Создание эффективных моделей бластоцист, полученных на основе стволовых клеток, для экологических исследований

Sergi Junyent; Manasvi Pinnaka; Magdalena Zernicka-Goetz

doi:10.3791/70796

Method Article

Создание эффективных моделей бластоцист, полученных на основе стволовых клеток, для экологических исследований

DOI:

10.3791/70796

⸱

July 14th, 2026

Sergi Junyent^*¹ , Manasvi Pinnaka¹ , Magdalena Zernicka-Goetz^*¹

¹Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

^* These authors contributed equally

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает генерацию и анализ iGATA4-бластоидов — масштабируемой модели на основе стволовых клеток, которая повторяет ключевые особенности бластоцисты мышей, включая организацию линии и кавитацию, а также позволяет воспроизводимую высокопроизводительную оценку возмущений окружающей среды и молекуляр, влияющих на раннее эмбриональное развитие.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональные модели на основе стволовых клеток предоставляют мощную платформу для изучения раннего развития млекопитающих и их чувствительности к возмущениям окружающей среды. Здесь представлен надёжный и доступный протокол для получения высокоточных мышиных бластоидов с использованием эмбриональных стволовых клеток (ESC), трофобластных стволовых клеток (TSC) и эмбриональных стволовых клеток, разработанных для индуцируемой экспрессии GATA4 (iGATA4-ESC). Эта система производит iGATA4-бластоиды, которые точно воспроизводят естественную морфологию E4.5 бластоцист, пропорции линии и транскрипционные сигнатуры, обеспечивая надёжную in vitro модель примитивного эндодерма (PE), эпифласта (EPI) и трофэктодермы (TE). Этот протокол впервые демонстрирует, как поддерживать и подготовлять три популяции стволовых клеток, необходимые для формирования бластоидов. Затем описывается пошаговая сборка iGATA4-бластоидов в условиях предварительной культуры, выделяя критические экспериментальные параметры. Для обеспечения строгой характеристики предоставляется проверенный рабочий процесс фиксации, окрашивания и визуализации бластоида. Наконец, приводится пример, показывающий, как iGATA4-бластоиды могут использоваться для высокопроизводительных анализов. Подвергая большие когорты бластоидов воздействию определённых факторов окружающей среды, можно быстро и воспроизводить изменения в морфологии, распределении родословных и прогрессии развития. В совокупности этот протокол создаёт масштабируемую платформу для моделирования развития до имплантации, анализа ранних решений по линии и проведения мультипараметрических скринингов для оценки влияния окружающей среды или молекуляр на формирование бластоцист.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание того, как ранние эмбрионы млекопитающих самособираются и как общие факторы окружающей среды могут негативно влиять на их формирование, требует воспроизводимых, экспериментально доступных и масштабируемых моделей. Интегрированные эмбриоподобные модели, созданные путём объединения эмбриональных и экстраэмбриональных стволовых клеток, предоставляют такую^{платформу} ^1,2. Этот протокол описывает, как эмбриональные стволовые клетки (ESC), трофобластные стволовые клетки (TSC) и ESC, спроектированные для индуцируемой экспрессии GATA4 (iGATA4-ESC), могут быть собраны в условиях до имплантации для получения бластоидов с устойчивыми и правильно пропорциональными примитивными эндодермическими линиями (PE), эпифобластом (EPI) и трофэктодермом (TE). Недавние исследования показали, что эти структуры, называемые iGATA4-бластоидами³, похожи на бластоцисту E4.5 по пропорциям линии, транскрипционным сигнатурам и экспрессии функциональных маркеров. При культивировании in vitro 12,5% этих структур переходят в постимплантационную морфологию. Важно, что они подвержены токсикологическим и экологическим анализам.

Разработка этой методики была вызвана ограничениями в уже существующих бластоидных^{системах} ^2,4,5. Хотя многие^{протоколы} ^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} образуют кавитированные структуры, напоминающие ранние бластоцисты, большинство из которых делают это с относительно низкой эффективностью или образуют структуры с неполным образованием ПЭ, неопределёнными клеточными идентичностями или неправильными пропорциями родословных. Эти несоответствия снижают их пригодность для механистических исследований и высокопроизводительных экранов возмущений. Поскольку спецификация PE in vivo следует активации GATA6, SOX17, GATA4 и^{SOX7 22}, а дефекты либо в ПЭ, либо в её производном, висцеральная эндодерма (VE) нарушают развитие^{периимплантации} 23,24,25,26,27, обеспечивая эту транскрипционную программу in vitro Улучшает качество бластоида. ESC, несущие условный трансген GATA4, устойчиво трансдифференцируются в VE и при сочетании с ESC и TSC в постимплантационных условиях генерируют интегрированные эмбриональные модели, которые гаструлизируют и инициируют^{органогенез} 28,29,30,31. Здесь этот принцип адаптирован к условиям до имплантации, демонстрируя, что iGATA4-ESC надёжно генерируют ПЭ и образуют бластоиды, очень похожие на природные^{бластоцисты 3}.

Этот метод преодолевает прежние ограничения в моделировании бластоцисты с использованием стволовых клеток и обеспечивает высокую эффективность образования бластоидов (80% образованных структур — это бластоиды, 75% из которых демонстрируют правильную структуру и пропорции родословной) и высокую сходство с эмбрионами. Кроме того, модульная сборка iGATA4-бластоидов, при которой каждая линия бластоциста происходит из независимо культивируемой популяции стволовых клеток, обеспечивает прямой экспериментальный доступ к каждому эмбриональному компартменту. Эти свойства делают систему особенно подходящей для применения мультипараметрического скрининга. Поскольку он даёт большие когорты морфологически согласованных структур с точно пропорциональными линиями TE, EPI и PE, он позволяет проводить параллельные возмущения и количественную оценку специфических для родословных ответов с статистической силой, недостижимой при использовании естественных эмбрионов.

В качестве доказательства принципа были измерены влияние общих факторов окружающей среды, проявленных в физиологических ^{диапазонах 32}^, ³³, ^{34, 35}^, ³⁶^, ³⁷^{, 38} на развитие бластоидов. Влияние изменений кофеина, никотина, этанола и аминокислот на частоту кавитации, морфологию, фитнес и пропорции родословной оценивалось в различных концентрациях и временных окнах лечения. Большинство состояний (кофеин, этанол, никотин и тех, кто имитирует низкобелковые диеты) приводили к аномальному образованию бластоидов и ухудшению структурного качества. В отличие от этого, увеличение концентрации разветвленных аминокислот (аналогично диетам с высоким содержанием белка) улучшило эффективность и качество образования бластоидов. Эти результаты отражают эффекты, наблюдаемые в натуральных бластоцистах мышей in vitro ³, демонстрируя, что эта система фиксирует тонкие, зависящие от дозы фенотипы и поддерживает масштабируемые, многомерные скрининговые линии, невозможные для естественных эмбрионов.

В более широком контексте моделирования эмбрионов эта техника демонстрирует, что те же клетки, используемые для моделирования интегрированного постимплантационного развития, могут использоваться и в доимплантационных моделях. Этот метод особенно подходит для приложений, требующих масштабируемого моделирования бластоцистоподобных структур с точным формированием ПЭ и надёжной интеграцией линии. Однако, как и в других моделях бластоцисты мышей на основе стволовых клеток, iGATA4-бластоиды не имплантируются и не развиваются дальше после переноса мыши-хозяину, поэтому не подходят для изучения взаимодействия эмбрионов и матери. В целом, этот протокол обеспечивает надёжный и доступный подход к получению высокоточных бластоидов, моделирующих ранние решения по типу клеток в эмбрионе млекопитающих.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, описанные в этом протоколе, включают установленные клеточные линии и выполнялись в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности Калифорнийского технологического института. Исследования с живыми животными или людьми не проводились.

Были протестированы различные линии ESC и TSC, которые поддерживают образование iGATA4-бластоидов. ESC, iGATA4-ESC и TSC из^{предыдущих исследований 28} успешно использовались для выполнения всех этапов, описанных в этом протоколе. Те же авторы описывают генерацию iGATA4-ESC из ранее установленной линии мышей ESC CD1 (ICR).

TSC культивируются поверх коммерчески доступных эмбриональных фибробластов мышей (MEF). Все химикаты, реагенты, комплекты, оборудование и программное обеспечение, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Культивирование стволовых клеток мышей для образования бластоида

Подготовка подающих пластин MEF
1. Покрытие 6-колодцевой клеточной культивной пластины 1,5 мл желатина 0,2% (w/v) в деионизированной (DI) воде на каждую скважину. Инкубировать при 37 °C в нормоксии не менее 45 минут.
2. Во время инкубации подготовьте центрифугную трубку объемом 15 мл с 4 мл FC-среды (Таблица 1), предварительно нагретой до 37 °C.
3. Разморозьте флакон MEF в водяной бане с помощью движения восьмёрки, пока не останется лишь небольшой шар льда. Переложите содержимое в подготовленную трубку, затем пипеткой вверх и вниз, чтобы тщательно перемешивать. Центрифугу при 500 × г в течение 4 минут.
4. Аспирируйте супернатант и ресуспензируйте гранулу в 1 мл FC-среды. Отрегулировать до достаточного объёма для покрытия ~160 000 элементов на скважину при 1,5 мл на скважину.
5. Аспирируйте желатин и пластину 1,5 мл MEF на каждую скважину. Инкубировать в нормоксии ночью без беспокойства.
6. На следующий день замените среду на свежую 1,5 мл на скважину FC-среду. Меняйте среду каждые 48 часов. Используйте MEF через 2–7 дней после нанесения пластины. MEF могут оставаться здоровыми дольше, но их способность поддерживать рост TSC может быть нарушена.

ВНИМАНИЕ: Проведите все выращивания клеток мышей в ламинарных шкафах с уровнем биобезопасности (BSL) 1 с использованием техники BSL-2.

Размораживание и проход эмбриональных стволовых клеток мышей (WT ESC и iGATA4-ESC)
1. Оттаивание WT ESC или iGATA4-ESC по шагам 1.1.1–1.1.3. После центрифугирования заново суспензировать клетки в 1 мл среды N2B27/2i/LIF (Таблица 1) и засеять ~50 000 ячеек на одну скважину в шести-колодцевую пластину с желатиновым покрытием с ~1,5 мл на колодцу. Инкубировать при 37 °C в нормоксии и менять среду каждые 48 часов.
2. Убедитесь, что колонии плотно уплотнены и круглые, с минимальными выступами перед выходом. Проход каждые 2–3 дня.
  ПРИМЕЧАНИЕ: WT ESC и iGATA4-ESC морфологически неразличимы до индукции доксициклином (DOX).
3. Покрыть пластину с 6 колодцями 1,5 мл желатина 0,2% в воде DI на каждую скважину. Инкубировать при 37 °C не менее 45 минут.
4. Добавьте 500 мкл реагента для диссоциации клеток на каждую скважину и инкубировать в течение 3 минут. Добавьте 2 мл FC-среды, аккуратно пипетируя по краям. Подтвердите >90% отслоение под микроскопом. Если клетки остаются прикрепленными, аккуратно пипетуйте для облегчения подвески.
5. Перенесите суспензию ячейки в центрифугную трубку на 15 мл и центрифугуйте при давлении 500 × г на 4 минуты.
6. Аспирируйте супернатант и повторно суспензируйте гранулу в 1 мл среды N2B27/2i/LIF. Определите концентрацию клеток с помощью 10 мкл на гемоцитометре. Отрегулировать объём на семя ~50 000 ячеек на колодцу.
7. Аспирировать желатин и засеять клетки. Инкубация в нормоксии. Меняйте среду на следующий день и каждые 48 часов после этого.
Размораживание и проход стволовых клеток трофобластов мышей (ТСК)
1. Отморозка ТСК следуя шагам 1.1.1–1.1.3. После центрифугирования вновь суспензировать клетки в 1 мл среды TSF4H (см. таблица 1) и засеять ~20 000 клеток на каждую скважину в пластину с 6 лунками с покрытием MEF. Инкубировать при 37 °C, 5% CO₂, 5% O₂ (гипоксия) и менять среду каждые 24 часа.
2. Убедитесь, что колонии крупные (диаметром >75 мкм) и сплющены перед уходом. Добавьте 500 мкл реагента для диссоциации клеток в каждую яме и инкубуйте в течение 5 минут. Добавьте 2 мл FC-среды с аккуратной пипетой. Подтвердите >90% отстранения.
3. Перенесите клетки в центрифугную трубку и вращайте их при давлении 500 × г в течение 4 минут.
4. Повторное суспензия в среднем TSF4H объемом 1 мл. Определите концентрацию и отрегулируйте до ~20 000 клеток на колодцу.
5. Нанесите пластины на MEF и инкубируем гипоксию. Меняйте среду каждые 24 часа и проходите каждые 2–3 дня перед слиянием колонии.

2. Формирование iGATA4-бластоидов

Подготовка агрегационной пластины Microwell для агрегации клеток
1. Добавьте 500 мкл раствора для промывания против прилипания в каждую ямку агрегационной пластины Microwell. Центрифугите при 2 000 × г в течение 5 минут с правильным балансированием для удаления задержанного воздуха из микроколодцев. Инкубировать при 37 °C в нормоксии не менее 1 часа или на ночь.
Подготовка бластоида, день 0 — подготовка и покрытие WT и iGATA4-ESC
1. Предварительное разогретие среды N2B27/2i/LIF, FC и FCYL (FC + 10 нг/мл рекомбинантного LIF (mLIF) + ингибитора ROCK с 2 мкм Y27632) до 37 °C. Подготовьте 0,2% желатина в DI-воде и подготовьте реагент для диссоциации клеток.
2. Аспирируйте раствор против прилипания, не касаясь дна скважины. Промывайте дважды с 1 мл PBS и один раз средним раствором FCYL. Пипеты вдоль стены, чтобы не повредить микроколодцы.
3. Подготовьте 6-ядровую пластину, покрытую желатином (инкубация ≥45 мин) для пассивных клеток.
4. Собирать WT и iGATA4-ESC с помощью аспирационной среды и добавлять реагент для диссоциации клеток 500 мкл на каждую скважину. Инкубировать 3 минуты при 37 °C. Добавьте 2 мл FC средней жидкости и аккуратно пипеткой. Подтвердите полное отслоение под микроскопом. Перенесите в трубку на 15 мл и центрифугу при 500 × г на 4 минуты.
5. Повторная суспензия в среде 1 мл FCYL. Определите концентрацию клеток с помощью 10 мкл на гемоцитометре. Скорректируйте до 500 000–700 000 клеток/мл. Рассчитайте объём, необходимый для 5 WT ESC и 5 iGATA4-ESC на микроскважину (6 000 ячеек на скважину).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте для других ESC-линий, если нужно. Начальный диапазон составляет 4–7 ESC на микроскважину с соотношением ESC к iGATA4-ESC.
6. Подготовьте 500 мкл суспензии в каждой яме. Добавьте по капли на агрегационную пластину Microwell с помощью пипетки объёмом 1000 мкл. Центрифугуйте при 100 × г в течение 3 минут и проверьте равномерное распределение. Инкубировать 6 часов, пока не сформируются агрегаты.
7. Оставшиеся ESC проходят, как описано в разделе 1.2.
Подготовка бластоидов, день 0 — Подготовка TX-среды
1. Подготовьте базальную субстрат с объёмом ~20 мл TX с использованием DMEM/F12 (Таблица 2). Готовьте свежими для каждого эксперимента.
  1. Добавьте 200 мкл 200 мМ L-аланил-L-глутамина (последние 2 мм). Храните запасы при 4 °C.
  2. Добавьте по 200 мкл 10 000 Ед/мл пенициллина/стрептомицина (в итоге по 100 Ед/мл каждому). Храните при −20 °C.
  3. Добавьте 40 мкл 32 мг/мл л-аскорбиновой кислоты (в итоге 64 мкг/мл). Приготовьте в DI-воде, фильтруйте, стерилизуйте и храните при −20 °C.
  4. Добавьте 20 мкл селенита натрия (в итоге 14 нг/мл). Приготовьте и храните при −20 °C.
  5. Добавьте 240 мкл NaHCO₃ (итоговое 543 мкг/мл). Тщательно перемешайте после размораживания.
  6. Добавьте 20 мкл голографического трансферрина (итоговое 10,7 мкг/мл). Смешивайте после размораживания.
  7. Добавьте ~37,5 мкл инсулина (итоговое 19,4 мкг/мл; зависит от партии). Храните при 4 °C.
2. Непосредственно перед применением добавьте Y27632 к итоговой концентрации 20 мкм, CHIR99021–3 мкм, IL-11–30 нг/мл, FGF4–25 нг/мл, гепарина до 1 мкг/мл, mLIF до 10 нг/мл, TGFβ до 15 нг/мл и 8Br-cAMP до 25 мкм.
Подготовка бластоидов, день 0 — подготовка и покрытие ТСК
1. Предварительные носители TSF4H, FC (Таблица 1) и TX (Раздел 2.3). Подготовьте пластины с желатином (≥45 мин) для истощения MEF.
2. Собирайте ТСК, добавляя реагент для диссоциации клеток по 500 мкл в каждую скважину и инкубируя 5 минут в гипоксии. Добавьте 2 мл FC средней жидкости и аккуратно пипеткой. Подтвердите отделение. Перенесите в трубку и центрифугу при 500 × г на 4 минуты.
  ПРИМЕЧАНИЕ: ТСК, высеянные > 4 дня, могут потребовать обработки реагентами для диссоциации клеток до 10 минут.
3. Суспензируйте в среде TSF4H 1 мл и отрегулируйте соотношение 1:2 под соотношение 1:2.
4. Пластины на колодцы, покрытые желатином, для истощения MEF. Инкубация в течение ~45 минут при гипоксии. Убедитесь, что MEF присоединяются, при этом TSC остаются в основном свободными.
5. Замените среду 900 мкл из агрегационных пластин Microwell на 500 мкл TX среды. Вернёмся к гипоксии.
6. Перенесите супернатант, содержащий TSC, в трубку без нарушения прикреплённых MEF. Определите концентрацию (целевой диапазон 500 000–700 000 клеток/мл).
7. Рассчитайте объём для 12 ТСК на микроскважину (14 400 ячеек на скважину). Центрифуга, если требуется дополнительная концентрация.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте для других линий TSC (рекомендуется 10–15 клеток на микроскважину).
8. Добавьте 500 мкл суспензии на каждую скважину с перепадом. Центрифугу при 100 × г в течение 3 минут. Подтвердить распределение и инкубировать гипоксию в течение 24 часов.
9. Оставшиеся ТСК по мере необходимости (раздел 1.3).
Подготовка к бластоиду, день 1 — индукция
1. Примерно через 24 часа после добавления TSC добавьте 20 мкл 5 мМ 8Br-cAMP и 1 мкл 1 мкг/мл DOX на одну скважину. Инкубировать 48–72 часа при гипоксии.
Подготовка к бластоиду, день 3 — фиксация
1. Повторная суспензия заполнителей с помощью вырезанного наконечника пипетки объёмом 1000 мкл. Перенесите в трубки объёмом 2 мл и дайте осадочиться в течение 5 минут.
2. Удалите супернатант и добавьте 250 мкл 4% параформальдегида (PFA). Аккуратно подвесьте снова.
  ВНИМАНИЕ: Работайте с PFA в вытяжной коробке с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
3. Инкубировать 15 минут, щелкая каждые 5 минут.
4. Удалите PFA и добавьте 300 мкл PBST (PBS + 0,1% Tween-20). Аккуратно перемешивайте. Храните при 4 °C в течение <1 недели перед нанесением морилки.
Иммунофлуоресценция бластоидов
1. Перенесите 150 мкл на образец на пластину с U-образным дном на 96 лунок.
2. Добавьте буфер проницаемости 100 мкл и инкубировать 20 минут. Замените раствором первичных антител и инкубируем за ночь при 4 °C.
3. Стирайте 3× с PBST (по 5 минут каждая). Добавьте вторичные антитела.
4. Инкубировать 2 часа при комнатной температуре в темноте.
5. Промой 3× и переложи в образовую чашу.
6. Изображение с использованием конфокальной микроскопии (≥25× объектив, NA ≥0.8).

3. Высокопроизводительные экраны с использованием модели iGATA4-бластоида

Подготовка и тестирование iGATA4-бластоидов с учётом факторов окружающей среды
1. Подготовьте агрегационную пластину Microwell как описано в разделе 2.1 и генерируйте iGATA4-бластоиды в соответствии с разделами 2.2–2.4. Подготовьте достаточное количество скважин, включая соответствующие контрольные механизмы. Включите элемент блока (бластоиды, подготовленные по стандартному протоколу), контроль носителя и одно или несколько экспериментальных условий.
2. Инкубировать бластоиды на ночь при гипоксии. Примерно через 24 часа после посева TSC приготовьте TX-среду с добавлением 8Br-cAMP, доксициклина (DOX) и интересующего соединения (или контроля носителя). Были протестированы следующие состояния:
  1. Кофеин: 3,5 мг/л, разбавленный из сверхчистой воды.
  2. Никотин: 330 нг/л, разбавленный из запасов 100% этанола (EtOH).
  3. Этанол: 17 мМ, разбавленный абсолютным EtOH.
  4. Аминокислоты с высокой разветвлённой цепью (BCAA): +5%, +25%, +50% относительно базовых концентраций (0,45 мМ L-лейцин, 0,45 мМ L-валин, 0,42 мМ L-изолейцин), полученных из концентрированных запасов в сверхчистой воде.
  5. Низкий уровень метионина и лейцина: −5%, −25%, −50%, −100% относительно базовых концентраций (0,12 мМ L-метионин, 0,45 мМ L-лейцин), получено с использованием Met-/Leu-free DMEM/F12. Без Met-/Leu-DMEM (LM-DMEM) дополняется 1x Ham's F-12 Nutrient Mix перед использованием.
    ВНИМАНИЕ: Подготовьте и обрабатывайте концентрированные запасы кофеина и никотина в вытяжке с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ; перчатки, лабораторный халат, защита для глаз). Этанол горюче, и его необходимо держать подальше от источников тепла.
3. Аспирируйте среду из каждой ямы и добавьте 1 мл жидкости с соединением. Обрабатывайте по одной тщательно за раз, чтобы избежать высыхания. Верните пластину в инкубатор гипоксии и посейте до третьего дня.
4. Сделайте репрезентативные изображения ярких полей на третий день с помощью микроскопа с пропускаемым светом. Зафиксировать структуры и провести иммунофлуоресценцию, как описано в разделах 2.6 и 2.7.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Корректируйте окна обработки в зависимости от цели эксперимента. Лечение может применяться на ранних этапах агрегации (первый день) или более поздних стадиях (например, расширение полости). Примеры окон включают дни 1–3, дни 1–2 (затем замена носителей) и дни 2–3.
Мультипараметрический анализ бластоида iGATA4
1. Используйте изображения ярких полей, чтобы количественно определить процент скважин с кавитированными структурами (то есть структуры с чётко очерченной центральной полостью) и измерить диаметр бластоида.
  1. Открывайте изображения в программном обеспечении для анализа изображений.
  2. Используйте инструмент прямой линии, чтобы провести линию через каждую структуру.
  3. Измеряйте диаметр с помощью Analyze > Measure.
2. Выберите репрезентативные образцы с иммунокрашенными окрашением (20–40 структур на биологическую реплику, с минимум тремя биологическими репликами на каждое состояние) и снимите, как описано в разделе 2.7.
3. Количественно определить общее количество клеток и состав линии с помощью иммунофлуоресцентных маркеров: TE (CDX2-положительный), EPI (SOX2-положительный и SOX17-отрицательный) и PE (SOX17-положительный).
4. Оцените структурную организацию и морфологию, определив, являются ли ПЭ-клетки пространственно отделены от клеток EPI внутри внутренней клеточной массы (ICM) (бинарная классификация: да/нет).
5. Классифицировать морфологию как хорошую (прозрачная структура, похожая на бластоцисту, с определённой полостью и правильно организованными компартментами ТЭ, ЭПИ и ПЭ), посредственную (незначительные аномалии, такие как неправильная форма или частично сформированная полость) или плохую (серьёзные аномалии, такие как отсутствие полости или неорганизованные/неотсортированные линии).
6. Количественно определить дополнительные параметры, включая размер или объём резонатора, где это применимо. Используйте биоинформатические инструменты или другие инструменты для построения графиков и статистического анализа, а также программное обеспечение для анализа 3D-изображений для подсчёта клеток и/или подготовки изображений для отображения.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поддержание ESC и iGATA4-ESC (нормоксия) и TSC (гипоксия) в соответствующих условиях культуры крайне важно для успешного генерации бластоидов. При выращивании в описании ESC и iGATA4-ESC должны быть практически неотличимыми, образуя средние, круглые и хорошо очерченные колонии через 3 дня. Появление уплощённых колоний или выступающих краёв указывает на зарождающуюся дифференциацию, и такие культуры не следует использовать для формирования бластоидов. ТСК должны образовывать плоские эпителиальные колонии с немного приподнятыми краями и более плоскими центрами. Переросшие или слияние колоний ТСК (обычно после >3 дней в культуре) часто приводят к плохим результатам бластоида (рисунок 1).

При сборке iGATA4-бластоида несколько ранних признаков указывают на успех протокола (рисунок 2A, B). Примерно через 6 часов после агрегации ESC и iGATA4-ESC на дне микроскважин должны быть видны плотные ячеточные агрегаты. Рыхлые агрегаты свидетельствуют о чрезмерном воздействии реагентов для диссоциации клеток, что снижает адгезию между клетками. Переход к следующему этапу (добавление TSC; Раздел 2.4) должен возникать только после наблюдения плотных агрегатов (рисунок 2B, временная точка D0.5). Иммунокрашивание на этом этапе должно демонстрировать однородные агрегаты SOX2⁺ и GATA4⁻ (рисунок 2B, временная точка D0.5).

После добавления ТСК и ночной инкубации должен быть видим единый когезивный агрегат, окружённый клетками CDX2⁺ (рисунок 2B). Наличие крупных, неагрегированных ячеек на поверхности заполнителей часто указывает на остаточные MEF. Загрязнение MEF может снижать эффективность образования бластоидов; поэтому адекватное истощение MEF критически важно для получения преимущественно популяции TSC до агрегирования. Для удаления остатков MEF может использоваться фильтр с ячейками 40 мкм, хотя это может снизить выход TSC. Неполное или чрезмерное покрытие CDX2⁺ можно исправить, скорректируя количество добавленных TSC на микроскважину (рекомендуемый диапазон: 10–15).

После добавления DOX и 8Br-cAMP кариес обычно наблюдается ко второму дню и может сохраняться до третьего дня. При яркой микроскопии полости выглядят как прозрачные, пустые пространства внутри бластоидов (рисунок 2B, C; белая пунктирная линия). Клетки GATA4⁺ появляются вскоре после индукции DOX и постепенно сортируются на поверхность ICM-подобного компартмента (рисунок 2B). Успешное образование бластоида характеризуется высокой эффективностью кавитации (обычно ~80% конструкций на одну агрегационную пластину микроскважин; Рисунок 2D), однослойный наружный эпителий, подобный CDX2⁺ TE, полость, напоминающая бластокоэль, и округлый отсек, похожий на ICM, содержащий клетки, похожие на SOX2⁺ EPI, наложенные клетками, похожими на GATA4⁺ PE (рисунок 2C–E).

Распространённые субоптимальные исходы включают некавитированные структуры, неправильно сформированные бластоиды с несколькими полостями или похожими на ICM-компартменты и колодцы с небольшим количеством структур или клеточных обломков. Хотя ожидается примерно 20% аномальных структур (рисунок 2C), более высокие показатели могут указывать на такие проблемы, как неправильная подготовка ТХ-среды, плохое качество стартовой клетки, отсутствие добавления DOX или 8Br-cAMP в первый день или смещение структур во время изменений среды.

Для применений с высокой пропускной способностью фильтрации необработанные и управляемые скважины должны давать бластоиды, сопоставимые с положительным контролем (рисунок 3A,B). Экспериментальные методы обработки могут влиять на несколько показателей качества, включая размер бластоида (рисунок 3C), эффективность кавитации, общее количество и линейно специфическое количество клеток (рисунок 3D), сортировку ПЭ и общую морфологию (рисунок 3E). Например, обработка кофеином, никотином или этанолом во время образования бластоида приводила к уменьшению структур с низкой эффективностью кавитации, снижению общего количества клеток или ICM, ухудшению сортировки ПЭ и ухудшению морфологии. В отличие от них, увеличение концентрации ветвлённых аминокислот приводило к образованию более крупных, высококавитированных бластоидов с увеличенным количеством клеток и улучшенной морфологией (рисунок 3C–E). Биологическая вариабельность между экспериментами ожидается, что подчёркивает важность включения как бланков, так и контролей носителей в каждый эксперимент.

figure-results-1
Рисунок 1: Примеры хороших и низкокачественных WT ESC, iGATA4-ESC и TSC. Brightfield микрофотографии WT ESC, iGATA4-ESC и TSC, показывающих ожидаемую морфологию колоний после 2–3 дней культуры в среде N2B27/2i/LIF (ESC) или TSF4H (TSC). Панель под названием «WT ESC – плохое качество» показывает клетки с неоптимальной морфологией, включая уплощённые колонии с выступающими краями (красные стрелки). Панель «TSC overgrown» показывает объединённые и расширенные колонии TSC после 4 дней культуры. Шкала масштаба: 100 мкм для всех панелей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Схематическая и ожидаемая морфология iGATA4-бластоидов. Перепечатано из Developmental Cell, том 61, Jorgensen V, Bao M, Junyent S и др., Эффективные модели эмбрионов мышей, полученных на основе стволовых клеток, для экологических исследований, стр. 193–207.e6, Copyright (2025)³, с разрешения Elsevier. (A) Схематическое представление естественного образования бластоцисты у мышей (верх) и моделирования бластоцист, основанных на стволовых клетках, с использованием WT ESC, iGATA4-ESC и TSC.
(B) Микрофотографии, показывающие ожидаемую морфологию и экспрессию маркеров на разных стадиях протокола. Проекция максимальной интенсивности (MIP); пунктирные линии очерчивают полость. Шкала масштаба: 20 мкм. (C) Яркое изображение iGATA4-бластоидов на третий день. Шкала: 100 мкм.
(D) кавитации iGATA4-бластоидов с использованием ТСК, предварительно культивируемых в нормоксии или гипоксии; Агрегаты культивировались в условиях гипоксии. n ≥ 4; Полоски ошибки представляют собой стандартную ошибку среднего. (E) Иммунное окрашивание бластоцистов E4.5 и бластоидов 3-го дня iGATA4-бластоидов для маркеров линии (CDX2, циан; OCT4 — красный; GATA4, зелёный). Проекция максимальной интенсивности (MIP); одна Z-плоскость показана там, где указано. Шкала шкалы: 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигурки.

figure-results-3
Рисунок 3. Влияние факторов окружающей среды на образование и качество бластоидов. (A) Репрезентативные иммунофлуоресцентные 3D-изображения (вверху) и реконструкции поверхности IMARIS (внизу) iGATA4-бластоидов с использованием факторов окружающей среды (кофеин, никотин, этанол и условия, имитирующие диеты с высоким и низким содержанием белка). Шкалы: 25 мкм для всех изображений. (B) Схема экспериментального рабочего процесса. (C) Диаметр бластоида при различных условиях обработки. Диапазон отражает 10–90-й процентилы; рамки указывают межквартильный диапазон; Линия указывает медиану. Статистический анализ проводился с использованием одностороннего ANOVA с множественными сравнениями. (D) Количественное определение общего числа клеток (серый), трофектодермы (циан), эпифобласт (красный) и примитивного эндодерма (зелёный) клеток в контролируемых и обработанных бластоидах. Полосы символизируют среднее значение; Полоски ошибок представляют стандартное отклонение. Статистический анализ проводился с использованием одностороннего ANOVA с множественными сравнениями. (E) Количественная оценка доли бластоидов, классифицированных как «хорошие» (правильная сортировка по линии с минимальными морфологическими отклонениями), «посредственные» (в основном правильная морфология с незначительными отклонениями, включая неполное сортирование EPI–PE) или «плохие» (сильно аномальная морфология с нарушенной организацией линии) при контроле и лечебных условиях. Статистический анализ проводился с использованием двустороннего ANOVA относительно условий контроля. Для всех панелей — n ≥ 3. Статистическая значимость указывается как *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

СМИ	Реагент	Итоговая концентрация
ФК
	DMEM	Н.А.
	FBS, инактивируемый теплом (iFBS)	15%
	GlutaMax	2 мМ
	2-меркаптоэтанол (2-ME)	0,1 мМ
	Незаменительные аминокислоты (NEAA)	1 раз
	На Пирувате	1 раз
	Пенициллин–Стрептомицин	1 раз
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	NeurobasalA	50%
	Дополнение B27	1 раз
	Дополнение N2	0,5x
	2-ME	100 мкм
	Пенициллин–Стрептомицин	1%
	GlutaMax	2 мМ
	PD0325901	1 мкм
	CHIR99021	3 мкм
	Мышиный рекомбинантный LIF	10 нг/мл
TSF4H
	Среда Megacell RPMI-1640	Н.А.
	iFBS	20%
	GlutaMax	2 мМ
	На Пирувате	1 раз
	Пенициллин–Стрептомицин	1 раз
	FGF4	25 нг/мл
	Гепарин	1 мкг/мл

Таблица 1: Медиа-рецепты для FC, N2B27/2i/LIF и TSF4H. Рецепты для приготовления сред FC, сред N2B27/2i/LIF и среды TSF4H с окончательными концентрациями.

Компонент	Итоговая концентрация	Концентрация запасов	Растворитель и хранение	Объём до ~20 мл
8Br-cAMP	25 мкм	5 мМ	PBS, храните при -20 °C	100 мкл
CHIR99021	3 мкм	10 мМ	DMSO, храните при -20 °C	6 мкл
DMEM/F12	Н/Д	Н/Д	Храните при 4 °C	20 мл
FGF4	25 нг/мл	100 мкг/мл	0,1% BSA в PBS, хранение при -20 °C	5 мкл
Добавка L-аланил-L-глутамин	2 мМ	200 мМ	Храните при 4 °C	200 мкл
Гепарин	1 мкг/мл	1 мг/мл	PBS, храните при -20 °C	20 мкл
Голотрансферрин	10,7 мкг/мл	10,7 мг/мл	DI-воду, хранить при -20 °C	20 мкл
Человеческий TGF-β1	15 нг/мл	20 мкг/мл	4 мМ HCl + 0,1% BSA, хранить при -20 °C	15 мкл
IL-11	30 нг/мл	25 мкг/мл	0,1% BSA в PBS, хранение при -20 °C	24 мкл
Инсулин	19,4 мкг/мл	9,5 - 11,5 мг/мл	Концентрация зависит от партий, храните при 4 °C	33,7–40,8 мкл, регулируйте объём в зависимости от содержания запаса.
L-аскорбиновая кислота-2-фосфат магний	64 мкг/мл	32 мг/мл	DI-воду, хранить при -20 °C	40 мкл
Мышиный рекомбинантный LIF	10 нг/мл	10 мкг/мл	PBS + 0,1% BSA, храните при -20 °C	20 мкл
NaHCO₃	543 мкг/мл	45,25 мг/мл	DI-воду, хранить при -20 °C	240 мкл
Пенициллин/стрептомицин	1 раз	100x	Храните при -20 °C	200 мкл
Селенит натрия	14 нг/мл	14 мкг/мл	DI-воду, хранить при -20 °C	20 мкл
Y27632	20 мкм	20 мМ	DMSO, храните при -20 °C	20 мкл

Таблица 2: Рецепт медиа для TX. Рецепт для приготовления TX-среды с подробностями о том, как подготовить и хранить малые молекулы и другие реагенты, а также конечные концентрации.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iGATA4-бластоиды обеспечивают высокоэффективную, похожую на эмбрион, стволовую клетку модель бластоцисты мышей, самоорганизуя три типа клеток, культивируемых in vitro: ESC, индуцируемые GATA4-ESC (iGATA4-ESC) и гипоксиально-культивируемые TSC. Эти структуры повторяют ключевые особенности бластоцисты E4.5, включая соответствующие пропорции родословной и транскрипционную идентичность, и могут использоваться для мультипараметрического скрининга окружающей среды, надёжно отражая дефекты развития на стадии^{бластоцисты 3}. Недавнее исследование дополнительно демонстрирует, что агрегация ESC, iGATA4-ESC и TSC в базальных бластоидных средах также обеспечивает высокоэффективное образование бластоидов, что подчёркивает устойчивость и адаптивность этого подхода в лабораториях и условиях^{культуры 39}. Ранее было показано, что iGATA4-ESC воспроизводят функции VE-клеток в моделях эмбрионов на основе стволовых клеток^{после имплантации} 28,29,30,31. Вместе эти результаты иллюструют, как iGATA4-ESC могут служить гибкими и надёжными заменителями клеток PE/VE в моделировании эмбрионов на основе стволовых клеток на разных этапах развития.

Несколько этапов протокола критически важны для получения высококачественных бластоидов. К ним относятся качество исходных популяций клеток, особенно ТСК, культивируемых гипоксией (рисунок 1); приготовление TX среды, которая должна быть свежеприготовлена на 0-й день (Таблица 2; раздел 2.3); и аккуратное обращение с пластинами после агрегирования. Ключевые показатели успеха протокола включают эффективность кавитации (обычно ~80%), соответствующую морфологию (структуры диаметром ~100 мкм с полостью, похожей на бластокоэль, внешний слой CDX2⁺ TE, а также отсортированная масса внутренней ячейки SOX2⁺ и GATA4⁺ с приблизительным соотношением TE:1 EPI:1 PE) и наличие правильно отсортированного слоя, похожего на GATA4⁺ PE. Это метрики, которые часто используются в области ^1,2,4,5. Среди кавитированных бластоидов примерно 75% конструкций обладают всеми этими признаками. Эти метрики могут служить начальными индикаторами для устранения неполадок. Неоптимальное качество клеток обычно отражается в аномальной морфологии колонии, что приводит к плохо агрегированным или некавитированным структурам. Неправильная подготовка среды может привести к неполной агрегации или дефектам линии, тогда как грубое обращение может привести к появлению нескольких заполнителей на одну микроскважину или пустые скважины.

Дальнейшая оптимизация может включать корректировку количества засеянных ячеек (рекомендуемые начальные диапазоны: 4–7 ESC и iGATA4-ESC, и 10–15 TSC на микроскважину), уточнение методов истощения MEF (например, фильтрация через сито 40 мкм ячейки) и изменение состава TX-среды. Например, удаление FGF4 и гепарина всё ещё может поддерживать эффективное образование бластоидов, одновременно продвигая более муральную идентичность, похожую на TE. iGATA4-бластоиды могут поддерживаться в культуре до 6 дней; однако структуры с 4–6 дней часто увеличиваются в размерах, сохраняя бластоцистовидные пропорции линии. Протокол даёт единообразные результаты для всех биологических репликат, но в каждом эксперименте следует включать соответствующие методы контроля.

По сравнению с другими бластоидными системами мышей, которые варьируются по стартовым популяциям клеток и условиям^{культуры} 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 , iGATA4-бластоиды обеспечивают как высокую эффективность формирования, так и точное представление родословной. Хотя многие существующие протоколы создают кавитированные структуры и ценны для специфических биологических применений, они часто демонстрируют неполное формирование ПЭ, гетерогенные или неопределённые клеточные идентичности или неправильные пропорции родословных. Объединяя три популяции, направленные по линии стволовых клеток, поэтапно, iGATA4-бластоиды преодолевают эти ограничения и обеспечивают воспроизводимую, модульную и экспериментально доступную систему.

Несмотря на эти преимущества, остаются некоторые ограничения. Продлевая культура in vitro в TX среде более 4–6 дней приводит к избыточному росту, даже если пропорции линии остаются бластоцистой. Около 12,5% iGATA4-бластоидов переходят на периимплантационные морфологии in vitro, характеризующиеся чашевидным, псевдостратифицированным эпибластом, окружающим проамниотическую полость, расширенным экстраэмбриональным эктодерм-подобным компартментом, прилегающим к проксимальному эпибласту, и наружным висцеральным эндодермическим слоем. Однако iGATA4-бластоиды не имплантируются и не развиваются дальше после переноса в мышь-хозяина. Поэтому iGATA4-бластоиды, а также бластоиды в более широком смысле, не подходят для изучения имплантации или взаимодействия между эмбрионом и матерью.

Молекулярная причина неспособности бластоидов имплантироваться остаётся неясной, хотя современные данные свидетельствуют о том, что неполное моделирование трофэктодермы может быть одним из факторов. TE-подобные клетки в iGATA4-бластоидах демонстрируют чрезмерно полярную молекулярную идентичность. Будущие усилия по созданию ТСК, более похожих на муральные ТЭ-клетки, или по внедрению альтернативных клеточных линий, которые лучше воспроизводят имплантационно-способные ТЭ, представляют собой перспективные направления для преодоления этих ограничений. Модульная природа iGATA4-бластоидов, в которых специфические для TE модификации могут реализоваться независимо от образования EPI и PE, делает эту систему особенно подходящей для подобных разработок.

В совокупности протокол iGATA4-бластоида предоставляет надёжную и масштабируемую платформу для изучения спецификации линии и ранних процессов развития эмбриона млекопитающих. Её воспроизводимость и адаптивность делают его отлично подходящим для высокопроизводительных приложений в экологических, фармакологических и генетических скринингах. Таким образом, iGATA4-бластоиды представляют собой мощную систему для изучения ранних механизмов развития и оценки того, как разнообразные возмущения влияют на развитие до имплантации.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Кристофа Хэфельфингера, Викторию Йоргенсен, Мин Бао, Леню Флютш и сотрудников лаборатории Зерницка-Гетца за их помощь в разработке и совершенствовании iGATA4-бластоидов. Эта работа была поддержана премией Pioneer от директора Национального института здравоохранения (5DP1HD104575-04 до M.Z.-G), премией Open Philanthropy (M.Z.-G), программой науки Human Frontiers (LT-0022/2022 для S.J.), NSFC (82301873 до M.B.), Министерством науки и технологий Китая (2024YFA1107002 до M.B.), Швейцарским фондом исследований (C.M.H.), Фонд Веренфельса Свободного академического общества (Freie Akademische Gesellschaft) Базель (C.M.H.), а также Фонд Клодин и Ханса-Хайнера Цеслин-Бустани (C.M.H.).

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	Используется для общей подготовки сред
8-Bromo-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	Используется для подготовки среды TX и бластоидов
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	Микроблюдце агрегации; Используется для подготовки бластоидов
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Используется для подготовки бластоидов
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	Широкие пипетки для перемещения бластоидов во время иммуногистохимии
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Используется для подготовки сред
Caffeine	Sigma	58-08-2	Используется как средовая фактор для тестирования в iGATA4-бластоидах
CDX2 antibody, mouse	Biogenex	MU392A5UC	Для иммунофлюоресценции, используется в разбавлении 1:200
CellXpert (normoxia incubator)	Eppendorf	6731010015	Другие бренды/модели также могут работать
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	Используется для подготовки сред
Countess Cell Counting Chamber slides	Invitrogen	C10228	Используется для общих целей культуры тканей
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	Используется для иммунофлюоресценции, используется в разбавлении 1:500-1:1,000
DMEM	Gibco	11995040	Используется для подготовки среды FC
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	Используется для подготовки сред N2B27 и TX
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	Добавьте DMEM-LM с порошком питательной смеси Ham's F-12 до конечной концентрации 1х для получения DMEM/F12 без метионина и лейцина
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	Используется для иммунофлюоресценции, используется в разбавлении 1:500-1:1,000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 647	Invitrogen	A-31571	Используется для иммунофлюоресценции, используется в разбавлении 1:500-1:1,000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568	Invitrogen	A10042	Используется для иммунофлюоресценции, используется в разбавлении 1:500-1:1,000
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	Используется для иммунофлюоресценции, используется в разбавлении 1:500-1:1,000
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Используется для иммунофлюоресценции. Разморозить при 4°C; и хранить аликотированным при -20°C;
Doxycycline	Sigma	D9891-5G	Для индукции iGATA4 во время подготовки бластоидов
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf	5702	Используется в нашей лаборатории, другие также могут работать. Требуется адаптеры для пробирок и пластин
Falcon 96-well Clear Round Bottom Not Treated Microplate, with Lid, Individually Wrapped	Corning	351177	Используется для иммунофлюоресценции
FGF4	R&D Systems	5846-F4	Используется для подготовки сред
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	Используется для анализа изображений
GATA4 antibody, rabbit	Cell Signalling	36966S	Используется для иммунофлюоресценции, используется в разбавлении 1:500
Gelatin solution, 2%	Sigma	G1393	Используется для общих целей культуры тканей
Glass Bottom Dish 35 mm	Ibidi	81218-200	Для иммунофлюоресценции и визуализации
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Добавка L-аланил-L-глутамину; Используется для подготовки сред
Ham's F-12 Nutrient Mix powder	Thermo Fisher Scientific	21700075	Используется в качестве добавки к DMEM-LM для условий низкобелковой диеты
Heparin	Sigma	H3149	Используется для подготовки сред
Heracell VIOS 160i (hypoxia incubator)	Thermo Fisher Scientific	51030400	Другие бренды/модели также могут работать
Holo-transferrin	Sigma	T4132	Используется для подготовки среды TX
Human recombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	Используется для подготовки среды TX
IL-11	PeproTech	200-11	Используется для подготовки среды TX
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	Используется для анализа изображений и подготовки изображений
Inactivated Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Используется для подготовки сред
Inducible GATA4 ESCs (tetO-GATA4-ESCs)	Amadei et al., 2021	NA	Клеточная линия, доступная из лаборатории Зерника-Гец по запросу
Insulin	Sigma	I9278	И

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Создание эффективных моделей бластоцист, полученных на основе стволовых клеток, для экологических исследований

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles