Интегрированная сетевая фармакология, метаболомика и валидация в организме отвар Лянсюэ Дихуан у мышей с язвенным колитом, вызванным DSS

Краткое содержание

Этот протокол описывает воспроизводимый рабочий процесс, интегрирующий сетевую фармакологию, нецелевую метаболомику и валидацию in vivo для выяснения многокомпонентных механизмов отвара Лянсюэ Дихуан в мышиной модели язвенного колита, индуцированной сульфатом натрием.

Аннотация

Язвенный колит (ОК) — это хроническое воспалительное заболевание кишечника, характеризующееся устойчивым воспалением кишечника и нарушением метаболической регуляции. Формулы традиционной китайской медицины (ТКМ) широко применяются в клинической практике для лечения воспалительных заболеваний; Однако систематические экспериментальные подходы к разъяснению их многокомпонентных и многоцелевых механизмов остаются ограниченными. В этой статье представлен воспроизводимый экспериментальный протокол, интегрирующий сетевую фармакологию, нецелевую метаболомику и валидацию in vivo для изучения противовоспалительных эффектов отвара Лянсюэ Дихуан (LXDHD) в мышиной модели UC, индуцированной сульфатом натрия (DSS). Рабочий процесс включает приготовление травяного отвода, моделирование колита, вызванного DSS, оценку активности заболевания, гистопатологическую и гематологическую оценку, измерение цитокинов в сыворотке, метаболомное профилирование на основе LC–MS и анализ вычислительных сетей. С помощью этого интегрированного подхода был успешно установлен колит, вызванный ДСС, и лечение LXDHD привело к измеримым улучшениям индекса активности заболевания, длины толстой кишки, гистопатологических повреждений, уровня воспалительных цитокинов и метаболических профилей. Анализ сетевой фармакологии и метаболомики дополнительно показал, что этот протокол позволяет выявлять ключевые цели, пути и метаболиты, связанные с терапевтическим вмешательством. Этот визуализированный и стандартизированный рабочий процесс предоставляет практическую методологическую основу для изучения фармакологических механизмов многокомпонентных формул ТКМ при воспалительных заболеваниях кишечника и может быть адаптирован к другим травяным рецептам и моделям заболеваний.

Введение

Язвенный колит (UC) — это хроническое воспалительное заболевание кишечника, характеризующееся постоянным воспалением слизистой толстой^{кишки 1}, приводящим к таким симптомам, как боли в животе, диарея, прямое кровоизлияние и потеря^{веса 2}. Заболеваемость колитным колитом растёт по всему миру, что создаёт значительную нагрузку на системы здравоохранения и значительно ухудшает качество жизни^{пациентов 3.} Хотя этиология УК до сих пор не полностью изучена, накопленные данные свидетельствуют о том, что нарушение иммунных ответов, чрезмерное выработка воспалительных цитокинов, окислительный стресс и метаболические нарушения играют центральную роль в патогенезе заболеваний ^4,5.

Современные терапевтические стратегии при УК в основном включают аминосалицилы, кортикостероиды, иммуносупрессивные препараты и биологические препараты, направленные на воспалительные^{цитокины 6}. Хотя эти методы лечения могут облегчить симптомы и вызвать ремиссию, их длительное применение часто связано с побочными эффектами, высокими затратами и вариативными терапевтическими реакциями ^7,8,9. Кроме того, значительная часть пациентов не достигает устойчивой ремиссии, что подчёркивает необходимость альтернативных или комплементарных терапевтических подходов с повышенной безопасностью и многоцелевым эффективностью.

Традиционная китайская медицина (ТКМ) широко используется для лечения желудочно-кишечных заболеваний на протяжении веков и всё больше признаётся своей потенциальной пользой при сложных воспалительных заболеваниях, таких как^UC-10. В отличие от одноцелевых терапий, формулы ТКМ обычно оказывают терапевтический эффект через несколько компонентов, действующих на различные мишени и пути, что может лучше учитывать многофакторный характер^UC-11. Клинические и экспериментальные исследования показали, что некоторые рецепты на ТКМ могут модулировать иммунные ответы, подавлять воспаление, защищать целостность кишечного барьера и регулировать метаболический^{гомеостаз} 12,13,14,15.

Отвар Лянсюэ Дихуан (LXDHD) — это классическая формула ТКМ, традиционно используемая для «охлаждения крови и очищения тепла», клинически применяемая для лечения воспалительных и геморрагических заболеваний¹⁶. Рецепт состоит из множества трав, включая Scutellaria baicalensis, Phellodendron chinense, Rehmannia glutinosa, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Sanguisorba officinalis, Platycladus orientalis, Saposhnikovia divaricata, Citrus aurantium, Angelica sinensis и Glycyrrhiza uralensis. Современные фармакологические исследования показали, что некоторые составляющие травы и их активные соединения обладают противовоспалительными, антиоксидантными и иммуномодуляторными^{свойствами} 17,18,19. Однако общие терапевтические эффекты и лежащие в основе механизмы LXDHD при UC пока систематически не выяснены.

Сетевая фармакология стала эффективным подходом для изучения сложных взаимодействий между многокомпонентными травяными формулами и молекулярными мишенями, связанными с^{заболеваниями. 20}. Интегрируя информацию из нескольких баз данных, сетевая фармакология может предсказывать потенциальные активные соединения, терапевтические цели и сигнальные пути, обеспечивая системное понимание механизмов^{ТКМ 21}. Тем не менее, сетевая фармакология в основном опирается на прогнозы базы данных и не отражает напрямую метаболические изменения in vivo .

Метаболомика, как мощный инструмент для профилирования глобальных метаболических изменений, предлагает дополнительные знания о патофизиологии заболеваний и терапевтических^{ответах 22}. В UC метаболомные анализы выявили значительные нарушения метаболизма липидных и аминокислот, а также путей, связанных с окислительным^{стрессом} 23,24,25. Интеграция метаболомики с сетевой фармакологией может помочь преодолеть разрыв между предсказанными молекулярными мишенями и реальными метаболическими фенотипами, тем самым повышая надёжность механистических интерпретаций.

В настоящем исследовании была применена интегрированная стратегия, объединяющая сетевую фармакологию, нетаргетную метаболомику и экспериментальную валидацию для изучения противовоспалительных эффектов и возможных механизмов LXDHD в мышиной модели UC, индуцированной сульфатом натрия (DSS), (рисунок 1A). Этот общий методологический дизайн, интегрирующий in silico прогнозы с in vivo метаболомной и фенотипической валидацией, соответствует установленным строгим исследовательским^{рамкам 26}. Для выявления активных соединений, потенциальных терапевтических целей и сигнальных путей, обогащённых лечением LXDHD, использовался сетевой фармакологический анализ. Для характеристики метаболических изменений, вызванных УК, и их модуляции LXDHD проводились нецеленаправленные метаболомические процессы. Кроме того, ключевые результаты были подтверждены с помощью экспериментов in vivo , включая оценку активности заболевания, гистопатологических изменений, гематологических параметров и уровней воспалительных цитокинов.

Интегрируя вычислительные прогнозы, метаболическое профилирование и биологическую валидацию, это исследование направлено на всестороннее понимание многокомпонентных, многоцелевых и многопутных механизмов, лежащих в основе терапевтического эффекта LXDHD при UC. Эта работа не только предлагает экспериментальные доказательства в пользу использования LXDHD как потенциальной комплементарной терапии для UC, но и предоставляет методологическую основу для изучения механизмов других сложных формул ТКМ.

Протокол

Все экспериментальные процедуры на животных проводились в соответствии с Руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Комитетом по этике животных Аффилированной больницы Нанкинского университета китайской медицины (Одобрение No #2025DW-034-01; Дата утверждения: 24 марта 2025 года). Приготовление отвара Лянсюэ Дихуан проводилось в соответствии с процедурами, описанными в Китайской^{фармакопее 27}. Реагенты, химикаты и программное обеспечение, используемые в протоколе, перечислены в Таблице материалов.

1. Приготовление навара Лянсюэ Дихуан (LXDHD)

1. Готовьте сушёные травяные материалы согласно стандартной формуле LXDHD. Точный состав трав, ботанические названия и точные предписанные дозировки одиннадцати составляющих трав указаны в таблице 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте аутентификацию всех травяных материалов у квалифицированного фармакогнозиста перед использованием, чтобы обеспечить ботаническую идентичность и последовательность качества. Сохраняйте записи аутентификации для воспроизводимости.
2. Подготовка порошка
   1. Сушите все травяные материалы на воздухе при комнатной температуре в чистой, хорошо проветриваемой среде.
   2. Измельчите каждую траву отдельно с помощью механической кофемолки, пока не получите мелкий порошок.
   3. Смешайте порошки в соответствии с заданными пропорциями.
   4. Пропустите смешанный порошок через решето с 80 сетками (внутренний диаметр 180 мкм ± 7,6 мкм), чтобы обеспечить равномерный размер частиц.
   5. Тщательно униформируйте просеянный порошок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Однородный размер частиц необходим для стабильной эффективности экстракции. Неполное измельчение или неравномерное смешивание могут привести к изменчивости химического состава.
3. Подготовка водного экстракта LXDHD
   1. Точно взвесьте смесь травяного порошка и добавьте дистиллированную воду в соотношении 1:10 (в/в).
   2. Разогрейте смесь до кипения и отварите 20 минут.
   3. Отфильтруйте экстракт и соберите фильтрат.
   4. Добавьте свежую дистиллированную воду к остаткам и повторите напой ещё 20 минут.
   5. Объедините два фильтрата для получения конечного водного экстракта LXDHD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Двойной напой необходим для эффективного извлечения как водорастворимых, так и умеренно растворимых компонентов.
4. Концентрация и хранение
   1. Концентрируйте комбинированный напой под пониженным давлением или мягким нагревом до достижения желаемой концентрации.
   2. Дайте экстракту остыть до комнатной температуры.
   3. Храните подготовленный экстракт LXDHD при 4 °C и используйте в течение 48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторяющихся циклов заморозки и оттаивания, так как они могут разлагать биоактивные соединения и снижать воспроизводимость экспериментов.
5. Администрация
   1. Перед введением экстракт доведите до комнатной температуры.
   2. Введите концентрированный водный напой LXDHD мышам перорально в назначенных дозах в соответствии с экспериментальной группировкой.

2. Дизайн экспериментов на животных

1. Животные и условия содержания
   1. Приобретите самцов мышей C57BL/6 (в возрасте 6–8 недель, 20–25 г) у сертифицированного поставщика лабораторных животных.
   2. Домашних мышей в стандартных лабораторных условиях с 12-часовым циклом свет/темнота, контролируемой температурой (22–25 °C) и относительной влажностью (50%–60%).
   3. Обеспечьте мышам свободный доступ к стандартной еде и воде на протяжении всего эксперимента.
   4. Дайте мышам акклиматизироваться не менее 7 дней перед экспериментами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В последующие эксперименты включайте только здоровых мышей с нормальной активностью и весом тела.
2. Группировка и расчёт дозы
   1. Рассчитайте дозировку LXDHD для мыши согласно принципу преобразования дозы человек– животное, описанному в «Методологии фармакологических экспериментов», исходя из стандартной взрослой массы тела 70 кг и суточной клинической дозы 8,4 г²⁸.
   2. Случайным образом разделите мышей на следующие группы (n = 6 на группу): нормальная контрольная группа, модельная группа с индуцированным UC, группа с низкой дозой LXDHD (1,09 г/кг), группа с высокими дозами LXDHD (2,18 г/кг) и контрольная группа с 5ASA положительной (100 мг/кг)²⁹.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните рандомизацию с помощью таблицы случайных чисел для минимизации смещения выбора.
   3. Введение ОК и введение лекарственных средств
      1. Приготовьте раствор DSS 2,5% (с водой) в питьевой воде.
      2. Применять раствор DSS ad libitum мышам в модельных, обработанных LXDHD и группах 5ASA в течение 7 последовательных^{дней 30}.
      3. Обеспечьте мышей очищенной питьевой водой в нормальной контрольной группе.
      4. Вводите LXDHD и 5ASA группам лечения один раз в день с помощью орального гаважа в соответствующих дозах в течение экспериментального периода.
      5. Применить одинаковый объём решения для обычных управляющих и DSS-групп.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте решение DSS заново и меняйте его каждые 2 дня. Партии DSS могут различаться по силе, вызывающей колит; Проводите пилотное тестирование при использовании новой партии. Успешное создание модели UC, индуцированной DSS, характеризуется прогрессирующей потерей массы тела, кровопролитной диареей, повышенными показателями DAI и выраженным укоращением толстой кишки. Эти критерии и методологическая конструкция экспериментов на мышях соответствуют установленным эталонным^{стандартам 31}.
3. Подготовка заготовки и сыворотки, содержащей препараты, для экзогенной метаболомики
   1. Используйте отдельную когорту здоровых самцов мышей C57BL/6.
   2. Случайным образом разделите мышей на две группы: пустую группу и группу LXDHD.
   3. Вводите LXDHD в группу с LXDHD перорально гаваж по дозе 2,18 г/кг один раз в день в течение 7 дней подряд.
   4. Введите равный объём дистиллированной воды в пустую группу.
   5. Берите образцы крови через 1 час после окончательного введения.
   6. Обработайте образцы крови для получения сыворотки, как описано выше в разделе 3.5.

3. Оценка активности заболевания

1. Ежедневно следите за весом тела, консистенцией кала и фекальными кровотечениями во время эксперимента.
2. Рассчитайте индекс активности заболевания (DAI) на основе потери веса тела, консистенции кала и кровотечения из калов. Конкретная система оценивания подробно описана в таблице 3. Вычислите
   итоговый балл DAI как среднее (или сумму) этих трёх^{параметров 32}.
3. В конце 8-го дня анестезируйте мышей из каждой группы 1% пентобарбитала натрия (30 мг/кг). Соберите примерно 400 мкл крови из ретро-орбитального венозного сплетения каждой мыши. Затем усыпить животных путем вывиха шейки матки для обеспечения смерти, строго в соответствии с Рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA) по эвтаназии животных (рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите адекватную анестезию, аккуратно щипая пальцы ног и подошвенную поверхность задних лап; Отсутствие реакции на отмену указывает на достаточную глубину анестезии.
4. Собирайте ткани толстой кишки и измеряйте её длину как индикатор тяжести заболевания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Укорочённая длина толстой кишки считается отличительной чертой колита, индуцированного DSS,^{степени тяжести 33}.
5. Получение сыворотки крови
   1. Дайте части собранных образцов крови свернуться при комнатной температуре в течение 1 часа.
   2. Центрифуга берёт образцы при 1 000 × г в течение 15 минут при 4 °C для получения сыворотки.
   3. Количественно определить сывороточные уровни интерлейкина (IL)-1β, IL-6, IL-17, фактора некроза опухолей альфа (TNF-α) и IL-10.
   4. Собрать образцы тканей толстой кишки для гистопатологического анализа.
   5. Используйте оставшиеся образцы крови для периферического анализа крови.
   6. Резервировать дополнительные образцы сыворотки для анализа метаболомики.

4. Окрашивание по гематоксилин–эозин (H&E)

1. Фиксируйте ткани толстой кишки в 4% параформальдегиде не менее 24 часа.
2. Обезвоживайте ткани с помощью серии градуированного этанола.
3. Прозрачные ткани с помощью ксилола и внедрённые в парафин.
4. Срезы разрезаной ткани (толщиной 3–5 мкм) с помощью микротома.
5. Депарафинизуйте секции ксилолом.
6. Гидратировать секции с помощью сортируемого этанола.
7. Окрашивание сечений гематоксилином для визуализации ядерных ядер.
8. Контрокрашивание срезов с помощью эозина для цитоплазматического окрашивания.
9. Наблюдайте гистопатологические изменения под световым микроскопом и делайте репрезентативные изображения с помощью соответствующего программного обеспечения для визуализации.
10. Оценивайте гистологические показатели (HCS) на основе тяжести воспаления, глубины повреждения и повреждений крипты.
11. См. таблицу 4 для подробных гистологических критериев оценки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Захватывайте репрезентативные изображения вложения, сечения и окрашивания тканей для улучшения визуализации протокола.

5. Анализ периферической части крови

1. Собрать образцы периферической крови в антикоагулянтные трубки ЭДТА-K2 (1,5 мг ЭДТА на мл крови).
2. Аккуратно инвертируйте трубки 8–10 раз, чтобы обеспечить правильное смешивание.
3. Анализируйте количество кровяных клеток с помощью трёхкомпонентного ветеринарного гематологического анализатора (Mindray BC-2600vet) с калибровкой, специфической по виду.
4. Транспортировать образцы при 4 °C.
5. Анализируйте образцы в течение 4 часов после сбора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исключить образцы, показывающие гемолиз или коагуляцию, из анализа.

6. Ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA)

ПРИМЕЧАНИЕ: IL-6, IL-17, IL-1β и TNF-α являются ключевыми провоспалительными цитокином, тогда как IL-10 является ключевым противовоспалительным цитокином. Эти цитокины отражают наличие и тяжесть воспалительных^{реакций 34}.
Измерение этих цитокинов имеет решающее значение для понимания воспалительных процессов и оценки эффективности противовоспалительных средств.

1. Возьмите образцы крови из ретроорбитального венозного сплетения.
2. Дайте образцам свернуться при комнатной температуре в течение 1 часа.
3. Центрифуга взяла образцы при 1000 × г в течение 15 минут при 4 °C для получения сыворотки.
4. Измеряйте уровень IL-1β, IL-6, IL-17, TNF-α и IL-10 в сыворотке с помощью коммерческих наборов ELISA.
5. Измеряйте поглощение с помощью считывателя микропластин, оснащённого стандартным программным обеспечением для сбора данных.
6. Рассчитывайте концентрацию цитокинов на основе стандартных кривых.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализируйте все образцы и стандарты в дубликате, чтобы снизить техническую вариабельность.

7. Анализ LC–MS отвара Лянсюэ Дихуан

1. Подготовка образца
   1. Точно взвесьте 10 г смеси LXDHD сырого травяного порошка.
   2. Растворите порошок в 30 мл горячей воды.
   3. Проведите ультразвуковое извлечение в течение 30 минут.
   4. Смешайте 100 мкл экстракта с 400 мкл метанола.
   5. Вихрь на 10 минут.
   6. Центрифуга при 14 000 × г в течение 10 минут.
   7. Соберите супернатант в качестве тестового раствора.
2. Условия LC–MS
   1. Проведите хроматографическое разделение с помощью LC-системы в сочетании с Q-масс-спектрометром.
   2. Используйте колонку C18 (150 × 2,1 мм, 1,8 мкм).
   3. Установите подвижную фазу следующим образом: растворитель А, 0,1% муравьиной кислоты в воде; растворитель B, метанол.
   4. Установите расход на 0,30 мл/мин.
   5. Установите температуру столба на 35 °C.
   6. Установите объём впрыска на 5 мкл.
   7. Примените следующую программу градиентного элюирования:
      0–2 мин, 5% B;
      2–15 мин, 5–95% B;
      15–18 мин, 95% B;
      18–18,1 мин, 95–5% B;
      18,1–22 мин, 5% B.
   8. Параметры масс-спектрометрии установлены следующим образом: скорость расхода оболочного газа — 35 арб; расход вспомогательного газа — 10 арб; распыляющее напряжение — 3,5 кВ (положительный) и 2,8 кВ (отрицательный); капиллярная температура — 320 °C; Температура вспомогательного газового обогревателя — 350 °C.
   9. Получать данные MS как в положительном, так и в отрицательном ионном режимах с полным диапазоном MS-сканирования от 100 до 1500 (разрешение: 70 000).
   10. Выполните сканирование MS2, зависящие от данных, с разрешением 17 500.
   11. Обрабатывайте исходные данные и идентифицируйте соединения с помощью базы данных mzCloud.

8. Анализ нецелевых метаболомных веществ в сыворотке

1. Подготовка образцов сыворотки и контроль качества (QC)
   1. Разморозить образцы сыворотки на льду.
   2. Перенесите 50 мкл сыворотки в центрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
   3. Добавьте 200 мкл холодного метанола/ацетонитрила (1:1, в/в).
   4. Вихрь в течение 1 минуты для осаждения белков.
   5. Инкубировать на льду 15 минут.
   6. Центрифуга при 14 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
   7. Перенесите супернатант в новую трубку.
   8. Высушите экстракт с помощью вакуумного концентратора.
   9. Восстанавливается в 100 мкл ацетонитрила/воды (1:1, v/v).
   10. Вихрь тщательно.
   11. Центрифуга снова на 14 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
   12. Соберите супернатант для анализа LC-MS.
   13. Подготовьте образцы контроля качества, объединив 10 мкл аликвотов из каждого образца.
   14. Вводите один образец контроля качества на каждые 8–10 экспериментальных образцов для мониторинга стабильности и повторяемости прибора.
2. Настройки приобретения LC-MS
   1. Проведите хроматографическое разделение с помощью системы LC с колонкой C18 (150 × 2,1 мм, 1,8 мкм).
   2. Установите температуру столба на 35 °C.
   3. Установите расход на 0,30 мл/мин.
   4. Установите объём инжекции на 2 мкл (положительный режим) или 5 мкл (отрицательный режим).
   5. Используйте растворитель A (0,1% муравьиной кислоты в воде) и растворитель B (ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислоты).
   6. Примените программу элюирования с линейным градиентом.
   7. Работайте с масс-спектрометром в положительном и отрицательном HESI режимах.
   8. Установить диапазон массового сканирования на m/z 100–1500.
   9. Установите напряжение распыления на 3,5 кВ (положительное) и 2,8 кВ (отрицательное).
   10. Установите капиллярную температуру на 320 °C.
3. Обработка данных и дифференциальная идентификация метаболитов
   1. Импортируйте сырые данные LC-MS (.raw файлов) в программу.
   2. Выполните выравнивание пиков, пик пик и коррекцию базовой линии.
   3. Нормализовать извлекаемые пиковые особенности до общей интенсивности ионов.
   4. Идентифицировать метаболиты путём точного сопоставления массовых паттернов (толерантность к массе < 5 ppm) и фрагментационных паттернов MS/MS с базами данных mzCloud и ChemSpider.
   5. Провести многомерный статистический анализ (PCA и OPLS-DA/PLS-DA).
   6. Определите дифференциальные метаболиты на основе следующих порогов: VIP > 1.0 и p < 0.05 (t-тест Студента).

9. Анализ фармакологии в сети

ПРИМЕЧАНИЕ: Сетевая фармакология использовалась для прогнозирования активных компонентов и ключевых мишеней LXDHD в^{UC 35,36}. Методология включает анализ баз данных, обработку химической информации, сбор данных о биоактивности, поиск белковых мишеней, профилирование экспрессии генов, построение сетей взаимодействий и анализ обогащения^{путей 37,38}.

1. Активный скрининг соединений
   1. Получить активные соединения из базы данных данных и анализа традиционных китайских медицинских систем фармакологии (TCMSP) (дата обращения: 10 декабря 2025 года) с использованием OB ≥ 30% и DL ≥ 0,18.
   2. Дополнение соединений через поиск литературы в PubMed и Web of Science (10–15 декабря 2025 года).
   3. Стандартизировать цели с помощью базы данных UniProt (дата обращения: 15 декабря 2025).
2. Идентификация целей заболевания
   1. Собирайте цели, связанные с UC, из баз данных GeneCards, OMIM, TTD и DrugBank (дата обращения: 15 декабря 2025 года).
3. Строительство и анализ сети
   1. Определите пересекающиеся цели с помощью пакета VennDiagram в программном обеспечении R.
   2. Постройте сеть с помощью программного обеспечения Cytoscape.
   3. Анализируйте топологию с помощью плагина NetworkAnalyzer и плагина CytoNCA.
4. Идентификация сети PPI и основных целей
   1. Импортировать пересекающиеся цели в базу данных STRING.
   2. Ограничьте виды Homo sapiens.
   3. Удалите изолированные узлы.
   4. Примените порог PPI > 0,9.
   5. Экспортируйте данные и анализируйте их в программном обеспечении.
   6. Рассчитайте DC, BC, EC, CC, NC и LAC.
   7. Выполнить фильтрацию на основе медианы для генерации подсетей и определения основных^{целей 39}.
5. Анализ обогащения GO и KEGG
   1. Выполните обогащение GO и KEGG с использованием пакетов R и Bioconductor.
   2. Используйте R-пакеты, включая org. Hs.eg.db, clusterProfiler, DOSE, enrichplot, stringi и ggplot2.
   3. Установите пороговые значения в p = 0,05 и q = 0,05.
   4. Проведите анализ GO для категорий MF, BP и CC.
   5. Выполните обогащение пути KEGG и^{классификацию 40}.
6. Молекулярная стыковка
   1. Скачайте составные структуры с TCMSP в формате SDF.
   2. Скачайте белковые структуры с AlphaFold в формате PDB.
   3. Выполните стыковку с помощью веб-сервера CB-DOCK2 (CADD Lab, Сычуаньский университет, Чэнду, Китай).
   4. Определите рецепторные и лигандовые файлы соответственно.
   5. Записывайте оптимальную позу связывания и энергию связывания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стыковка проводилась с использованием генетического^{алгоритма 41}. Результаты ранжировались по энергии связывания.

10. Статистический анализ

1. Проведите статистический анализ с помощью программного обеспечения GraphPad Prism.
2. Выражайте количественные данные как среднее ± стандартное отклонение (SD).
3. Проверьте нормальность с помощью теста Шапиро–Уилка.
4. Проверьте однородность дисперсии с помощью теста Брауна–Форсайта.
5. Выполните односторонний ANOVA с пост-хок тестом Tukey для нормально распределённых данных.
6. Проведите тест Крускаля–Уоллиса с помощью теста Данна для непараметрических данных.
7. Считайте p < 0,05 статистически значимым.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшее p-значение указывает на большую статистическую разницу между группами.

Результаты

Анализ сетевой фармакологии LXDHD в UC

Сетевая фармакология применялась для прогнозирования потенциальных терапевтических мишень и молекулярных механизмов LXDHD при UC. В общей сложности из базы данных TCMSP было отбрано 211 соединений с благоприятными фармакокинетическими свойствами, включая 36 из Scutellaria baicalensis, 37 из Phellodendron chinense, 10 из Rehmannia glutinosa, 11 из Paeonia suffruticosa, 2...

Обсуждение

Этот метод представляет собой визуализированный, воспроизводимый экспериментальный рабочий процесс, интегрирующий сетевую фармакологию, нецелевую метаболомику и валидацию in vivo для изучения противовоспалительного эффекта формул ТКМ в мышиной модели UC, индуцированной с помощью DSS. В отличие от традиционных фармакологических исследований, которые в основном сосредоточены на отдельных механистических выводах, этот протокол подчёркивает прочность самой методологической структуры...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5-аминосалициловая кислота (5-ASA)	Сигма-Олдрич	A3537	Положительный контрольный препарат при язвенном колите; Вводится в дозе 100 мг/кг пероральной гаваджи.
Ацетонитрил (класс LC-MS)	Merck	100030	Используется для подготовки образцов метаболомики и LC-MS в мобильной фазе.
База данных структуры белков AlphaFold	EMBL– Европейский институт биоинформатики	https://alphafold.ebi.ac.uk/	База данных, используемая для получения предсказанных трёхмерных структур целевых белков.
Angelica sinensis (Данг Гуй)	Больница китайской медицины провинции Цзянсу	Бэтч: 2409001	Составляющая травы LXDHD (Доза: 1,6 г).
CB-Dock2	Лаборатория CADD	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/	Веб-платформа, используемая для молекулярного стыковки и прогнозирования ligand– Режимы связывания белками.
Цитрусовый аурантий (Чжи Кэ)	Больница китайской медицины провинции Цзянсу	Бэтч: 2409001	Составляющая трава LXDHD (Доза: 0,5 г).
Программное обеспечение для поиска соединений	Термо Фишер Сайентифик	Версия 3.3	Используется для обработки данных LC–MS и идентификации соединений.
Программное обеспечение CTAn	Bruker	Версия 1.17	Используется для микро-КТ 3D-реконструкции изображений и анализа эрозии костей.
Цитоскейп	Консорциум Cytoscape	Версия 3.8.0	Программное обеспечение, используемое для построения и визуализации сети.
Декстрансульфат натрия (DSS)	MP Biomedicals	160110	Молекулярная масса 36 000 и незащитно; 50 000 да; Используется для вызова язвенного колита у мышей.
Антикоагулянтные трубки EDTA-K2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	Н/Д	Используется для забора крови на периферии.
Раствор для окрашивания эозином	Biosharp	Н/Д	Используется для цитоплазматического контрокрашивания в H& E-пятна.
Этанол	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	64-17-5	Используется при обезвоживании тканей.
Муравиная кислота (класс LC-MS)	Merck	5.33002	Используется для подготовки мобильных фаз LC-MS.
Glycyrrhiza uralensis (Gan Cao)	Больница китайской медицины провинции Цзянсу	Бэтч: 2409001	Составляющая трава LXDHD (Доза: 0,5 г).
GraphPad Prism	Программное обеспечение GraphPad	Версия 9.0	Используется для статистического анализа и графического представления.
Анализатор гематологии	Mindray	BC-2600vet	Трёхкомпонентный ветеринарный гематологический анализатор для рутинного анализа крови.
Раствор для окрашивания гематоксилином	Biosharp	BL700B	Используется для охраны и эксплуатации Электронное окрашивание срезов ткани толстой кишки.
Высокоскоростная центрифуга	Hitachi	CT15E/CT15RE	Используется для подготовки сыворотки и образцов.
IL-10 ELISA Kit (мышь)	МЭЙМЯНЬ	MM-0176M2	Используется для оценки уровня IL-10 в сыворотке.
IL-17 ELISA Kit (мышь)	Abclonal	RK00039	Используется для измерения уровня IL-17 в сыворотке.
IL-1 и бета; ЭЛИЗА Кит (мышь)	Abclonal	RK00006	Используется для обнаружения сыворотки IL-1 и бета; Уровни.
IL-6 ELISA Kit (мышь)	Abclonal	RK00008	Используется для количественного определения уровней IL-6 в сыворотке.
ImageJ (Fiji) Software	Национальные институты здравоохранения (NIH)	Версия 1.53c	Программное обеспечение с открытым исходным кодом, используемое для обработки изображений и количественной оценки.
Пакет приложений Leica X (LAS X)	Leica Microsystems	Версия 3.7	Программное обеспечение для визуализации, используемое для захвата гистопатологических слайдов.
Метанол (класс LC-MS)	Merck	106035	Используется для подготовки образцов метаболомики и LC-MS в мобильной фазе.
Мыши (самцы C57BL/6)	Anokang Biotechnology Co., Ltd.	Н/Д	Экспериментальные животные (возраст 6– 8 недель, 20 и неудача; 25 g) используется для модели UC, индуцированной DSS.
База данных mzCloud	Термо Фишер Сайентифик	https://www.mzcloud.org/	База данных, используемая для спектрального сопоставления MS/MS.
Оптический микроскоп	Leica	DM500	Используется для гистопатологических наблюдений.
Paeonia lactiflora (Ци Шао)	Больница китайской медицины провинции Цзянсу	Бэтч: 2409001	Составная трава LXDHD (Доза: 0,6 г).
Кора Паеония суфрутикоза (Му Дан Пи)	Больница китайской медицины провинции Цзянсу	Бэтч: 2409001	Составляющая трава LXDHD (Доза: 0,5 г).
Параформальдегид (4%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	Н/Д	Используется для фиксации тканей толстой кишки.
Патологический микротом	Leica	RM2016	Используется для приготовления парафиновых срезов тканей.
Phellodendron chinense (Хуан Бо)	Больница китайской медицины провинции Цзянсу	Бэтч: 2409001	Составляющая трава LXDHD (Доза: 0,5 г).
Platycladus orientalis (Ce Bai Ye Tan)	Больница китайской медицины провинции Цзянсу	Бэтч: 2409001	Составляющая травы LXDHD (Доза: 0,7 г).
Эксактивный высокоразрешающий масс-спектрометр Q	Термо Фишер Сайентифик	Q Exactive	Масс-спектрометр на основе Orbitrap для анализа LC–MS.
R Software	R Foundation для статистических вычислений	Версия 4.2.1 (https://www.r-project.org/)	Программное обеспечение, используемое для анализа обогащения GO и KEGG.
Rehmannia glutinosa (Шэн Ди Хуан)	Больница китайской медицины провинции Цзянсу	Бэтч: 2409001	Составляющая травы LXDHD (Доза: 2,1 г).
Sanguisorba officinalis (Ди Ю Тан)	Больница китайской медицины провинции Цзянсу	Бэтч: 2409001	Составная трава LXDHD (Доза: 0,6 г).
Сапошниковия дивариката (Фан Фэн)	Больница китайской медицины провинции Цзянсу	Бэтч: 2409001	Составляющая травы LXDHD (Доза: 0,3 г).
Scutellaria baicalensis (Хуан Цинь)	Больница китайской медицины провинции Цзянсу	Бэтч: 2409001	Составляющая трава LXDHD (Доза: 0,5 г).
Пентобарбитал натрия (1%)	Сигма-Олдрич	P3761	Используется для анестезии животных перед сбором образцов.
Софт Макс Про	Молекулярные устройства	Версия 7.1	Программное обеспечение для сбора и анализа данных, используемое с считывателем микропластин для ELISA.
База данных STRING	STRING Consortium	https://string-db.org/	База данных, используемая для protein– Анализ взаимодействия белков.
База данных TCMSP	Платформа TCMSP	https://tcmsp-e.com/	База данных, используемая для скрининга активных соединений и прогнозирования целей для лекарств.
TNF и альфа; ЭЛИЗА Кит (мышь)	Abclonal	RK00027	Используется для определения сыворотки TNF-и альфа; концентрации.
Ultimate 3000 RS LC System	Термо Фишер Сайентифик	Ultimate 3000 RS	Система UHPLC в сочетании с масс-спектрометрией.
Ультразвуковой очиститель	Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd	KQ3200E	Используется для ультразвуковой экстракции LXDHD.
База данных UniProt	Консорциум UniProt	https://www.uniprot.org/	База данных, используемая для стандартизации имён генов и белков.
Вихревой миксер	Beijing PowerStar Technology Co., Ltd	LC-Vortex-P1	Используется для сведения сэмплов.
Колонна Welch AQ-C18 (150 и больше; 2,1 мм, 1,8 мм; m)	Материалы Уэлча	AQ-18-15021	Колонка, используемая для разделения метаболитов и растительных компонентов.
Ксилол	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	1330-20-7	Используется для очищения тканей во время гистологической обработки.