Методическая статья

Измерение динамики трансляции мРНК в живых клетках с помощью разделенного люминесцентного мечения в клетках HEK293

DOI:

10.3791/70840

⸱

14 августа 2026 г.

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем гибкий, совместимый с высокопроизводительным скринингом метод измерения динамики трансляции мРНК в живых клетках HEK293 в режиме real-time с использованием разделенного люминесцентного тегирования. Этот универсальный анализ позволяет выявить структурные эффекты, оптимизировать транскрипцию in vitro и ускорить разработку терапевтических мРНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрая разработка вакцин для борьбы с COVID-19 продемонстрировала потенциал терапии на основе матричной РНК (мРНК) для трансформации процесса создания лекарственных препаратов. Подобно зрелой мРНК, мРНК, синтезированная in vitro, обладает теми же элементами, включая 5’-кэп, нетранслируемые области (UTR), кодирующую последовательность и поли(A)-хвост. Предыдущие работы, изучавшие влияние этих компонентов на трансляцию мРНК, в основном использовали высокоинженерные репортерные белки, характеризующиеся эффективной трансляцией и стабильностью белка. Поскольку структурные элементы каждой мРНК по-разному влияют на их трансляцию, крайне важно определить оптимальный дизайн, соответствующий конкретному терапевтическому белку интереса (POI). Для характеристики трансляции POI была использована система комплементации разделенной люциферазы. Короткий пептидный тег (HiBiT), который может быть присоединен к любому концу POI, связывается со своим комплементарным гетеродимером (LgBiT) для восстановления ферментативной активности в присутствии проникающего в клетку субстрата. До настоящего времени разделенное люминесцентное мечение использовалось преимущественно для высокопроизводительного изучения обновления белков. Ранее мы продемонстрировали, как разделенное люминесцентное мечение может быть применено для высокопроизводительного количественного определения трансляции мРНК во времени in cellulo в клетках HEK293, конститутивно экспрессирующих комплементарный гетеродимер. В данной работе мы дополнительно демонстрируем универсальность этого анализа и подробно описываем, как он может быть использован для оптимизации транскрипции in vitro с целью снижения затрат. Система анализа позволяет уникальным образом различать изменения в структурных компонентах, одновременно подчеркивая эффекты оптимизации кодирующей последовательности с использованием неинженерных генов. Кроме того, мы показываем, что 4-кратное снижение концентрации 5’-кэпа при транскрипции in vitro приводит к эквивалентному уровню трансляции in cellulo. Эти результаты иллюстрируют, как разделенное люминесцентное мечение может быть легко интегрировано в рабочий процесс разработки мРНК-терапии, позволяя осуществлять мониторинг динамики экспрессии белков под действием мРНК в реальном времени in cellulo, предлагая тем самым универсальный метод для развития терапевтических средств на основе мРНК.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Терапевтические препараты и исследовательские приложения на основе матричной РНК (мРНК) стремительно развиваются в последние годы, что обусловлено успехом мРНК-вакцин1,2 и растущим признанием универсальности РНК как программируемой биомолекулы. Центральной проблемой в этой области является возможность количественной и динамической оценки эффективности трансляции мРНК в различных условиях. Метод, описанный здесь, основанный на использовании системы разделенного люминесцентного мечения, представляет собой гибкую и масштабируемую платформу для изучения трансляции мРНК в живых клетках in cellulo3. Общая цель данного метода — дать исследователям возможность измерить, как особенности последовательности, химические модификации и структурные элементы влияют на кинетику трансляции и последующий оборот белка, предоставляя тем самым мощный инструмент для оптимизации конструктов мРНК для терапевтического и фундаментального применения.

In vitro транскрибированная мРНК повторяет основную архитектуру зрелых транскриптов, включая 5′-кэп, нетранслируемые области (UTR), кодирующую последовательность и поли(А)-хвост, при этом часто содержат модифицированные нуклеотиды для снижения иммуногенности4,5. Обширные исследования показали, что каждый из этих элементов — как по отдельности, так и в комбинации — может быть модифицирован для сильного влияния на эффективность трансляции и выход белка6,7. Тем не менее, большинство предыдущих работ основывались на высокооптимизированных репортерных белках, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP)7, NanoLuc8 или спайковый белок SARS-CoV-28,9, которые сконструированы для высокоэффективной трансляции и производства очень стабильных белков и, следовательно, не отражают проблем, возникающих в терапевтическом контексте. Поскольку терапевтические мРНК кодируют различные целевые белки (POI), каждый из которых подвержен уникальным структурным ограничениям и специфической для типа клеток регуляции, принципы дизайна, максимизирующие трансляцию для одной конструкции, могут не быть применимы к другой, как сообщалось ранее3. Таким образом, определение оптимальной конфигурации для конкретного терапевтического POI является крайне важным и требует методов, позволяющих чувствительно и систематически оценивать, как отдельные особенности транскрипта влияют на выход белка.

Методы, ориентированные на рибосомы, такие как профилирование полисом, позволяют разделять фракции трансляции с помощью градиентного центрифугирования10, в то время как профилирование рибосом (Ribo-seq) обеспечивает разрешение на уровне нуклеотидов для определения занятости рибосом, сайтов инициации и пауз11. Подобно Ribo-seq, другие подходы на основе секвенирования, такие как высокопроизводительное секвенирование РНК, выделенной методом иммунопреципитации с перекрестным сшиванием (HITS-CLIP), и аффинная очистка транслирующих рибосом (TRAP), позволяют дополнительно охарактеризовать трансляцию РНК, ассоциированных с рибосомами или РНК-связывающими белками12. Несмотря на свою эффективность, эти методы требуют сложной подготовки, специализированного оборудования и глубоких знаний в области биоинформатики, что делает их непригодными для высокопроизводительной разработки терапевтических мРНК. Иммунопреципитация нативных цепей13 позволяет измерить эффективность трансляции с помощью белков с FLAG-меткой, иммунопреципитированных из рибосом и количественно определенных методом количественной обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции (qRT-PCR). Хотя этот анализ применим к терапевтическим мРНК, он трудозатратен, не обладает временным разрешением и непригоден для высокопроизводительного применения. Система SunTag14 позволяет проводить измерения выхода синтеза белка и трансляционной регуляции в живых клетках на уровне отдельных молекул мРНК и работает за счет взаимодействия одноцепочечного вариабельного фрагмента антитела (scFv), слитого с GFP, с тандемными повторами пептидного эпитопа. Эта система позволяет проводить динамические измерения трансляции и локализации с разрешением до одной молекулы мРНК, и поэтому она была использована для разработки многочисленных систем отслеживания нативных цепей15,16. Однако данный подход характеризуется низкой производительностью и требует использования мощных микроскопов.

Хотя мечение нативного белка неизбежно, для мониторинга трансляции мРНК в живых клетках была определена возможность использования небольшого пептидного тега, производного от люциферазы NanoLuc. Люцифераза NanoLuc была сконструирована таким образом, чтобы разделяться на малую субъединицу из 11 аминокислот (HiBiT) и более крупную субъединицу из 158 аминокислот (LgBiT), которые могут быстро димеризоваться и в присутствии субстрата восстанавливать функциональную люциферазу17,18. Система расщепленного люминесцентного мечения обладает несколькими ключевыми преимуществами для изучения динамики мРНК. Во-первых, минимальный размер малой субъединицы, слитой с исследуемым белком (POI), позволяет кодирующей конструкции оставаться максимально близкой к нативному белку. Поскольку длина кодирующей последовательности может напрямую влиять на коэффициенты трансляции19, минимизация длины тега улучшает точность прогнозирования динамики трансляции синтетических мРНК. Крайне важно, что эта стратегия минимального мечения позволяет обнаруживать различия в трансляции, вызванные синонимичной вариацией кодирующей последовательности, что дает возможность изучать эффективность трансляции независимо от последовательности или стабильности белка3. По этой причине использование более крупных тегов, таких как флуоресцентные белки или полноразмерные люциферазы, является субоптимальным. Во-вторых, используемая здесь система расщепленного люминесцентного мечения обеспечивает немедленную генерацию сигнала. Ее быстрая и эффективная реакция комплементации in cellulo характеризуется высокой сродностью (KD = 700 pM) и применялась для измерения модуляции обновления белка с интервалом считывания всего в 30 s18. Хотя оригинальная система расщепленного люминесцентного мечения в основном сравнивалась с другими системами расщепленной люциферазы17,18, ключевым преимуществом в данном контексте является то, что генерация сигнала не ограничена созреванием белка. Напротив, флуоресцентным белкам требуется созревание хромофора, которое может занимать от нескольких минут до нескольких часов20, что ограничивает временное разрешение. Наконец, применяемая здесь отработанная система расщепленного люминесцентного мечения преодолевает ограничения систем расщепленных флуоресцентных белков, которые обычно требуют формирования хромофора после комплементации21, что вносит дополнительную задержку и ограничивает их пригодность для регистрации быстрых динамических процессов. Предыдущие исследования продемонстрировали полезность расщепленного люминесцентного мечения в анализах обновления белков и исследованиях их деградации22,23,24. Распространение этой проверенной технологии на кинетику трансляции представляет собой значительный методологический прогресс. Например, в то время как рибосомное профилирование может выявить плотность рибосом вдоль транскриптов, оно не может легко зафиксировать динамические изменения скоростей инициации или элонгации трансляции при различных условиях. Как было показано ранее3, эта система расщепленного люминесцентного мечения может обнаруживать различия при изменении структуры кэпа, состава 5′-нетранслируемой области (UTR), оптимизации кодонов, модификации нуклеотидов и длины поли(A)-хвоста, которые являются критическими детерминантами эффективности трансляции. Такая широта применения делает метод уникально мощным инструментом для анализа вклада отдельных особенностей мРНК в общий выход белка. Стоит отметить, что, в зависимости от используемого прибора, с помощью данной технологии можно получать данные как по отдельным клеткам, так и по всей лунке. Платформы визуализации, способные получать изображения на основе люминесценции, позволяют использовать эту технологию для изучения динамики трансляции в отдельных клетках. В данной работе мы фокусируемся на применении с использованием планшетного ридера, поскольку этот метод характеризуется средней или высокой пропускной способностью и минимальными требованиями к анализу данных.

Исследователям, рассматривающим данный метод, следует оценить его применимость с учетом их конкретных экспериментальных целей. Этот анализ особенно ценен в условиях, когда требуется высокопроизводительный скрининг синтетических конструкций мРНК, например, в процессах разработки терапевтических препаратов на основе мРНК. Он хорошо подходит для сравнительного анализа характеристик последовательностей синтетической мРНК — включая нетранслируемые области, использование кодонов или модификации нуклеотидов, — при которых могут быть обнаружены незначительные различия в эффективности трансляции3. Поскольку система совместима с платформами бесклеточной трансляции, анализами на живых клетках и специфическим по времени литическим анализом, она обеспечивает гибкость для исследователей, желающих адаптировать дизайн эксперимента как для механистических исследований, так и для прикладных разработок. В то же время важно осознавать границы применимости данного метода. Важно отметить, что анализ с разделенным люминесцентным мечением не обеспечивает разрешения по заполнению рибосомами, что остается уникальной возможностью методов рибосомального профилирования (ribosome footprinting), а также не позволяет напрямую измерять стабильность или деградацию РНК, которые могут потребовать оценки с помощью дополнительных методов. Однако из-за ограничений существующих рибо-центрических методов исследователи полагаются на анализы на основе меток, такие как система разделенной люминесценции, для изучения зависящей от мРНК экспрессии белка с временным разрешением в качестве прокси-показателя динамики трансляции. Таким образом, хотя эта система является мощным инструментом для мониторинга экспрессии белка, управляемой синтетической мРНК, ее целесообразность зависит от того, сосредоточен ли исследовательский вопрос на динамическом выходе белка, а не на детальном позиционировании рибосом или распаде РНК.

Резюмируя, система раздельного люминесцентного мечения представляет собой мощный и универсальный метод изучения трансляции мРНК. Ее общая цель — предоставить исследователям гибкий, масштабируемый, высокопроизводительный инструмент, способный обнаруживать различия в выходе белка, возникающие при использовании синтетических мРНК с различными структурными и последовательными элементами3. Обоснованием ее разработки стало стремление преодолеть ограничения существующих методов, предложив преимущества в чувствительности, масштабируемости и временном разрешении. В контексте более широкой литературы по биологии РНК и терапии данный метод является ценным дополнением к экспериментальному арсеналу, позволяя получать как фундаментальные сведения, так и достигать успехов в трансляционной медицине. Тщательно оценив сильные и слабые стороны анализа, исследователи смогут определить его применимость для своих конкретных задач, тем самым максимизировав его эффективность в быстро развивающейся области науки о РНК.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Графическое изображение всего протокола представлено на Рисунке 1.

1. Подготовка матрицы для транскрипции in vitro (IVT)

ПРИМЕЧАНИЕ: При подготовке ДНК-матрицы для IVT убедитесь, что плазмидная ДНК содержит промотор РНК-полимеразы (обычно T7 или SP6), 5’- и 3’-UTR, а также открытую рамку считывания исследуемого белка (Рисунок 1).

  1. Линеаризуйте плазмидную ДНК с помощью рестрикционного фермента с одним сайтом резания, расположенным после 3’-UTR; подготовьте реакционную смесь согласно инструкциям производителя. После инкубации очистите продукт рестрикции с использованием набора для очистки ДНК на основе спин-колонок. Определите количество ДНК с помощью спектрофотометра.
  2. Для подтверждения линеаризации приготовьте 1% агарозный гель в TAE-буфере, содержащий краситель ДНК бромистый этидий в концентрации 0,1 µg/mL. Смешайте 150 ng рестрикционной ДНК с водой и красителем для нанесения. Нанесите на агарозный гель образец, нерезанную плазмиду и маркер длин ДНК, и проведите электрофорез при 100 V в течение 40 мин в 1× Трис-ацетат-ЭДТА (TAE) буфере. Визуализируйте результат с помощью гель-сканера.
    ОСТОРОЖНО: Раствор бромистого этидия является сильным мутагеном и требует осторожного обращения с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ).
  3. Если плазмидная ДНК не имеет поли(А)-хвоста непосредственно после 3’-UTR, введите его с помощью ПЦР. Проведите ПЦР согласно инструкциям производителя, используя высокоточную полимеразу и правильно подобранные праймеры. Убедитесь, что ампликон включает промотор T7, открытую рамку считывания и поли(А)-хвост.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Технологии кэпирования могут иметь специфические требования к последовательности промотора T7; следовательно, эти требования могут быть реализованы за счет соответствующего дизайна прямого праймера. Обратный праймер связывается с концом 3’-UTR и вводит поли(А)-хвост (рекомендуемая длина не менее 80 T). Для конструктов с высоким содержанием ГЦ-пар рекомендуется использовать ступенчатую ПЦР и/или 3% DMSO.
  4. Для подтверждения успешности ПЦР приготовьте агарозный TAE-гель, содержащий бромистый этидий (см. шаг 1.2). Если длина конструкта составляет ≥1 kb или <1 kb, приготовьте гель с концентрацией 1% или 2% соответственно. Смешайте 5 µL ПЦР-реакционной смеси с водой и красителем для нанесения. Нанесите на агарозный гель образец и маркер длин ДНК, и проведите электрофорез при 100 V в течение 40 мин в TAE-буфере. Визуализируйте результат с помощью гель-сканера.
  5. После подтверждения размера продукта ПЦР очистите ПЦР-реакционную смесь с помощью набора для очистки ДНК на основе спин-колонок. Элюируйте ДНК в 15–20 µL элюирующего буфера (обычно поставляется в комплекте с набором для очистки ДНК) или воды, свободной от нуклеаз, чтобы сконцентрировать матричную ДНК для последующего использования в IVT. Определите количество ДНК с помощью спектрофотометра.

2. Транскрипция in vitro

  1. Перед началом работы обработайте поверхность стола, перчатки и пипеты раствором для деконтаминации РНКаз путем распыления и протирания. Для повышения выхода и качества продукта выполняйте данную процедуру в стерильном боксе.
  2. Разморозьте и подготовьте компоненты набора для транскрипции in vitro (IVT) на основе T7-полимеразы в соответствии с инструкциями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые производители рекомендуют использовать дитиотреитол (ДТТ, 0,1 M) для ограничения окисления реакции и повышения её эффективности. Данный этап рекомендуется выполнять, если он совместим с набором. При использовании модифицированных дНТП замените соответствующий немодифицированный нуклеотид эквивалентным количеством модифицированного нуклеотида. Оцените выход продукта на примере половины реакции, так как при проведении полной реакции существенного увеличения выхода не наблюдалось. При синтезе более чем одной мРНК рекомендуется приготовить мастер-микс для уменьшения ошибок пипетирования и вариабельности результатов.
  3. Тщательно перемешайте содержимое пипеткой, затем инкубируйте при 37°C °Инкубируйте в течение 5 ч с подогревом крышки для предотвращения конденсации. При необходимости увеличьте время инкубации до ночного, так как это оказывает минимальное влияние на выход или целостность мРНК.
  4. Добавьте 1 µЛ ДНКазы I и тщательно перемешайте пипетированием. Инкубируйте при 37 °инкубировать при температуре С в течение 30 мин.
  5. Очистка in vitro транскрибированная (IVT) РНК
    1. Очистите продукт реакции IVT с помощью набора для очистки РНК на основе колонок в соответствии с инструкциями производителя (различные наборы могут обеспечивать разную степень восстановления и иметь разную сорбционную емкость). Для элюции добавьте 60 µл нуклеаза-free воды и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин перед центрифугированием.
    2. В качестве альтернативы можно использовать осаждение хлоридом лития, что является более дешевым и гибким подходом.
      1. Добавьте в реакционную смесь равный объем 7,5 М хлорида лития, перемешайте и инкубируйте при -20 °C. °инкубировать в течение ночи при температуре C.
      2. Центрифугируйте при 18 300 об/мин × центрифугировать в течение 20 мин при 4°C °C, затем осторожно удалите супернатант, не повреждая осадок РНК.
      3. Промыть 950 µл 70% этанола и центрифугируйте при 18 300 × г в течение 5 мин при 4 °С. Удалите супернатант, дайте осадку высохнуть в течение примерно 5 мин при комнатной температуре, затем ресуспендируйте в воде, свободной от нуклеаз (60 µL является стандартным объемом; уменьшите объем в зависимости от размера осадка для повышения концентрации).
        ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: хлорид лития может вызвать раздражение кожи или слизистой оболочки глаз при отсутствии надлежащих средств индивидуальной защиты (СИЗ). При работе с этим веществом используйте перчатки и средства защиты глаз. Этанол является легковоспламеняющейся жидкостью и может вызвать раздражение глаз. Храните вдали от открытого огня и используйте соответствующие СИЗ, включая средства защиты глаз.
  6. Количественно определите содержание мРНК с помощью спектрофотометра. Убедитесь, что соотношение A260/A280 для мРНК составляет примерно 2,0, и подтвердите, что соотношение A260/A230 находится в диапазоне от 1,8 до 2,2.
  7. Для подтверждения успешного проведения IVT приготовьте 1% агарозный (недентурирующий) гель в TAE-буфере с добавлением бромистого этидия. Смешайте 500 нг мРНК с водой и красителем для нанесения образцов, затем следуйте инструкциям производителя по подготовке маркера молекулярных масс РНК и правилам денатурации. Нанесите образцы на агарозный гель и проведите электрофорез при напряжении 80 В в течение 40 мин в TAE-буфере. Визуализируйте результаты с помощью гель-сканера.
  8. Для дальнейшего подтверждения правильного размера мРНК проанализируйте образцы с помощью системы Bioanalyser.
  9. Во избежание циклов замораживания-оттаивания разделите мРНК на аликвоты в объеме, необходимом для эксперимента. Например, используйте 1,2 пмоль мРНК на лунку в 96-луночном планшете. Соответственно, отберите аликвоту соответствующего объема для получения 1,2 пмоль. × в n повторностях, затем хранить при -80°C °C.

3. Обратная трансфекция HEK293

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения временных измерений требуется клеточная линия, конститутивно экспрессирующая комплементарный фрагмент люциферазы. Этого можно добиться путем создания стабильной клеточной линии посредством трансфекции плазмиды, экспрессирующей необходимый фрагмент люциферазы, и последующего клонального отбора. Это позволяет пользователю измерять временно-разрешенную динамику трансляции мРНК в любом выбранном клеточном фоне. В качестве альтернативы можно приобрести готовые клеточные линии, экспрессирующие необходимый фрагмент люциферазы. Данные эксперименты проводились с использованием клеток HEK293, конститутивно экспрессирующих комплементарный гетеродимер.

  1. Перед началом работы разморозьте мРНК на льду, чтобы избежать ее деградации.
  2. Приготовьте трансфекционные комплексы. Для планшета на 96 лунок требуется 1,2 пмоль мРНК на лунку. Если опыт проводится в дубликатах, приготовьте объем, рассчитанный на 2,5 дубликата, чтобы компенсировать погрешность при пипетировании. Таким образом, смешайте 3 пмоль мРНК со средой Opti-MEM Reduced Serum Medium до конечного объема 50 µL (20 µL/лунка).
  3. Добавьте 0,5 µL катионного липидного трансфекционного реагента (0,2 µL/лунка), перемешайте путем пипетирования вверх-вниз и инкубируйте при комнатной температуре. После 5 мин инкубации снова перемешайте путем пипетирования вверх-вниз, затем внесите по 20 µL в каждую лунку белого плоского 96-луночного микропланшета. Рекомендуется располагать лунки для трансфекции в центре планшета, оставляя краевые лунки пустыми.
  4. Подготовьте клетки HEK293, удалив среду и промыв их 2 mL фосфатно-солевого буфера (PBS) без Ca2+ и Mg2+. Удалите промывочный раствор и добавьте 500 µL Trypsin-EDTA, затем инкубируйте при 37 °C в течение 3 мин.
  5. Во время диссоциации клеток заполните краевые лунки 96-луночного планшета раствором PBS для уменьшения испарения среды в процессе культивирования клеток. Если требуются все лунки, пространство между лунками можно заполнить раствором PBS.
  6. Добавьте 4,5 mL модифицированной среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 1× L-глутамином и 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), для сбора клеток. Выполните подсчет клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
  7. Перенесите необходимое количество клеток (достаточное для посева 1 x 105 клеток на лунку) плюс объем для 3 дополнительных лунок (для компенсации погрешности пипетирования) в чистую пробирку и центрифугируйте при 500 × g в течение 2 мин.
  8. Удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в необходимом объеме среды Лейбовиц L-15 (без фенола), дополненной 10% FBS и субстратом для живых клеток Endurazine (1:200), чтобы обеспечить конечную концентрацию 1 × 106 клеток/mL. Перемешайте серологическим пипеточником для thorough перемешивания Endurazine. Внесите по 100 µL (1 × 105 клеток) ресуспендированных клеток в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении экспериментов с временным курсом продолжительностью 72 ч увеличьте объем до 200 µL во избежание испарения.
  9. Сразу после трансфекции поместите клетки в планшетный ридер (люминометр), настроенный на 37 °C. Выполняйте измерения через регулярные интервалы времени с временем интегрирования 1 с. Благодаря эффективной комплементации системы сигнал становится обнаружимым в течение нескольких минут. Поэтому для получения точного базового значения этот этап необходимо выполнить незамедлительно. Данные интервалы зависят от эксперимента и прибора; однако в данных опытах оптимальным было признано измерение каждые 12 мин для экспериментов с временным курсом 18 ч и каждые 48 мин для экспериментов продолжительностью 72 ч. Люминесценция не требует фильтра для измерения; более высокое соотношение сигнал/шум наблюдалось при использовании фильтра 530–540 nm.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал биолюминесцентного резонансного переноса энергии (BRET) возникает от eGFP, меченного расщепленной люциферазой, поэтому фильтр 530–540 nm будет фиксировать как люминесцентный, так и флуоресцентный сигналы. Чтобы избежать фиксации BRET, используйте фильтр 460–480 nm или, в качестве альтернативы, используйте нефлуоресцентный белок, такой как MYL3, в качестве референса.

4. Анализ данных

  1. Рассчитайте кратность изменения в относительных единицах люминесценции (RLU), нормализуя сигнал для каждого условия по первой временной точке (t0, нормализованной по среднему значению технических повторов), так как сигнал в начале анализа соответствует фоновому уровню.
  2. Снизьте вариабельность между биологическими повторами путем нормализации по контрольному условию.
  3. Выберите метод статистического анализа для данного анализа — либо по одной временной точке, либо по площади под кривой (AUC) — в зависимости от поставленного вопроса.
    1. Для анализа по одной временной точке используйте моменты времени, когда наблюдается пик экспрессии (который зависит от исследуемого объекта, POI), а также конечную временную точку. Постройте график RLU, рассчитанного на этапе 4.1, для конкретной временной точки (например, 240 min), и проанализируйте его с помощью соответствующего статистического критерия.
    2. Оцените динамику трансляции и деградации белка, рассчитав AUC для определенного временного интервала (например, от t0 до 240 min) или для всей продолжительности анализа (от t0 до конечной точки). Нормализуйте значение AUC для каждого биологического повтора по среднему значению референсной мРНК, чтобы получить показатель кратности изменения AUC, который можно проанализировать с помощью соответствующих статистических критериев.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует несколько способов оптимизации экономической эффективности данного протокола. Например, реакцию IVT миниатюризировали, уменьшив объем вдвое по сравнению с рекомендованным производителем, и было обнаружено, что полученный выход удовлетворял количеству, необходимому для экспериментов in cellulo. Следует отметить, что длина и сложность последовательности влияют на выход IVT, поэтому успешная оптимизация протокола должна обеспечивать получение не менее 50 µg мРНК за одну реакцию IVT. Как и наборы для реакций IVT, реагенты для кэпирования также часто стоят дорого. Учитывая, что на одну молекулу мРНК требуется только один кэп, мы предполагаем, что реакция IVT содержит избыток молекул кэпа по отношению к количеству полученных молекул мРНК. Таким образом, было исследовано, можно ли дополнительно оптимизировать протокол путем титрования количества реагента для кэпирования, добавляемого в реакцию IVT; результаты представлены на Рисунке 2. В реакции IVT объемом 10 µL добавляли 100% (конечная концентрация кэпа 10 mM), 50%, 25% или 0% (без кэпа) реагента для кэпирования, и полученную мРНК eGFP трансфицировали в клетки HEK293, конститутивно экспрессирующие комплементарный гетеродимер. В качестве контроля нормализации также трансфицировали MYL3 (100% кэпирования), так как этот эндогенный ген, кодирующий обогащенный в мышцах структурный белок, демонстрирует динамику трансляции, схожую с eGFP, однако с сигналом, более близким к сигналу других эндогенных генов3. В соответствии с предыдущими данными3, мРНК eGFP без кэпа привела к отсутствию трансляции, аналогично имитационному контролю (Рисунок 2A). мРНК eGFP, синтезированная с использованием 25% или 50% рекомендованного количества реагента для кэпирования, показала уровни экспрессии, сопоставимые со 100% (Рисунок 2A), что не привело к различиям в значениях площади под кривой (AUC) в течение 18-часового временного интервала (Рисунок 2B). Эти результаты указывают на то, что в данных условиях реагент для кэпирования присутствует в избытке и что снижение его концентрации не ухудшает выход трансляции, что согласуется с достаточным включением кэпа. Результаты, представленные на Рисунке 2, специфичны для использованной марки реагента для кэпирования и должны быть оптимизированы для других реагентов.

В то время как достижения в технологии кэпирования и внедрение модифицированных нуклеотидов повысили экспрессию мРНК, разработка алгоритмов дизайна мРНК позволила еще больше улучшить этот показатель. Эти алгоритмы сосредоточены на оптимизации стабильности мРНК и использования кодонов путем улучшения минимальной свободной энергии (MFE) и индекса адаптивности кодонов (CAI) соответственно. Для проверки влияния оптимизации на экспрессию мРНК использовался LinearDesign9. Этот алгоритм основан на вводе значения лямбда, которое представляет собой параметр масштабирования, используемый в формулах оптимизации и определяющий, в какой степени алгоритм отдает приоритет MFE или CAI. Одни и те же настройки оптимизации (т. е. одно и то же значение лямбда) были применены к четырем факторам транскрипции — HAND2, GATA4, MEF2C и TBX5. На рисунке 3 исследуется влияние оптимизации на скорость трансляции. Оптимизация улучшила значения как MFE, так и CAI для всех факторов транскрипции, при этом для MEF2C наблюдались наибольшие изменения обоих параметров (рисунок 3A). К C-концу каждой конструкции был присоединен разделенный люминесцентный тег, которому предшествовал GS-линкер, и была синтезирована мРНК для всех четырех факторов транскрипции как в неоптимизированной, так и в оптимизированной формах. Чтобы убедиться, что каждая мРНК может транслироваться с образованием белка ожидаемой молекулярной массы, была использована бесклеточная система трансляции на основе лизата ретикулоцитов кролика3. Полученные белки разделяли методом вестерн-блоттинга, используя ферментативную субъединицу разделенного белка люциферазы и соответствующий субстрат для обнаружения разделенного люминесцентного тега. Вестерн-блоттинг показал, что оптимизация по-прежнему приводила к синтезу белков, соответствующих их ожидаемой молекулярной массе (рисунок 3B). Клетки HEK293 трансфецировали неоптимизированными или оптимизированными формами каждого фактора транскрипции, и в течение 18 ч проводили запись живых клеток. Для всех экспериментов продолжительностью 18 ч проводились измерения трех биологических повторностей, и в каждом повторном эксперименте использовались три технические повторности на образец. Оптимизация HAND2 (рисунок 3C) и GATA4 (рисунок 3D) не повлияла на экспрессию (согласно результатам непарного t-критерия для двух выборок), показав увеличение в 1,07 раза и снижение в 1,25 раза соответственно по сравнению с их неоптимизированными аналогами. В то же время оптимизация MEF2C (рисунок 3E) и TBX5 (рисунок 3F) привела к статистически значимому увеличению экспрессии с повышением AUC в 2,25 (P = 0,0486, n = 3, непарный t-критерий для двух выборок) и 1,72 раза (P = 0,0379, n = 3, непарный t-критерий для двух выборок) по сравнению с соответствующими неоптимизированными версиями. В соответствии с этим, различия наблюдаются не только в конечной экспрессии, но также в форме и скорости кривых экспрессии, что указывает на то, что анализ позволяет выявить изменения в динамике трансляции с течением времени. Чтобы определить, сохраняется ли это увеличение экспрессии в течение более длительного периода, клетки HEK293 трансфецировали мРНК MEF2C, и запись проводили в течение 72 ч (рисунок 3G). Как и в экспериментах продолжительностью 18 ч, проводились измерения трех биологических повторностей, и в каждом повторном эксперименте использовались три технические повторности на образец. Аналогично тому, что наблюдалось через 18 ч, оптимизированный MEF2C значительно увеличил экспрессию с улучшением AUC в 2,5 раза (P = 0,0061, n = 3, непарный t-критерий для двух выборок) по сравнению с неоптимизированной версией. Несмотря на существенное увеличение экспрессии при оптимизации, эти результаты показывают, что в данном случае оптимизация не предотвращает распад в течение 72 ч, так как обе формы MEF2C демонстрируют схожие наклоны кривых, начиная с 24 ч. Этот распад, вероятно, обусловлен линейной деградацией мРНК и/или делением клеток. В совокупности эти результаты демонстрируют потенциал алгоритмов дизайна мРНК для улучшения экспрессии мРНК; однако они подчеркивают, что оптимизация должна проводиться с учетом особенностей конкретного интересующего белка (POI).

figure-results-1
Рисунок 1: Схема синтеза мРНК и анализа с использованием расщепленного люминесцентного тега в клетках HEK293. Для проведения IVT (транскрипции in vitro) для анализа с расщепленным люминесцентным тегом убедитесь, что плазмида содержит промотор РНК-полимеразы (T7 или SP6), 5’- и 3’-UTR, а также кодирующие последовательности исследуемого белка, слитого с короткой субъединицей люциферазы HB (HiBiT). Плазмида линеаризуется рестриктазой с одним сайтом разреза, что обеспечивает создание матрицы для Poly T PCR, которая в дальнейшем используется в качестве матрицы для IVT. Синтезированная мРНК образует комплексы с липосомами и реверс-трансфицируется в клетки HEK293, конститутивно экспрессирующие большую субъединицу люциферазы (LB); после этого клетки можно сразу поместить в планшетный ридер для регистрации сигнала в режиме реального времени. После завершения эксперимента проводится анализ данных для нормализации и последующей статистической обработки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Четырехкратное снижение концентрации кэпирующего реагента обеспечивает экспрессию eGFP, сравнимую с экспрессией при полной концентрации. (A) Кинетический анализ живых клеток HEK293, трансфецированных мРНК eGFP с различными концентрациями кэпирующего реагента, MYL3 или Mock; данные нормированы по t0; точки представляют собой среднее значение как минимум трех биологических повторностей для каждой временной точки. (B) Кратность изменения AUC кривых за 18-часовой период для как минимум трех биологических повторностей была получена путем нормировки по контрольному образцу MYL3 и сравнена с помощью однофакторного ANOVA с тестом Тьюки для множественных сравнений. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM), где каждая точка представляет среднее значение биологической повторности. ***P < 0.001. (eGFP – усиленный зеленый флуоресцентный белок; AUC – площадь под кривой; RLU – относительные единицы люминесценции) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Оптимизация последовательности улучшает трансляцию мРНК в зависимости от интересующего белка (POI). (A) Оптимизация последовательности мРНК с помощью LinearDesign привела к снижению значений минимальной свободной энергии (MFE) и увеличению индекса адаптации кодонов (CAI) для каждого фактора транскрипции. (B) Реакции в лизате ретикулоцитов кролика (RRL) проводили в течение 120 мин с мРНК, кодирующей неоптимизированный и оптимизированный HAND2, GATA4, MEF2C, TBX5, или без РНК. Полученные белки подвергали вестерн-блоттингу и детектировали методом хемилюминесценции путем инкубации мембраны с ферментативной субъединицей системы сплит-люциферазы и соответствующим субстратом. Кинетический анализ живых клеток в клетках HEK293, трансфецированных неоптимизированным или оптимизированным HAND2 (C), GATA4 (D), MEF2C (E) или TBX5 (F), а также MYL3 и Mock. Данные были нормализованы по t0, точки представляют среднее значение трех биологических повторностей для каждой временной точки. Кратность изменения площади под кривой (AUC) для 18-часового временного интервала трех биологических повторностей была получена путем нормализации по референсному образцу MYL3 и сравнена с помощью непарного t-критерия с поправкой Уэлча. Данные представлены как среднее ± SEM, где каждая точка представляет среднее значение биологической повторности. *P < 0.05. (G) Кинетический анализ живых клеток в клетках HEK293, трансфецированных неоптимизированным или оптимизированным MEF2C, MYL3 и Mock; данные нормализованы по t0, точки представляют среднее значение трех биологических повторностей для каждой временной точки. Кратность изменения AUC кривых для 72-часового временного интервала трех биологических повторностей была получена путем нормализации по референсному образцу MYL3 и сравнена с помощью непарного t-критерия с поправкой Уэлча. Данные представлены как среднее ± SEM , где каждая точка представляет среднее значение биологической повторности. **P < 0.01. (MFE – минимальная свободная энергия; CAI – индекс адаптации кодонов; RRL – лизат ретикулоцитов кролика; AUC – площадь под кривой, RLU – относительные единицы люминесценции) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Область терапии на основе мРНК стремительно развивалась в последние годы, что подчеркивает важность дизайна и оптимизации последовательностей как критического этапа процесса разработки. Значительные усилия были сосредоточены на создании вычислительных инструментов для прогнозирования наиболее эффективных структур и составов РНК, при этом особое внимание уделялось оптимизации последовательностей8,9. Несмотря на мощность этих инструментов, экспериментальная валидация таких дизайнов по-прежнему остается неотъемлемой частью рабочего процесса. Однако эта валидация в значительной степени опиралась на репортерные белки, включая GFP7, NanoLuc8 и спайковый белок SARS-CoV-29 , которые сами по себе являются чрезвычайно стабильными и легко транслируемыми белками. Чтобы преодолеть это ограничение, в рабочий процесс изучения динамики трансляции мРНК, транскрибированной in vitro в клетках HEK293, была внедрена система расщепленной люциферазы, обеспечивающая временное разрешение3, которая продемонстрировала ограниченность использования репортерных белков при детектировании изменений трансляции после модификации мРНК. Статья к данному методу описывает этапы, необходимые для проведения этого анализа, иллюстрирует возможность миниатюризации реакции IVT и снижения концентрации 5’-кэпа без последствий для трансляции, что позволяет сократить затраты. Опираясь на наши предыдущие наблюдения, мы подчеркиваем, что для достижения повышенной экспрессии требуется подход к оптимизации последовательности мРНК, зависящий от конкретного POI.

Как описано здесь, анализ с использованием разделенного люминесцентного тега представляет собой относительно простой рабочий процесс, позволяющий проводить измерения трансляции мРНК со средней пропускной способностью, что дает возможность исследовать временную экспрессию интересующего белка (POI) в режиме реального времени. Однако для получения надежных результатов необходимо учитывать ряд критических этапов и факторов. Во-первых, все последующие результаты зависят от качества мРНК, что начинается с этапа IVT (транскрипции in vitro) и деконтаминации используемого для этого оборудования. После синтеза ключевым моментом является хранение мРНК: после элюции ее следует содержать на льду, а после подтверждения размера мРНК — разделить на рабочие аликвоты во избежание повторного замораживания и оттаивания, храня мРНК при -80°C. Во-вторых, крайне важно правильно выбрать 96-луночный планшет, который должен оставаться неизменным между экспериментами. Для данного протокола убедитесь, что используется полностью белый 96-луночный планшет. Если требуется мониторинг морфологии клеток, можно использовать планшеты с белыми стенками и прозрачным дном; однако они дают гораздо более слабый сигнал, поэтому эти два типа планшетов нельзя использовать взаимозаменяемо. Было замечено, что при измерении трансляции одних и тех же мРНК в планшете с белыми стенками и прозрачным дном полученный люминесцентный сигнал был в 5 раз ниже, чем в параллельном эксперименте с полностью белыми стенками. Этот технический нюанс может быть значимым при оценке генов с низкой эффективностью трансляционной динамики. Помимо внесения несоответствий в данные, снижение сигнала может помешать обнаружению тонких различий, вызванных последовательностью мРНК или структурными изменениями. В-третьих, использование среды L-15 является ключевым для этого анализа, так как она обеспечивает жизнеспособность клеток в среде без добавления CO225, что дает гибкость в выборе используемого люминометра. Кроме того, использование среды L-15 без фенола снижает фоновый сигнал при измерении люминесценции. Наконец, культивирование и измерение люминесценции должны проводиться при 37°C (или в условиях культивирования, специфичных для вашего типа клеток). Проведение этого эксперимента при комнатной температуре существенно изменит результаты, так как скорость элонгации трансляции снизится26, в результате чего нормальная кинетика не будет наблюдаться.

Универсальность дизайна мРНК, транскрибируемой in vitro, может быть перенесена на процесс синтеза, что позволяет вносить многочисленные модификации. Как было замечено, концентрацию 5’-кэпа можно снизить в 4 раза, при этом достигая сопоставимого уровня экспрессии, что позволяет исследователям сократить расходы. Хотя эффективность кэпирования после IVT не измерялась напрямую, увеличение доли некэпированной мРНК в пуле IVT привело бы к снижению сигнала, как это было продемонстрировано для некэпированной мРНК; однако этого не наблюдалось. Кроме того, учитывая, что eGFP является относительно небольшим белком массой всего 27 kDa, такая модуляция концентрации кэпа должна легко переноситься на более крупные гены, так как после IVT будет меньше транскриптов, требующих кэпирования. Существует множество аналогов кэпа с различными модификациями метилирования, которые влияют на иммуногенность3 и экспрессию белка27. Кроме того, процесс кэпирования может проводиться ко-транскрипционно (как показано здесь) или пост-транскрипционно с использованием вируса Vaccinia, что обеспечивает 100% эффективность кэпирования28, но требует дополнительных этапов очистки. Для производства мРНК в лабораторном масштабе обычно используются очищающие колонки, так как они работают быстро и эффективно, но стоят дорого. Более дешевым и универсальным подходом является осаждение хлоридом лития, которое, хотя и занимает больше времени, позволяет пользователю концентрировать мРНК и не ограничивает выход емкостью связывания колонки; следовательно, этот метод подходит для масштабирования. Как и в случае с очищающими колонками, этот подход не удаляет полностью двухцепочечную РНК и усеченные фрагменты РНК, которые вызывают иммуногенность29. Подобно 5’-кэпу, включение поли(А)-хвоста может быть осуществлено и другими способами, отличными от описанного здесь. Аналогично введению хвоста с помощью ПЦР, плазмидную ДНК можно модифицировать таким образом, чтобы она содержала поли(А)-хвост; однако такие длинные участки могут подвергаться рекомбинации, что приводит к образованию гетерогенных и укороченных поли(А)-последовательностей. Тем не менее, сегментация поли(А) — вставка гетеронуклеотидных спейсеров — позволила минимизировать эти эффекты30,31. В качестве альтернативы поли(А)-хвост может быть создан с помощью матрично-независимой поли(А)-полимеразы, что позволяет получать более длинные поли(А)-хвосты32, но с риском возникновения гетерогенности, влияющей на регуляторные требования33.

Хотя описанный метод анализа с использованием разделенного люминесцентного тега чрезвычайно эффективен для измерения экспрессии белков экзогенно доставленной mRNA, существуют некоторые ограничения, которые следует учитывать в зависимости от целей исследования. Во-первых, необходимо создать клеточную линию, конститутивно экспрессирующую одну половину разделенной люциферазы. Хотя такие линии можно приобрести в готовом виде, в настоящее время они доступны только для клеток HEK293. Если создание стабильной линии на интересующем типе клеток затруднено, существует метод литического анализа, который, по нашим данным, демонстрирует аналогичный результат для HEK293, эмбриональных стволовых клеток человека и дифференцированных кардиомиоцитов3. Однако временная точка, выбранная для литического анализа в этом ранее опубликованном исследовании3, была определена на основании данных по живым клеткам HEK293. Во-вторых, данный анализ обеспечивает временное разрешение в живых клетках, но не позволяет получить пространственное разрешение в живых клетках, что может быть важно для некоторых исследователей. Тем не менее, доступно первичное антитело, которое хорошо работает при флуоресцентной иммуноцитохимии против короткого пептидного тега люциферазы, используемого в этих экспериментах, что позволяет проводить пространственный анализ транслированного POI. Кроме того, микроскоп с возможностью люминесцентной визуализации мог бы обеспечить данные с разрешением до одной клетки. Подходом, предоставляющим пространственно-временную информацию, является SunTag, который измеряет активную трансляцию и локализацию с помощью визуализации живых клеток за счет взаимодействий между меченными GFP scFv и пептидными эпитопами14,34. Однако требуется 24 тандемных повтора этих эпитопов, что потенциально может исказить трансляцию, при этом рабочий процесс характеризуется относительно низкой пропускной способностью. В-третьих, разделенный люминесцентный тег позволяет измерить количество mRNA, но не в живых клетках. В нашей предыдущей работе3 была проведена qRT-PCR экстрагированной РНК с использованием праймеров, специфичных для экзогенно доставленного транскрипта, что подтвердило уровни mRNA для оценки эффективности трансфекции между конструктами и их распада между временными точками. Другим подходом стало использование нозерн-блоттинга для измерения стабильности mRNA35. Однако оба этих подхода трудоемки и не позволяют проводить непрерывные измерения. В настоящее время не существует метода, который позволял бы одновременно измерять трансляцию и количество mRNA в живых клетках, что открывает потенциальные возможности для развития методов анализа в этой области.

Система расщепленной люциферазы изначально применялась для изучения динамики белков, однако здесь становится очевидным, что данный анализ имеет важное значение и для других областей исследований. Поскольку мРНК-терапия находится на переднем крае новых подходов к генной терапии, этот метод идеально подходит для того, чтобы позволить исследователям характеризовать экспрессию своего потенциального терапевтического агента и оптимизировать ее для повышения уровня экспрессии. Как упоминалось ранее, оптимизация кодонов стала мощным новым инструментом в дизайне мРНК благодаря разработке множества инструментов8,9,36. При применении унифицированного подхода к оптимизации последовательности четырех факторов транскрипции улучшились как MFE, так и CAI для всех генов, однако повышенная экспрессия наблюдалась только у MEF2C и TBX5. Примечательно, что, обеспечивая обнаружение различий в экспрессии, возникающих исключительно из-за синонимичных вариаций кодирующей последовательности, этот подход предоставляет уникальную платформу для изучения эффективности трансляции в живых клетках с высоким временным разрешением. Эти результаты показывают, что для достижения повышенной экспрессии при оптимизации последовательности необходимо учитывать исходное содержание GC, использование кодонов и вторичную структуру РНК в зависимости от конкретного POI. Хотя может потребоваться тестирование большего количества конструкций, анализ с использованием расщепленного люминесцентного тега обладает потенциалом для высокопроизводительного анализа с целью выявления оптимального кандидата для POI. Кроме того, как было показано ранее3, этот анализ позволяет измерять эффекты воздействия на любой последовательный или структурный компонент мРНК, что дополнительно расширяет возможности его применения. Помимо исследования изменений мРНК, анализ с расщепленным люминесцентным тегом может быть использован в исследованиях систем доставки и рецептур препаратов. Даже с учетом улучшений 5’-кэпов и использования модифицированных нуклеотидов, экзогенно вводимая мРНК требует системы упаковки для предотвращения деградации и обеспечения клеточного захвата37. Хотя липидные наночастицы38, внеклеточные везикулы39 и биомиметики40 находятся на передовой доставки мРНК, дальнейшие разработки все еще необходимы. Инкапсуляция мРНК с расщепленным люминесцентным тегом в любой из этих носителей позволит охарактеризовать эффективность их доставки и даст возможность исследователям тестировать модифицированные носители с производительностью от средней до высокой. Помимо исследований, сосредоточенных на трансляции, анализ с расщепленным люминесцентным тегом легко применим в фундаментальной биологии. Будь то оценка влияния нарушений последовательности и структурных элементов на трансляцию мРНК, вмешательство в функцию трансляционного аппарата или исследование протеасомы, система расщепленного люминесцентного тегирования представляет собой привлекательный вариант.

В целом, описанная здесь система с разделенным люминесцентным тегом представляет собой гибкий и надежный метод анализа для временного мониторинга экспрессии белков под управлением синтетической мРНК в качестве показателя динамики трансляции. Внедрение анализа на живых клетках позволяет преодолеть многие из прежних ограничений в области трансляции мРНК и раскрывает важную информацию о динамике синтеза белков и деградации интересующего белка (POI). Поскольку транскрипты обладают различными регуляторными профилями и профилями экспрессии, крайне важно охарактеризовать терапевтический POI, что позволит продолжить развитие терапевтических средств на основе мРНК и их внедрение в клиническую практику.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Лауру Ицхаки за клеточную линию HEK293 LgBiT. Данная работа была поддержана грантом на проект и трансляционной премией Британского фонда сердца (G114642 и G919651 для CHW), а также исследовательским грантом GenScript Life Science (CAPB).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислотаSigma-AldrichA6283Компонент буфера TAE
АгарозаSigma-AldrichA9539Гель-электрофорез
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BБиоанализатор, используемый для контроля качества мРНК
Люминометр CLARIOstar PlusBMG Labtech430-501S-FПланшетный ридер/люминометр, используемый для измерения люминесценции
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-71135'-кэп, используемый для IVT
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, пируватThermo Fisher Scientific41966029Среда, используемая для культивирования клеток HEK293-LgBiT
ДНКаза INew England BiolabsM0303Разрушает матричную ДНК после реакции IVT
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (PBS)Sigma-AldrichD8537Для промывки клеток и добавления в планшет для предотвращения испарения
ЭДТА, pH 8.0, без РНКазThermo Fisher ScientificAM9260Компонент буфера TAE
Бромистый этидийSigma-AldrichE1510Краситель для гель-электрофореза
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma-AldrichF7524Добавка к среде DMEM
Набор для высокопродуктивного синтеза РНК HiScribe T7New England BiolabsE2040Набор для транскрипции in vitro (IVT)
Среда Лейбовица L-15, без фенолового красногоThermo Fisher Scientific21083027Среда, используемая для культивирования HEK293-LgBiT во время измерений люминесценции
L-глутаминThermo Fisher Scientific25030-024Добавка к среде DMEM
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150Липидный реагент для трансфекции
Раствор для осаждения хлоридом литияThermo Fisher ScientificAM9480Альтернативный метод очистки мРНК после IVT
Набор Monarch Spin PCR & DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1130Набор для очистки после линеаризации плазмиды
Микрообъемный УФ-видимый спектрофотометр NanoDrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-WСпектрофотометр, используемый для количественного определения концентрации ДНК и мРНК
Субстрат для живых клеток Nano-Glo EndurazinePromegaN2570Субстрат для люминесценции, добавляемый в среду L-15 
Набор NucleoSpin RNA Cleanup KitMacherey-Nagel12708612Очистка мРНК после реакции IVT
96-луночный микропланшет Nunc MicroWell, Nunclon Delta-Treated, с плоским дномThermo Fisher Scientific136101Планшет, используемый для посева HEK293-LgBiT и последующих измерений
Среда Opti-MEM с пониженным содержанием сывороткиThermo Fisher Scientific31985062Среда, используемая для реакции трансфекции
Набор для высокоточной ПЦР PhusionNew England BiolabsE0553Набор для ПЦР
Маркер РНК RiboRuler High RangeThermo Fisher Scientific11883993Маркер РНК для гель-электрофореза
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020Спрей для деконтаминации РНКаз
TRIZMA BaseSigma-AldrichT6066Компонент буфера TAE
Раствор трипсин-ЭДТАSigma-AldrichT4174Реагент для диссоциации клеток
Сверхчистая дистиллированная вода, без ДНКаз/РНКазThermo Fisher Scientific10977035Используется для подготовки матрицы и для IVT

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA COVID-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-2615.
  2. Baden LR et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. N Engl J Med. 2021;384(5):403-416.
  3. Ascanelli C, Lawrence E, Batho CAP, Wilson CH. A flexible, high-throughput system for studying live mRNA translation with HiBiT technology. Nucleic Acids Res. 2025;53(11).
  4. Qin S et al. mRNA-based therapeutics: Powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):166.
  5. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  6. Sample PJ et al. Human 5' UTR design and variant effect prediction from a massively parallel translation assay. Nat Biotechnol. 2019;37(7):803-809.
  7. Leppek K et al. Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. Nat Commun. 2022;13(1):1536.
  8. Vostrosablin N et al. mRNAid, an open-source platform for therapeutic mRNA design and optimization strategies. NAR Genom Bioinform. 2024;6(1):lqae028.
  9. Zhang H et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 2023;621(7978):396-403.
  10. Chasse H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Res. 2017;45(3):e15.
  11. Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 2009;324(5924):218-223.
  12. Choe HK, Cho J. Comprehensive genome-wide approaches to activity-dependent translational control in neurons. Int J Mol Sci. 2020;21(5):1592.
  13. Cacioppo R, Lindon C. Immunoprecipitation of reporter nascent chains from active ribosomes to study translation efficiency. Bio Protoc. 2023;13(18):e4821.
  14. Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014;159(3):635-646.
  15. Pichon X et al. Visualization of single endogenous polysomes reveals the dynamics of translation in live human cells. J Cell Biol. 2016;214(6):769-781.
  16. Wu B, Eliscovich C, Yoon YJ, Singer RH. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 2016;352(6292):1430-1435.
  17. Dixon AS et al. Nanoluc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chem Biol. 2016;11(2):400-408.
  18. Schwinn MK et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chem Biol. 2018;13(2):467-474.
  19. Wang T et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Res. 2013;41(9):4743-4754.
  20. Balleza E, Kim JM, Cluzel P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nat Methods. 2018;15(1):47-51.
  21. Koker T, Fernandez A, Pinaud F. Characterization of split fluorescent protein variants and quantitative analyses of their self-assembly process. Sci Rep. 2018;8(1):5344.
  22. Hoare BL, Kocan M, Bruell S, Scott DJ, Bathgate RAD. Using the novel HiBiT tag to label cell surface relaxin receptors for BRET proximity analysis. Pharmacol Res Perspect. 2019;7(4):e00513.
  23. Boursier ME et al. The luminescent HiBiT peptide enables selective quantitation of G protein-coupled receptor ligand engagement and internalization in living cells. J Biol Chem. 2020;295(15):5124-5135.
  24. Winter GE et al. Drug development: Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 2015;348(6241):1376-1381.
  25. Leibovitz A. The growth and maintenance of tissue-cell cultures in free gas exchange with the atmosphere. Am J Hyg. 1963;78:173-180.
  26. Farewell A, Neidhardt FC. Effect of temperature on in vivo protein synthetic capacity in Escherichia coli. J Bacteriol. 1998;180(17):4704-4710.
  27. Mandell ZF et al. CleanCap M6 inhibits decapping of exogenously delivered IVT mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36(1):102456.
  28. Ensinger MJ, Martin SA, Paoletti E, Moss B. Modification of the 5'-terminus of mRNA by soluble guanylyl and methyl transferases from vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72(7):2525-2529.
  29. Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive, and diverse in character RNA-seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018;46(18):9253-9263.
  30. Trepotec Z, Geiger J, Plank C, Aneja MK, Rudolph C. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life. RNA. 2019;25(4):507-518.
  31. Spiewla T et al. Poly(A) tail segmentation improves the stability of the template DNA and increases the translatability of &lt;em&gt;in vitro.&lt;/em&gt; transcribed mRNA. bioRxiv. 2025:2025.10.21.683660.
  32. Martin G, Keller W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 1998;4(2):226-230.
  33. Weissman D. mRNA transcript therapy. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):265-281.
  34. Mateju D et al. Single-molecule imaging reveals translation of mRNAs localized to stress granules. Cell. 2020;183(7):1801-1812.e1813.
  35. Schwaller N, Karousis ED. Protocol for monitoring mRNA translation and degradation in human cell-free lysates. STAR Protoc. 2025;6(3):104073.
  36. Li Y et al. Deep generative optimization of mRNA codon sequences for enhanced mRNA translation and therapeutic efficacy. Nat Commun. 2025;16(1):9957.
  37. Pardi N et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. J Control Release. 2015;217:345-351.
  38. Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078-1094.
  39. Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020;367(6478).
  40. Yin M et al. Delivery of mRNA using biomimetic vectors: Progress and challenges. Small. 2024;20(43):e2402715.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitro5

Похожие статьи