd	10009218
Alcian Blue Stain Kit	Solarbio	G1563
ALP	ariggo	ARG57422
AutoDock Vina	Scripps Research		Версия 1.2.7
AutoDockTools	Scripps Research		Версия 1.5.7
Онлайн-платформа по биоинформатике			https://www.bioinformatics.com.cn
CHARMM36 силовое поле			Используется для параметризации MD
CTD			https://ctdbase.org
Цитоскейп	Консорциум Cytoscape		Версия 3.10.3; плагины: CytoHubba, CytoNCA
Раствор для окрашивания DAPI	Beyotime Biotech Inc	C1006-50mL
ДЭВИД	NCI		https://david.ncifcrf.gov
Discovery Studio Visualizer	BIOVIA		BIOVIA Discovery Studio 2020; Визуализация стыковки
DisGeNET			https://disgenet.com
Декальцификация EDTA	Beyotime Biotech Inc	C0167-3L
Эндогенный раствор, блокирующий пероксидазу	Beyotime Biotech Inc	P0100A
GeneCards			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Козий антикроличий IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)	CST	4409
Козья сыворотка	Beyotime Biotech Inc	C0265
GraphPad Prism	GraphPad (Dotmatics)		Версия 10; Статистический анализ и построение графиков
ГРОМАКИ	ГРОМАКИ		Версия 2022; CHARMM36 силовое поле
Трава 2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1α	Ханчжоу Хуань	HA721997
Микро-КТ-оборудование высокого разрешения	Bruker	SkyScan
Фильтр по правилам Липинского			Mw и le; 500; miLogP и le; 5; HBD и LE; 5; HBA и LE; 10
Липополисахарид	Сигма-Олдрич	L4516
метилпреднизолон	Группа Sinopharm Co.Ltd	CATOCCAD302504100MG
Нейтральный бальзам	biosharp	BL704A
OMIM			https://www.omim.org
Парафин	Группа Sinopharm Co.Ltd	C416770020
Частица меш Эвальд (PME)			Дальнобойная электростатика
PubChem	NIH		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
PyMOL	Schrö Дингер		Визуализация и подготовка белков
R	CRAN		Версия 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
СТРУНА			https://string-db.org
SwissADME	Швейцарский институт		http://www.swissadme.ch
SwissTargetPrediction	Швейцарский институт		http://www.swisstargetprediction.ch
Водная модель TIP3P			Используется для сольватации
UniProt			https://www.uniprot.org
VEGF	Ханчжоу Хуань	ET1604-28
Вэйшэнсин			https://www.bioinformatics.com.cn
Windows 11	Microsoft		Используется для обработки данных, молекулярного стыковки и моделирования MD
Ксилол	Группа Sinopharm Co.Ltd	10023418