Выделение, синтез и характеристика наночастиц CD47- и интегрина α4/β1 — модифицированных макрофагов, покрытых мембраной, поли(молочно-когликолевой кислотой)

Summary

Этот протокол позволяет подготовить и характеризовать наночастицы CD47- и интегрина α4/β1-ко-модифицированных макрофагов с мембранным покрытием поли(молочно-когликолевая кислота) наночастиц для целенаправленной доставки лекарств.

Abstract

Атеросклероз — это хроническое воспалительное заболевание, являющееся одним из главных факторов сердечно-сосудистых заболеваний и смертности. Целенаправленная доставка противовоспалительных средств в атеросклеротические участки остаётся значительной проблемой. Здесь мы представляем подробный протокол подготовки и характеристики CD47- и интегринов α4/β1-ко-модифицированных макрофагов, покрытых мембраной колхицином поли(молочно-когликолевая кислота) наночастиц (MMM/COL NPs). Протокол включает модификацию макрофагов с помощью плазмидной трансфекции и стимуляции эндотелином-1, изоляцию мембран, изготовление NP и нанесение мембранного покрытия. Полученные NP MMM/COL оцениваются с помощью физико-химической характеристики, анализа экспрессии белков, а также тестов in vitro и in vivo . Функциональная валидация включает оценку клеточной ассоциации с активированными эндотелиальными клетками, захвата макрофагов, противовоспалительного эффекта в пенных клетках и биораспределения в модели атеросклероза мышей. Кроме того, выделены ключевые экспериментальные параметры и этапы контроля качества для обеспечения воспроизводимости и согласованности между лабораториями. Этот протокол обеспечивает надёжный и масштабируемый подход к созданию биомиметических NP для целевых применений лекарств в исследованиях атеросклероза.

Introduction

Атеросклероз — это хроническое воспалительное заболевание, приводящее к смертельным сердечно-сосудистым событиям и инсульту из-за стеноза просвета артерий и нестабильного разрыва бляшек, что составляет значительную глобальную нагрузку на здоровье ^1,2,3. Понижение воспалительных ответов в атеросклеротической зоне является основной терапевтической целью ^4,5. Колхицин, мощный противовоспалительный препарат, показал перспективы в снижении побочных сердечно-сосудистых^{событий 6,7}. Однако его клиническая полезность ограничена узким терапевтическим окном и системными побочными эффектами, что требует целенаправленных систем доставки для усиления накопления в месте налёта при минимизации^{токсичности 8}.

Наночастицы, покрытые мембраной клеток (НП), стали мощной платформой для целенаправленной доставки лекарств, используя естественные биологические функции исходных^{клеток 9,10,11}. Среди типов клеток, участвующих в атеросклерозе, макрофаги играют ключевую^роль 12,13,14. Интегрин α4/β1, экспрессируемый на макрофагах, опосредует рекрутацию в атеросклеротические бляшки, связываясь с молекулой адгезии сосудистых клеток-1 (VCAM-1), экспрессируемой на активированных эндотелиальных клетках (EC). CD47, сигнал «не ешь меня», позволяет избежать фагоцитоза с помощью мононуклеарной фагоцитовой^{системы 15,16}. Инженерируя макрофаговые мембраны для чрезмерной экспрессии этих белков по сравнению с нативными мембранами макрофагов, можно создавать NPs с усиленным таргетированием через взаимодействие интегрина α4/β1–VCAM-1 и снижением фагоцитоза через CD47-опосредованную^{сигнализацию 6}. Стратегия двойной модификации улучшает нативные мембранно-покрытые NP и системы наведения на основе лигандов, одновременно усиливая таргетирование активированных ЭК и снижая фагоцитарный клиренс. В отличие от нативных макрофаговых мембран, которые экспрессируют только исходные уровни этих белков, наша инженерная мембрана обеспечивает улучшенную функциональность без внедрения синтетических лигандов для таргетинга, которые могут активировать иммуногенность.

Этот протокол подробно описывает подготовку и характеристику колхицин-нагруженных поли(молочно-когликолевой кислоты) NP (COL NP), покрытых CD47- и интегрино-ко-модифицированными макрофаговыми мембранами, образующими модифицированные мембранные NP с покрытием макрофагов (MMM/COL NPs). Мы описываем методы генетической и фармакологической модификации макрофагов RAW 264.7, выделения модифицированных мембран, подготовки и покрытия PLGA NP, а также комплексных функциональных тестов in vitro и in vivo . Этот метод обеспечивает воспроизводимую основу для подготовки и оценки биомиметических NP для применения целевой доставки лекарств в исследованиях атеросклероза.

Protocol

Все процедуры для животных, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных больницы Нанкинской барабанной башни и соответствовали руководящим принципам по уходу и использованию лабораторных животных, установленным Национальными институтами здоровья.

1. Модификация макрофагов RAW 264.7

1. Подготовьте клетки RAW 264,7, заполните Modified Eagle Medium от Dulbecco, дополненную 10% плодовой бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином, плазмидой для гиперэкспрессии CD47, реагентом для трансфекции Lipofectamine 3000, эндотелином-1 (ET-1), фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и запасами для стерильной культуры тканей.
2. Культивировать RAW 264,7 клетки в увлажнённом инкубаторе при 37°C при 5% CO₂ и поддерживать клетки до тех пор, пока они не достигнут примерно 4–5 × 10⁵ клеток на скважину в пластине с 6 колодцами.
3. Выполнить модификацию CD47
   1. Приготовьте раствор плазмидной ДНК, смешивая 2,5 мкг плазмидной ДНК с 5 мкл реагента P3000 в 125 мкл Opti-MEM без сыворотки.
   2. Подготовьте раствор трансфекционного реагента, разбавляя 3,75 мкл трансфекционного реагента в 125 мкл среды без сыворотки.
   3. Используйте эти тома для формата пластин с 6 ячелинами. Масштабировать все компоненты пропорционально для других форматов, сохраняя соотношение ДНК:P3000 1:2 (мкг:мкл) и соотношение реагентов ДНК:трансфекции 1:1,5 (мкг:мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, используйте 10 мкг ДНК, 20 мкл P3000 и 15 мкл реагента трансфекции для тарелок диаметром 10 см.
   4. Комбинируйте раствор ДНК с раствором реагента для трансфекции и инкубируем 15 минут при 25°C.
   5. Добавьте трансфекционные комплексы к клеткам в безантибиотиковый DMEM с добавлением 10% FBS примерно 2–2,5 × 10⁶ клеток на 10 см чашки.
   6. Замените среду на свежую полную среду с антибиотиками через 6 часов после трансфекции.
4. Выполнить модификацию интегрина α4/β1
   1. Стимулировать трансфектированные или нетрансфектированные клетки с 100 нМ ET-1 в среде без сыворотки в течение 24 часов для повышения экспрессии интегрина α4/β1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте эффективность модификации с помощью количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) и анализа вестерн-блот для CD47, интегрина α4 и интегрина β1.

2. Изоляция модифицированной макрофаговой мембраны (MMM)

1. Собирайте модифицированные клетки RAW 264.7 с помощью скребка.
2. Центрифугуйте клетки при 900 × г в течение 5 минут при 4°C.
3. Промой клеточную гранулу три раза холодной 1× PBS.
4. Ресуспензировать клеточную гранулу в 2 мл предварительно охлаждённого гипотонического лизисного буфера (10 мм Tris-HCl, pH 8,0, 1 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl₂ и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида) и инкубировать суспензию на льду в течение 15 минут.
5. Заморозите суспензию в жидком азоте на 2 минуты, затем разморозите в водяной бане при температуре 37°C в течение 5 минут. Повторите цикл заморозки–оттаивания пять раз, чтобы полностью лизировать клетки.
   ВНИМАНИЕ: Жидкий азот может вызвать серьёзные криогенные ожоги. Используйте соответствующие утеплённые перчатки и защиту для лица.
6. Центрифугуйте лизат при 850 × г в течение 10 минут при 4°C, чтобы удалить ядра и целые клетки.
7. Центрифугуйте собранный супернатант при 15 000 × г в течение 30 минут при 4°C. Для получения более высокой чистоты мембраны перенесите супернатант, полученный после центрифугирования на 15 000 × г, в ультрацентрифугные трубки и центрифугу при 100 000 × г в течение 1 часа при 4°C с помощью ультрацентрифуга.
   ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что ультрацентрифугные трубки правильно сбалансированы и рассчитаны на высокоскоростное центрифугирование, чтобы предотвратить дисбаланс или отказ ротора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ультрацентрифугирование даёт очищенные плазматические мембраны с уменьшенным внутриклеточным загрязнением органелл.
8. Соберите гранулы, содержащие фрагменты MMM, и ресуспензируйте её в 300 мкл 1× PBS или лизис-буфере, чтобы получить концентрацию белка примерно 1–2 мг/мл.
9. Определите концентрацию мембранного белка с помощью набора для количественного анализа белков BCA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные мембраны можно хранить при температуре −80°C для последующего использования.

3. Подготовка НП с колхицином, загруженных колхицином,

1. Растворить 10 мг PLGA (50:50, МВт 90 000) и 1 мг колхицина в 1 мл диметилсульфоксида (DMSO).
   ВНИМАНИЕ: ДМСО может проникать в кожу и улучшать всасывание других веществ. При обращении носите соответствующие средства индивидуальной защиты (нитриловые перчатки, лабораторный халат и защитные очки). Собирайте растворы, содержащие DMSO, в качестве органических растворителей, и утилизируйте их через лицензированные службы по утилизации опасных отходов. Колхицин токсичен и потенциально тератогенен. Собирать все материалы, загрязнённые колхицином (растворы, перчатки и трубки), как опасные фармацевтические отходы и утилизировать через лицензированные службы по утилизации опасных отходов в соответствии с институциональными и местными нормативами.
2. Размешивайте раствор со скоростью 500 об/мин с помощью магнитной мешатки с 10-мм тефлоновым покрытием при 25°C.
3. Добавьте 4 мл ультрачистой воды по капле примерно 1 мл/мин с помощью шприцового насоса с 5 мл шприца и иглой 26 г при 25°C.
4. Продолжайте перемешивать смесь в течение 3 часов, чтобы образоваться NP.
5. Перенесите подвеску NP в сумку для диализа (MWCO 3 500 Da).
6. Диализ с 2 литрами дистиллированной воды при 4°C при аккуратном перемешивании при 200 об/мин.
7. Продолжайте диализ в течение 24 часов и полностью заменяйте буфер диализа через 6, 12 и 24 часа, чтобы удалить свободный колхицин и ДМСО.
   ВНИМАНИЕ: Собирайте все органические растворители и реагенты, включая те, что проходят с диализа, как органические химические отходы. Не выбрасывайте его в слив. Соблюдайте институциональные протоколы утилизации опасных отходов.
8. Соберите диализованную подвеску COL NP и храните при 4°C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: COL NP могут храниться при 4°C для краткосрочного использования (до 3 дней). Для флуоресцентной маркировки включите 0,1% (w/w) 1,1′-диоктадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндокарбоцианиновый перхлорат (DiI) красителя в раствор PLGA на этапе 3.1.
9. Проверьте удаление ДМСО и бесплатного колхицина
   1. Соберите финальный диализат (буфер после последнего изменения через 24 часа) и проанализируйте его с помощью ультрафиолетово-видимой (УФ-видимой) спектрофотометрии.
   2. Отсканируйте диализат от 200 до 400 нм и сравните его с контрольным образцом (свежим буфером для диализа).
   3. Подтвердите, что пик всасывания отсутствует примерно на 210 нм (характерно для DMSO) или на 345 нм (характерно для колхицина), что свидетельствует об успешном удалении остаточного растворителя и свободного препарата.
   4. В качестве альтернативы определите остаточную концентрацию DMSO с помощью набора DMSO согласно инструкциям производителя. Убедитесь, что остаточный уровень DMSO ниже 0,1% (v/v), чтобы избежать цитотоксичности в следующих анализах.

4. Изготовление мембранных NP (MMM/COL NP)

1. Сониковать изолированную MMM-суспензию (начиная с шага 2.7) в течение 20 минут с помощью водяного соникатора на частоте 40 кГц и 110 Вт. Поддерживайте объём образца на уровне 1 мл в трубке 1,5 мл и при температуре ниже 25°C, используя ледяную ванну по необходимости.
2. Экструдировать суспензию звуковой мембраны через поликарбонатный мембранный фильтр с порой размером 400 нм с помощью мини-экструдера для формирования мембранных пузырьков.
3. Смешайте COL NPs (начиная с шага 3.5) с MMM везикулами при соотношении массы мембранного белка к PLGA 1:1.
   1. Используйте мембранную суспензию, содержащую 10 мг белка, для 10 мг PLGA согласно количественному анализу белков.
   2. Аккуратно перемешайте COL NP с пузырьками MMM вверх и вниз 15 раз с помощью пипетки объемом 1 мл.
4. Совместно экструдируйте смесь через поликарбонатный мембранный фильтр с порой размером 200 нм и повторяйте экструзию в течение 15 проходов.
5. Соберите полученную суспензию, содержащую MMM/COL NP, и храните при температуре 4°C для немедленного использования.

5. Характеристика NP

1. Измерьте гидродинамический диаметр, индекс полидисперсности (PDI) и зета-потенциал с помощью динамического рассеяния света (DLS) при следующих условиях: температура 25°C; угол обратного рассеяния — 173°; время равновесия — 2 мин; и три повторных измерения на образец.
2. Разбавить образцы в 20 раз в деионизированной воде (конечная концентрация примерно 0,1 мг/мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление минимизирует эффекты множественного рассеяния.
3. Визуализировать структуру сердечника и оболочки НП MMM/COL с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (TEM).
   1. Поместите 5 мкл NP-суспензии (примерно 0,1 мг/мл) на сетку медной сетки с углеродним покрытием (300 меш).
   2. Дайте образцу адсорбировать 2 минуты при 25°C.
   3. Удалите лишнюю жидкость, аккуратно коснувшись края сетки фильтрующей бумагой.
   4. Нанесите 5 мкл раствора уранилацетата 1% на сетку и инкубируем 1 минуту при 25°C.
   5. Удалите лишние пятна фильтрующей бумагой.
   6. Дайте сетке полностью высохнуть на воздухе минимум 10 минут перед фотографированием.
      ВНИМАНИЕ: Уранилацетат токсичен и радиоактивен. Обращайтесь с соответствующими средствами индивидуальной защиты (перчатками, лабораторным халатом и защитой для глаз) и утилизируйте отходы в соответствии с институциональными рекомендациями по опасным материалам.
4. Помечайте мембрану красителем 3,3′-диоктадециклоксакарбоцианина перхлората (DiO) на этапе 2 или помечая целые клетки перед выделением мембраны, а ядро PLGA — DiI.
5. Проанализировать ко-локализацию сигналов DiO (зелёный) и DiI (красный) с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM).
   1. Параметры возбуждения/излучения устанавливаются следующим образом: DiO (зелёный), возбуждение 488 нм, эмиссия 550 нм; DiI (красный), возбуждение 561 нм, эмиссия 620 нм.
   2. Используйте объектив с погружением в масло 60× (числовая диафрагма 1,4).
   3. Установите отверстие на 1 блок Airy.
   4. Отрегулируйте усиление детектора, чтобы избежать насыщения пикселей.
   5. Снимайте изображения с разрешением 1024 × 1024 пикселя с усредненным уровнем 2× строк.
   6. Поддерживайте мощность лазера ниже 5%, чтобы минимизировать фотоотбеливание.
6. Проанализируйте наличие CD47, интегрина α4 и интегрина β1 на поверхности MMM/COL NP с помощью вестерн-блот-анализа.
7. Определить загрузку и выброс препарата
   1. Лизируйте объём NP в DMSO объемом 100 мкл и измеряйте поглощение колхицина при 345 нм для определения эффективности загрузки и инкапсуляции препарата.
   2. Поместите 1 мл суспензии MMM/COL NP (содержащей примерно 100 мкг колхицина) в диализный мешок (MWCO, 3 500 Da).
   3. Запечатайте пакет и погрузите его в 50 мл PBS (pH 7,4), содержащего 20% FBS, в стеклянном стакане объёмом 100 мл.
   4. Поддерживайте среду для выпуска при 37°C при постоянном помешивании при 100 об/мин с помощью магнитной мешалки с 20-мм тефлоновым покрытием.
   5. Поддерживайте условия в раковине на протяжении всего эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворимость колхицина при PBS при 20% FBS составляет >1 мг/мл; Максимальная концентрация колхицина в среде для высвобождения составляет <10% от насыщения.
   6. В заранее определённые моменты времени (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 и 62 часа) извлекают 500 мкл среды выпуска.
   7. Замените отключённый объём на такой же объем свежего предварительно подогреного PBS (37°C) с содержанием 20% FBS.
   8. Измерьте концентрацию колхицина в изъятых образцах с помощью УФ-спектрофотометрии на расстоянии 345 нм.
   9. Выполняйте все измерения в тройном экземпляре.

6. Функциональные анализы in vitro

1. Семена эндотелиальных клеток человеческой пуповины (HUVECs). Стимулируйте клетки фактором некроза опухолей альфа (TNF-α с концентрацией 10 нг/мл, чтобы повысить регуляцию VCAM-1.
2. Клеточная ассоциация MMM/DiI NP с HUVEC
   1. Инкубировать клетки с метичными МММ/COL NP (MMM/DiI NP) с концентрацией 50 мкг/мл (на основе массы ядра PLGA) в течение 4 часов при 37°C в атмосфере с содержанием CO₂ 5%.
   2. Промой клетки три раза с предварительно охлаждённым PBS. Центрифугуйте ячейки при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C после каждого мытья.
   3. Суспензировать промытые клетки в PBS, содержащие 0,5% бычий сывороточный альбумин (BSA). Отрегулируйте конечную концентрацию ячеек на 1 × 10⁶ клеток/мл.
   4. Задайте параметры прибора для потоковой цитометрии или CLSM. Обнаружить флуоресценцию DiI с помощью возбуждения на 549 нм и излучения на 565 нм (канал PE).
   5. Собирайте данные из образцов. Собрать не менее 10 000 событий на образец для потоковой цитометрии или захватить репрезентативные поля для CLSM.
   6. Выберите пять репрезентативных полей на образец из различных областей, исключая рёбра, с помощью 60× масляной иммерсионной линзы. Убедитесь, что клетки целы и не перекрываются.
   7. Перед получением изображений слепые образцы сделайте вслепую. Выбирайте поля, случайным образом перемещая уровень, а не выбирая конкретные области вручную.
   8. Применить одинаковые порог и параметры анализа ко всем образцам при слепых условиях.
   9. Исключайте клеточный мусор с помощью гейтинга FSC-A/SSC-A. Выберите синглетные клетки с помощью гейтинга FSC-A/FSC-H.
   10. Выбирайте живые клетки с помощью окрашивания с помощью окрашивателя на жизнеспособность. Добавьте 7-аминоактиномицин D (7-AAD) при 1 мкг/мл, инкубуйте 5 минут при 4°C в темноте и используйте для гейтинга живых клеток.
   11. Анализируйте интенсивность флуоресценции для количественной оценки клеточной ассоциации. Используйте среднюю интенсивность флуоресценции в качестве метрики количественной оценки. Проводите анализ данных с помощью программного обеспечения FlowJo (v10.8.1) для анализа потоковой цитометрии.
3. Клеточное поглощение MMM/DiI NP макрофагами RAW 264.7
   1. Инкубировать MMM/COL NP (MMM/DiI NP) с немодифицированными макрофагами RAW 264,7 в концентрации 50 мкг/мл (на основе массы ядра PLGA) в течение 4 часов при 37°C в атмосфере с содержанием CO₂ 5%.
   2. Подготовьте клетки к анализу, как описано в шагах 6.2.2–6.2.3.
   3. Установка параметров прибора для обнаружения DiI с помощью возбуждения на 549 нм и излучения на 565 нм (канал PE).
   4. Собирайте данные из образцов. Соберите не менее 10 000 событий на образец.
   5. Исключайте клеточный мусор с помощью гейтинга FSC-A/SSC-A. Выберите синглетные клетки с помощью гейтинга FSC-A/FSC-H.
   6. Выбирайте живые клетки с помощью окрашивания с помощью окрашивателя на жизнеспособность. Добавьте 7-AAD при 1 мкг/мл, инкубировать 5 минут при 4 °C в темноте и использовать для гейтинга живых клеток.
   7. Анализируйте интенсивность флуоресценции для количественной оценки клеточного поглощения. Используйте среднюю интенсивность флуоресценции в качестве метрики количественной оценки. Проводите анализ данных с помощью программного обеспечения для анализа потоковой цитометрии.
4. Анализ на пеноэлементах
   1. Дифференцировать клетки RAW 264,7 в пенистые клетки, инкубировав с окислённым липопротеином низкой плотности (oxLDL) при 50 мкг/мл в течение 48 часов. Подтверждение образования пенистых клеток с помощью окрашивания маслом Red O, что указывается на внутриклеточное накопление липид.
   2. Обрабатывайте пенные клетки свободным колхицином, COL NPs или MMM/COL NPs при эквивалентной концентрации колхицина 1 мкм. Инкубировать клетки в течение 24 часов при 37°C в увлажнённой атмосфере с содержанием 5% CO₂.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте эту концентрацию на основе предварительных экспериментов доза-ответ, оценивающих жизнеспособность клетки и противовоспалительные эффекты.
   3. Измерять уровень воспалительных цитокинов с помощью ферментно-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA).
      1. Собирайте супернатанты клеточной культуры сразу после обработки (через 24 часа после обработки).
      2. Центрифугуйте пластины при температуре 300 × г в течение 5 минут при 4°C, чтобы удалить клеточный мусор.
      3. Переведите очищенные супернатанты в чистые трубки и храните при −80°C до анализа.
      4. Измеряйте уровни TNF-α и интерлейкина-6 с помощью наборов ELISA согласно инструкциям производителя.
      5. Проведите все измерения в трёхкратных скважинах и повторите эксперимент три независимых раза.
      6. Сообщать концентрации цитокинов как абсолютные значения (pg/mL) без дополнительной нормализации, поскольку плотность посева клетки и условия обработки одинаковы во всех группах.

7. Терапевтическое применение in vivo в модели атеросклероза

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры для животных должны быть одобрены соответствующим Институциональным комитетом по уходу и использованию животных.

1. Установление животной модели
   1. Установите уязвимую модель атеросклеротической бляшки у 8-недельных самцов мышей с аполипопротеином E knockout (ApoE⁻/⁻) (фон C57BL/6).
   2. Кормите мышей диетой с высоким содержанием жира, содержащей 15% жира и 0,25% холестерина ad libitum, в течение недели до операции и продолжайте делать это в течение 4 недель после операции.
   3. Анестезировать мышей изофлураном (2–3% для индукции и 1,5–2% для поддержания) и вводить бупренорфин (0,1 мг/кг, подкожно) для обезболивания во время операции по сужению сонной артерии.
   4. Сужьте левую общую сонную артерию иглой диаметром 0,3 мм, установленной рядом с артерией. Обвяжите шёлковую связку 6-0 вокруг артерии и иглы, затем уберите иглу, чтобы создать частичное сужение.
   5. Подтверждение уязвимого образования бляшек через 4 недели после операции с помощью гистологического обследования.
   6. Проведите окрашивание гематоксилина и эозина (H&E), Oil Red O и трихромное окрашивание Массона для оценки морфологии бляшек, липидного отложения и содержания коллагена.
   7. Определите уязвимые бляшки по площади бляшек > 40% от площади поперечного сечения сосудов, толщине волокнистой шапки < 120 мкм, площади липидного ядра > 40% от общей площади бляшек и значительной инфильтрации CD68-положительных макрофагов.
2. Внутривенно введите 100 мкл МММ/COL NP с маркировкой DiI через хвостовую вену при дозе 2 мг/кг (исходя из массы ядра PLGA).
   1. Снимите мышей через 1 день после инъекции с помощью системы in vivo визуализации для оценки биораспределения всего тела.
      1. Анестезировать мышей изофлураном (3% для индукции и 1,5–2% для поддержания, при расходе кислорода 1 и 0,5 л/мин соответственно). Контролируйте глубину анестезии по частоте дыхания и рефлексу сжатия пальцев.
      2. Размещайте мышей на спине на нагретой сцене при температуре 37°C, чтобы поддерживать температуру тела во время съёмок.
      3. Получайте флуоресцентные изображения с использованием настроек DiI (возбуждение 549 нм и эмиссия 565 нм) с набором фильтров CY3 или TRITC. Используйте режим автоэкспозиции (обычно 50–200 мс) и эпифлуоресценционное получение.
      4. Одновременно захватывайте соответствующие изображения яркого поля для анатомической справки с разрешением 1024 × 1024 пикселей.
   2. Взять основные органы и сонные артерии для экс-виво флуоресцентной визуализации.
      1. Анестезируйте мышей изофлураном (3% для индукции и 2,5–3% для поддержания).
      2. Перфузировать мышей с 20 мл ледяной PBS (pH 7,4) с помощью пункции левого желудочка при расходе 5 мл/мин для удаления остаточной крови и несвязанных NPs.
      3. Извлекать органы (сердце, аорту, печень, селезёнку, почки и лёгкое) сразу после перфузии через 24 часа после инъекции.
      4. Промывайте собранные органы в ледяной PBS для удаления поверхностной крови.
      5. Откройте аорту вдоль и закрепите её плоско (эндотелиальная сторона вверх) на чёрную силиконовую пластину с помощью штифтов из нержавеющей стали.
      6. Храните ткани в ледяной PBS и проводите экс-виво флуоресцентную визуализацию в течение 30 минут после уборки. Удалите избыток PBS с поверхности ткани непосредственно перед проведением визуализации.
3. Проведите дозировку и лечение
   1. Определите дозу колхицина на основе предварительного исследования дозы-ответа (0,01–0,45 мг/кг, n = 7/группа). Выберите 0,05 мг/кг колхицина в качестве терапевтической дозы.
   2. Введите 100 мкл с помощью инъекции в хвостовую вену, что соответствует дозе NP 2 мг/кг (масса ядра PLGA) и дозе колхицина 0,05 мг/кг. Делайте инъекции один раз в день в течение 14 дней подряд.
   3. Рандомизируйте мышей по группам лечения (PBS, свободный колхицин и NPs MMM/COL) с помощью генератора случайных чисел. Проведите все количественные оценки двумя наблюдателями, ослеплёнными к группам лечения.
   4. Применяйте гуманные показатели, включая >20% потерю веса, снижение подвижности или признаки стресса.
4. Выполните анализ конечных точек
   1. Усыпить мышей через 24 часа после финальной инъекции. Собирайте сонные артерии и аорты. Оцените нагрузку налёта, окрашивая аорты маслом Red O.
   2. Количественная оценка площади таблички
      1. Количественно определите площадь бляшки как процент Oil Red O-положительной площади общей площади просвета аорты в сечениях (пять сечений на мышь) с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
      2. Откройте изображение в программном обеспечении для анализа изображений ImageJ.
      3. Нажмите Изображение → Введите → 8-бит, чтобы преобразовать изображение в оттенки серого.
      4. Нажмите на изображение → отрегулировать → порог. Выберите метод Оцу и примените порог для выявления O-положительных областей Oil Red.
      5. Примените одинаковые пороговые параметры ко всем образцами и запишите пороговые настройки для проверки.
      6. Нажмите «Анализировать» → «Задать измерения» и выбрать «Площадь».
      7. Нажмите Анализ → Измерить, чтобы количественно оценить выбранные регионы.
      8. Экспортировать количественные данные.
   3. Оценка устойчивости бляшек
      1. Оцените устойчивость налёта с помощью гистологического окрашивания поперечных срезов сонной артерии с помощью H&E, Oil Red O и трихромного окрашивания Masson. Количественно определите коллаген как трихромно-положительный синий процент площади налёта.
      2. Подготовьте замороженные срезы с парафином толщиной 5 мкм и оптимальной температурой резки с вбитыми заморожёнными секциями толщиной 8 мкм.
      3. Проведите окрашивание H&E, депарафинизируя и увлажняя участки, затем окрашивание гематоксилином в течение 5 минут и эозиновое окрашивание 2 минуты при комнатной температуре (RT; 23°C ± 2°C).
      4. Проведите окрашивание Oil Red O на замороженных участках, инкубируя с рабочим раствором Oil Red O в течение 15 минут на RT. Дифференцируйте секции в 60% изопропаноле в течение 2 секунд и промывайте дистиллированной водой.
      5. Проведите трихромное окрашивание Массона согласно инструкции набора, инкубировав секции с железным гематоксилином Вайгерта в течение 10 минут, фуксином Понсо-кислотой 5 минут, фосфомолибдовой кислотой 5 минут и анилин-синим в течение 5 минут на RT.
      6. Открытые гистологические изображения в программном обеспечении для анализа изображений.
      7. Применяйте цветовой порог для выявления коллаген-положительных областей. Выполните автоматическое пороговое определение и примените одни и те же параметры ко всем образцам образцов.
      8. Запишите настройки порога для верификации.
      9. Определите общую площадь бляшек как сумму всех площадей бляшек внутри сосудистой интимы.
      10. Измеряйте площадь бляшек, вручную обводя границы бляшек или используя автоматическую пороговую сегментацию для идентификации всех областей бляшек.
      11. Измерьте область с положительным содержанием коллагена.
      12. Рассчитайте содержание коллагена как область положительного коллагена, делённая на общую площадь бляшки × 100%.
   4. Оценка содержания макрофагов
      1. Проведите иммунофлуоресцентное окрашивание CD68 для оценки содержания макрофагов. Количественно определите содержание макрофагов как процент CD68-положительной площади площади бляшек.
      2. Подготовьте тканевые срезы (толщиной 5 мкм для срезов с парафином). Провести извлечение антигена с использованием цитратного буфера (pH 6,0) под высоким давлением в течение 2 минут.
      3. Блок-секции с 5% BSA на 30 минут на RT.
      4. Инкубировать секции с помощью моноклонального первичного антитела CD68 против мышей (клон D4B9C, разбавление 1:200 при 1% BSA) ночью при 4°C.
      5. Инкубировать секции с помощью козьих антител IgG против кроликов (разбавление 1:500) в течение 1 часа при RT.
      6. Контрокрашивание ядра 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в течение 5 минут.
      7. Открывайте флуоресцентные изображения в программном обеспечении для анализа изображений.
      8. Определите CD68-положительные области с помощью порогового значения. Выполните автоматическое пороговое определение и примените одни и те же параметры ко всем образцам образцов.
      9. Запишите настройки порога для верификации.
      10. Измерьте область с положительным CD68.
      11. Вычислите содержание макрофагов как CD68-положительную область, делённую на общую площадь бляшек × 100%.

Results

Измерения DLS проводились с помощью системы Zetasizer Nano ZS при 25°C с углом обратного рассеяния 173°. Образцы разбавлялись в деионизированной воде в 20 раз (конечная концентрация примерно 0,1 мг/мл) и уравновешены в течение 2 минут перед измерением. Каждый образец измерялся в тройном экземпляре, а результаты представлены как среднее ± SD. DLS и TEM показывают увеличение размера NP после нанесения мембранного покрытия и подтверждают формирование структуры сердечник–оболочка (

Discussion

Этот протокол предоставляет комплексный метод создания и применения CD47- и интегринов α4/β1-ко-модифицированных макрофагов с мембранным покрытием NP для таргетной терапии атеросклероза. Ключевые преимущества этой системы включают активное таргетирование через взаимодействие интегрина α4/β1–VCAM-1 и снижение поглощения макрофагов, связанное с CD47-опосредованной сигнализацией, что подтверждается экстракорпоральными анализами (рисунок 3) и результатами би...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-аминоактиномицин D (7-AAD)	Thermo Fisher Scientific (США)	A1310	Краситель жизнеспособности для различения живых и мёртвых в потоковой цитометрии
Alexa Fluor 488-конъюгированный козёл против кроликов IgG	Thermo Fisher Scientific (США)	A-11008	Вторичное антитело для иммунофлуоресцентного окрашивания CD68
Антитела к CD47 к мышам	Abcam (США)	ab214453	Используется для анализа вестерн-блот для проверки экспрессии CD47
Антимышиный интегрин и альфа; 4 антитела (B-2)	Santa Cruz Biotechnology (США)	SC-376334	Используется для анализа вестерн-блот для проверки интегрина и альфа; 4 выражение
Антимышиный интегрин и бета; 1 антитело (A-4)	Santa Cruz Biotechnology (США)	SC-374429	Используется для анализа западных блотов для проверки интегрина и бета; 1 выражение
ApoE-/- мыши	Лаборатория Джексона (США)	Н/Д	Используется для модели атеросклероза in vivo
Набор для анализа BCA	Thermo Fisher Scientific (США)	23225	Используется для определения концентрации белка
Чёрная силиконовая пластина	Н/Д	Н/Д	Раньше устанавливал аорту для ex vivo визуализации
Плазмида CD47 (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (Китай)	G0177361-1	Содержит ген Cd47 мыши для гиперэкспрессии
Колхицин	Sigma-Aldrich (США)	C9754	Терапевтическая нагрузка в наночастицах
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп	Leica Microsystems	TCS SP8	Используется для флуоресцентной визуализации и анализа ко-локализации
Цитратный буфер (pH 6,0)	Thermo Fisher Scientific (США)	Н/Д	Используется для извлечения антигена при иммунофлуоресцентном окрашивании
Диализная трубка (MWCO 3 500 Da)	Sigma-Aldrich (США)	PURD35030	Используется для очистки наночастиц
Диметилсульфоксид (DMSO)	Sigma-Aldrich (США)	D2447	Растворитель для подготовки наночастиц
DiI (1,1′-диоктадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат)	Бейотиме (Китай)	C1036	Флуоресцентная маркировка ядра наночастиц
DiO (3,3′-диоктадециклоксакарбоцианин перхлорат)	Бейотиме (Китай)	C1038	Флуоресцентная маркировка мембраны макрофагов
DiR	Бейотиме (Китай)	Y239280	Используется для флуоресцентной визуализации in vivo
DAPI	Thermo Fisher Scientific (США)	D3571	Ядерная контрокрашивание для флуоресцентной визуализации
Дульбекко Модифицированный Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific (США)	11965092	Среда для культивирования клеток
Динамический анализатор рассеяния света (Zetasizer Nano ZS)	Malvern Panalytical (Великобритания)	Н/Д	Используется для измерений размера наночастиц, PDI и зета-потенциала с помощью динамического рассеяния света (DLS)
Комплект ELISA	R& D Systems (США)	Зависит от целевого цитокина	Используется для количественной оценки воспалительных цитокинов
Эндотелин-1 (ET-1)	Sigma-Aldrich (США)	E7764	Используется для стимуляции интегрина и альфа; 4/и бета; 1 выражение
Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific, США)	10091148	Добавка для среды для культивирования клеток
Потоковый цитометр	BD Biosciences (США)	FACSCalibur	Используется для приёма флуоресцентного сигнала
Программное обеспечение для анализа потоковой цитометрии (FlowJo v10.8.1)	BD Biosciences (США)	Н/Д	Используется для анализа данных потоковой цитометрии
Эндотелиальные клетки пуповиной вены человека (HUVEC)	FuHeng Biotechnologies (Китай)	FH1122	Используется для наведения in vitro
Программное обеспечение для анализа изображений (ImageJ)	Национальные институты здравоохранения (США)	Н/Д	Используется для количественного анализа изображений
Система in vivo визуализации	ПеркинЭлмер (США)	IVIS Lumina III	Используется для флуоресцентной визуализации всего тела
Изопропанол (60%)	Sigma-Aldrich (США)	34863	Используется для дифференцировки при окрашивании маслом Red O
Липофектамин 3000	Thermo Fisher Scientific (США)	L3000001	Трансфекционный реагент
Магнитная мешалка и перекладина для перемешивания	Н/Д	Н/Д	Используется для подготовки наночастиц
Массон s Trichrome Colour Kit	Abcam (США)	ab150686	Используется для окрашивания коллагена
Мини-экструдер	Avanti Polar Lipids (США)	610000	Используется для мембранной экструзии
Клеточная линия мыши RAW 264.7	FuHeng Biotechnologies (Китай)	FH0328	Источник макрофагов
Линия гладкомышечных клеток мыши	FuHeng Biotechnologies (Китай)	FH-Y063	Используется для оценки безопасности
Oil Red O	Sigma-Aldrich (США)	O0625	Используется для липидного окрашивания
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific (США)	31985062	Редуцированная сывороточная среда для трансфекции
Окисленный липопротеин низкой плотности (Ox-LDL)	Yiyuan Biotechnologies (Китай)	YB-002	Используется для индуцирования образования пенопластовых элементов
Penicillin– стрептомицин	Thermo Fisher Scientific (США)	15140122	Антибиотик для культивирования клеток
Фенилметилсульфонилфторид (ПМСФ)	Sigma-Aldrich (США)	78830	Ингибитор протеазы
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)	Thermo Fisher Scientific (США)	10010023	Буфер промывания и разбавления
Поли(молочно-когликолевая кислота) (PLGA, 50:50; МВт 90 000)	Далянь Мэйлунь Биотехнология (Китай)	MB5649-1	Полимер для производства наночастиц
Поликарбонатные мембранные фильтры (200 нм, 400 нм)	Whatman (Великобритания)	800282	Используется для экструзии
Хлорид калия (KCl)	Sigma-Aldrich (США)	P9333	Компонент буфера лизиса
Реагент P3000	Thermo Fisher Scientific (США)	L3000001	Усилитель трансфекции
Ротационный микротом	Leica Biosystems (Германия)	RM2235	Используется для парафинового сечения
Шприцовый насос	Гарвардский аппарат (США)	70-3007	Используется для контролируемого образования наночастиц
Трансмиссионный электронный микроскоп (TEM)	Thermo Fisher Scientific (США)	Talos F200S	Используется для наночастичной визуализации
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (США)	T2663	Компонент буфера
Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α)	R& D Systems (США)	410-MT	Используется для активации эндотелиальных клеток
Ультрачистая вода	Milli-Q (Merck, США)	ZMQSV0T01	Используется для подготовки наночастиц и диализа