Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Безклеточная трансляция мРНК in vitro у Drosophila Lysates

377 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70844

⸱

12 июня 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1mRNA and Cancer Laboratory, Subdirección de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología (INCan; National Institute of Cancer), 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Escuela de Ingeniería y Ciencias, Tecnologico de Monterrey

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы подробно рассказываем о том, как готовить лизаты и выполнять in vitro перевод с использованием эмбрионов Drosophila .

Аннотация

Трансляция мРНК in vitro без клеток сыграла ключевую роль в понимании процесса синтеза белков во время экспрессии генов у эукариот. Разработка лизатов из различных систем для in vitro трансляции сыграла ключевую роль в изучении ролей большинства компонентов трансляционного механизма и в анализе многих этапов процесса синтеза белков. Различные аспекты трансляционного и трансляционного контроля изучались с помощью лизат Drosophila melanogaster. В этой статье представлены подробные протоколы для подготовки синтетических мРНК-шаблонов, выращивания крупномасштабных живых культур мух, подготовки лизатов, способных к трансляции, из эмбрионов Drosophila, а также проведения бесклеточных реакций in vitro . Этот протокол подходит для любого вида рода Drosophila — melanogaster, virilis, pseudoscura, grimshawi, hydei и др. Далее мы сравниваем этот протокол с другими системами трансляции и обсуждаем ограничения, критические шаги и устранение неполадок. Включены репрезентативные результаты для оценки эффективности и воспроизводимости протокола. Наконец, мы обсуждаем потенциальные применения в биотехнологиях и исследованиях.

Введение

Более века Drosophila доказала, что является мощным, генетически управляемым модельным организмом для изучения многих биологических явлений и молекул, включая трансляционный контроль и трансляционныймеханизм 1,2,3,4. Трансляция дрозофилы, свободная от клеток, in vitro, стала мощным инструментом для изучения синтеза белков, поскольку способна воспроизводить многие события, наблюдаемые in vivo. Таким образом, Drosophila является идеальной системой для открытия новых функций и молекул, выполняющих трансляционный и трансляционный контроль. Ранние исследования установили in vitro, трансляционно компетентную систему у мухородных членистоногих Artemia salina5, а позже — у Drosophila hydei6.

Позже у Drosophila melanogaster были разработаны лизаты, реагирующие на экзогенные мРНК. Большинство исследований трансляции Drosophila in vitro проводились на эмбрионах разных возрастов, хотя некоторые варианты буфера реакции трансляции использовались разными исследовательскими группами. Для сравнения, в таблице 1 приведены различные изучаемые явления и условия реакции сдвига. Помимо эмбрионов, были разработаны протоколы безклеточной трансляции in vitro с использованием ооцитов Drosophila 10,22,23,24,25,26 и культивированных лизатов клеток Шнайдера или Kc (17,27,28,29,30,31,32). Описание компонентов, необходимых для in vitro трансляции, а также сравнение лисатов разных видов приведены в ссылках33,34.

Хотя процесс трансляции мРНК сохраняется у эукариот, значительные различия между таксонами в основном наблюдаются на этапе инициации трансляции, когда различные молекулы подавляют или способствуют трансляции на протяжении всего развития в таксонно-специфическом или видовом видеспособе 35,36. Этот протокол очень подходит для изучения трансляции мРНК у насекомых на протяжении всего развития, для чего лизаты из филогенетически отдалённых метазоев нельзя, включая коммерческие лизаты из пшеницы или кролика. Действительно, этот протокол может повторить трансляционные события, происходящие во время эмбриогенеза, что невозможно при использовании лизатовяйцеклетки 23. На сегодняшний день не проводилось сравнения между системами эмбрионов, яйцеклетки и культивируемых клеток дрозофилы. Добавление посттрансляционных модификаций к белкам, синтезируемым in vitro, является ограничением этого протокола в его текущем состоянии. Кроме того, этот метод не даёт готовых количества белка по сравнению с методами получения рекомбинантных белков у бактерий.

Здесь мы описываем подробные протоколы для регулярного выращивания крупномасштабных клеток мух Drosophila , подготовки синтетических мРНК-шаблонов, подготовки лизатов, способных к трансляции, из эмбрионов и проведения бесклеточных in vitro трансляционных анализов. Таблица материалов показывает реагенты, требуемые на протяжении всего протокола.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1) Конструкция шаблонных плазмид для транскрипции in vitro

  1. Выберите плазмиды, содержащие 5' нетранслированную область (UTR), репортерный цистрон, 3' UTR и поли(A) хвост ниже промотора РНК-полимеразы T7, T3 или SP6. Убедитесь, что каждая конструкция содержит уникальный рестрикционный участок непосредственно ниже хвоста поли(A) для линеаризации плазмид перед транскрипцией (см. рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сайт рестрикционного фермента должен быть тщательно выбран так, чтобы сайт распознавания находился вне транскрибируемой последовательности или позволял линеаризованной ДНК заканчиваться на A. Кроме того, фермент ограничения должен оставлять тупой или 5-футовый свис на 3-футовом конце шаблона. Навесы 3' могут привести к появлению аномальных транскрипционных продуктов. Если используется фермент с выступом 3 фута, фрагмент следует притупить перед использованием.
  2. Проверяйте все конструкции с помощью секвенирования перед использованием их в качестве шаблонов для транскрипции in vitro .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого рабочего процесса использовались репортерские конструкции Firefly люциферазы (FLuc) с хвостом poly(A)71 . Конструкции FLuc производятся на основеpLUC-кассеты 12. Информация о векторах и наборах приведена в Таблице материалов.

2) Транскрипция in vitro капсулированных и полиаденилированных мРНК

  1. Линеаризуйте каждую конструкцию плазмиды с помощью уникального рестрикционного участка ниже хвоста poly(A) (здесь KpnI).
  2. Разрешимо линеаризованную ДНК с помощью электрофореза 1%-агарозного геля при 100 В в течение 1 часа.
  3. Гель-экстракция ДНК и проверка её целостности и правильной линеаризации с помощью электрофореза с помощью агарозного геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Линеаризованную ДНК гелем очищать не обязательно — если ДНК полностью разрезана, то достаточно очистки колонки или феноловой экстракции/ЭТОГ-преципитации.
  4. Транскрипцируйте очищенную линеаризованную ДНК с помощью набора для транскрипции in vitro согласно инструкциям производителя. Включите в транскрипционную реакцию аналог 5' капсулы для стабилизации РНК и стимуляции трансляции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Функциональный аналог капса, такой как m7G(5′)ppp(5′)G РНК, поддерживает стабилизацию транскрипта и стимуляцию трансляции. Нефункциональный аналог конденсатора, такой как G(5′)ppp(5′)A, поддерживает стабилизацию транскрипта, но не стимуляцию трансляции. Этот ингибитор трансляции используется при трансляции бицистронных транскриптов для проверки наличия внутренних входовых сайтов рибосомы (IRES), управляющих трансляцией второгоцистрона 7. Для проверки зависимости поли(A)-хвоста её можно удалить в шаблонной плазмиде до проведения транскрипции.
  5. Обрабатывайте все транскрипционные реакции ДНКазой без РНаз, чтобы удалить шаблон ДНК после транскрипции согласно инструкциям производителя. Все наборы для транскрипции in vitro обеспечивают ДНКазу без РНаз.
  6. Очищайте транскрипт с помощью литиево-хлоридного осадка или очистки РНК на основе колонок согласно инструкциям производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все наборы для транскрипции in vitro содержат реагенты с хлоридом лития.
  7. Измерить очищенную транскрипт с помощью спектроскопии и оценить целостность мРНК с помощью 1%-агарозного геля электрофореза при 100 В в течение 1 часа.
  8. Аликвотируйте мРНК и храните при -70 °C до использования.

3) Регулярное поддержание крупномасштабной культуры дрозофил

  1. Используйте референсный штамм Drosophila melanogaster Oregon-R.
  2. Готовьте корм для мух согласно установленному рецепту справочного центра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Авторы использовали рецептNo37 Bloomington Drosophila Stock Center в качестве справочника по приготовлению пищи. Подробности этого рецепта приведены в таблице 237. Рисунок 2 показывает общий рабочий процесс — от сбора эмбрионов до количественной оценки активности люциферазы.
  3. Поставьте кубическую или цилиндрическую акриловую клетку примерно 1 м в длину и 50 см в диаметре.
  4. Сделайте отверстие диаметром примерно 30 см в верхней части клетки и запечатайте его сеткой (рисунок 3).
  5. Положите влажную бумагу поверх сетки, чтобы мухи подавались водой, и заменяйте влажную бумагу каждый день (рисунок 3).
  6. Держите переднюю часть клетки открытой и накрытой тканью, чтобы обеспечить доступ внутрь клетки. Положите акрил на заднюю сторону пластиковой клетки, полностью запечатанный.
  7. Усилите мухолизм перед сбором эмбрионов и поместите ~1 000 молодых мух внутри клетки. Постоянно поддерживайте клетку мух при температуре 22–25 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько клеток для мух одинаковых размеров и плотности мух могут поддерживаться одновременно. Мухи откладывают яйца примерно 15 дней и начинают умирать примерно на 20-й день.
  8. Кормите мух ежедневно тарелками с соком агар-фрукта, сверху ложкой регидратованных пекарских дрожжей с 200 мкл уксусной кислоты или уксуса.
  9. Для создания следующего поколения мух соберите несколько пластин эмбрионов возрастом 0–12 часов. Поместите эмбрионы в 22 см × 17 см × пластиковые ящики размером 10 см с кормом для мух на глубину 3 см. Убедитесь, что в коробках есть отверстие, запечатанное сеткой, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха и предотвратить выход личинок (рисунок 4). Добавьте сверху сухие активные дрожжи и дайте эмбрионам расти при 25 °C.
  10. Через 3 дня положите сложенную бумагу высотой 5 см в коробки, чтобы личинки третьего возраста могли подняться и превратиться в куколки.
  11. Через 10 дней поместите в клетку ящики с только что вылупившимися взрослыми мухами. Позвольте мухам выйти из коробок и спариться в клетке на 2 дня.
  12. Чтобы получить эмбрионы определённого возраста для приготовления лизата, аккуратно откройте клетку и поместите тарелки с агаровым соком внутри клетки для необходимого периода откладки яиц.
  13. Снимите тарелки и соберите яйца с помощью кучи решет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для лизатов эмбрионов возрастом от 0 до 12 часов в клетку в 8:00 утра поместите две тарелки с агаровым соком и вынимите их в 20:00 для сбора эмбрионов.
    1. Собирайте эмбрионы для приготовления лизата в период с 3 по 10 день после вылупления взрослых мух.
    2. Параллельно собирайте эмбрионы на 2–4 дни и создайте новое поколение мух в коробках с кормом, как описано выше.

4) Подготовка трансляционных лизатов из эмбрионов Drosophila возрастом 0–12 ч.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не включает микрококковую обработку нуклеазой. Этот шаг был опущен, чтобы избежать возможного разрушения экзогенной репортерной мРНК при неполной инактивации нуклеазы. Фоновая трансляция должна отслеживаться в каждом эксперименте с помощью контроля без мРНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод основан на ранее описанныхпротоколах 7, 12, 14, 15, 16, 17, 22.

  1. Подготовьте буфер для лизиса эмбриона, как описано в Таблице 2 , и храните его при -20 °C в аликвотах по 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: разморозьте каждый аликвот до 2 раз для немедленного использования.
  2. Собирайте эмбрионы с помощью сита.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный протокол использует эмбрионы возрастом от 0 до 12 h, но для приготовления лизата также могут быть подходящи и другие возрасты эмбрионов.
  3. Тщательно промывайте эмбрионы водопроводной водой, а затем с буфером для эмбрионов с 0,9% NaCl + 0,03% Triton X-100.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы можно хранить при 4 °C до 24 часов до обработки.
  4. Дехорионатные эмбрионы в течение 5 минут в 50% эмбрионном буфере и 50% домашнего отбеливателя (гипохлорит натрия [NaOCl] 4–6% и гидроксид натрия [NaOH] 0,02–0,1%).
    ВНИМАНИЕ: При обращении с отбеливателем используйте перчатки и прозрачные пластиковые очки.
  5. Тщательно мойте водопроводной водой. Высушите эмбрионы на бумаге и взвесьте их.
  6. Перенесите упакованные эмбрионы в гомогенизатор для стеклянных тканей на льду. Добавьте 1 мл буфера для лизиса эмбриона на 1 г эмбрионов. Однородно изобразите эмбрионы на льду с помощью 20 ударов.
  7. Перенесите гомогенат в микроцентрифугальные трубки объёмом 1,5 мл. Центрифуга при 15 900 × г в течение 20 минут при 4 °C.
  8. Восстановить межфазу в 50 мкл аликвотах на льду. Заморозьте аликвоты в жидком азоте и храните при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интерфаза представляет собой мутный жидкий раствор между верхней и нижней фазами. Верхняя фаза представляет собой слой сильно вязких непрозрачно-белых липид. Нижняя фаза представляет собой твёрдую гранулу.
    ВНИМАНИЕ: Избегайте загрязнения межфазного раствора из соседних фаз.
    ВНИМАНИЕ: При работе с жидким азотом используйте перчатки и прозрачные пластиковые очки.

5) Реакция перевода in vitro

  1. Настройте трансляционные реакции в пластине с 96 лунками или отдельных ПЦР-трубках объемом 0,2 мл на термоциклере ПЦР. Подготовьте каждую реакцию трансляции в итоговом объёме 17 мкл, включая 5 мкл эмбрионального лизата и оставшиеся компоненты реакции, описанные в таблице 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лизат эмбриона составляет 30% объема от общего объёма реакции.
  2. Если к реакции трансляции добавляются рекомбинантные белки, белок диализируют против pH 7,4 с гепес-кохом 20 мм. Выберите объём кассеты для диализа и порог молекулярного веса в зависимости от объёма образца и размера белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление рекомбинантных белков важно для изучения трансляционных репрессоров или дозозависимых тестов с факторами инициации. Избегайте добавления PBS в рекомбинантные белки, используемые в реакции трансляции. Поддерживайте уровень глицерина на уровне 5% или ниже в образце белка или реакции трансляции. Если возможно, избегайте добавления глицерина в реакцию.
  3. Денатурируйте мРНК, нагревая до 65 °C в течение 2 минут и быстро охлаждая на льду в течение 2 минут перед реакцией in vitro трансляции.
  4. Проведите трансляцию каждой мРНК в трёх экземплярах. Настройте реакцию следующим образом: 2,7 мкл реакционного коктейля (Таблица 2) + 5 мкл лизата эмбриона + мРНК (30 нг) + H20–17 мкл конечного объёма. В качестве базового мастер-микса следует реакционному коктейлю для одной реакции в таблице 2 и масштабируйте по количеству выполняемых реакций. Инкубировать реакцию при 25 °C в течение 60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: АТФ и ГТФ не добавляются отдельно в описанную здесь стандартную реакцию. В наших руках дополнение реакции дополнительным АТФ/ГТФ не улучшало выброс FLuc и снижало трансляцию в проверенных условиях. Поэтому реакция проводится с помощью энергорегенерирующей системы, описанной в таблице 2 , без дополнительного добавления нуклеотидов.
  5. Запрограммируйте термоциклер: начальный шаг — 5 минут при 4 °C, затем 60 минут при 25 °C и последний шаг — 10 минут при 4 °C.
  6. Остановить реакцию, добавив 20 мкл холодного 1× пассивного лизисного буфера. Поставьте реакцию на лёд ещё на 10 минут.
  7. Храните образцы при -20 °C или переходите к количественному анализу люциферазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь.

6) Количественное определение синтезированной люциферады

  1. Доведите реакции до комнатной температуры в течение 20 минут, прежде чем количественно оценивать активность FLuc.
  2. Доведите 10 мкл каждой реакции трансляции и 50 мкл субстрата люциферазы (не менее чем за 2 часа до использования) до комнатной температуры.
  3. Добавьте субстрат люциферазы в реакцию трансляции. Записывайте единицы относительной световой системы с помощью автоматического или ручного люминометра. Запрограммируйте люминометр на 10 показаний с интервалом в 1 секунду.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы провели реакции трансляции для анализа вариативности эффективности между шестью независимыми препаратами лизатов (то есть биологическими повторениями) с использованием эмбрионов возрастом 0–12 ч. Каждая такта представляет собой технический тройной экземпляр (рисунок 5). Аналогичная трансляционная эффективность наблюдалась, хотя и с некоторой вариабельностью. Мы также сравнили эффективность трансляции между эмбрионами разного возраста. Таким образом, мы пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Лизаты Drosophila для трансляции без клеток in vitro могут давать воспроизводимые результаты. Эмбрионы разного возраста и вариаций буферного состава использовались для изучения широкого спектра фундаментальных явлений в синтезе белка и его механизмах (Таблица 1). Здесь мы описали стандартный метод, подходящий для эмбрионов любого возраста для проведения исследований в точной и количественной форме (Таблица 1). Этот протокол пот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

N.B-Á и G.H. получили поддержку внутривузовой программы финансирования Национального института рака (Instituto Nacional de Cancerología, INCan), Мексика; D.E.V. является постдокторантом программы Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología et Innovacción (SECIHTI) «Estancias posdoctorales por México para la Formación y Consolidación de las y los Investigadores por México, 2022». Благодарим Фанниса Миссирлиса и Бети Осорио (CINVESTAV, Мексика) за мушки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Лист алюминиевой фольгиReynoldsN/AСтандартная домашняя алюминиевая фольга; любой эквивалентный коммерческий бренд приемлем.
Смесь аминокислотPromegaL4461N/A
Яблочный уксусHeinzN/AКоммерческий яблочный уксус (5% кислотности); любой эквивалентный бренд приемлем.
Яблочный или виноградный сокJumexN/AКоммерческий виноградный сок; или любой эквивалентный коммерческий бренд.
Бактериологический агарMerck/Sigma-Aldrich9002-18-0N/A
Борная кислота (H3BO3)Merck/Sigma-AldrichB6768BioReagent, молекулярно-биологический грейд, ≥99.5%, порошок; используется для приготовления буфера TBE.
Кап: антиобратная капа (ARCA): 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G структура капирования РНКBioLabsS1411SN/A
Кап: аналог структуры капирования РНК m7G(5')ppp(5')GNew England BiolabsS1404SN/A
Кап: нефункциональный аналог капы G(5´)ppp(5´)ANew England BiolabsS1406N/A
Центрифужная пробирка (15 мл)Corning430053N/A
Комплект ингибиторов протеаз без ЭДТАRoche11836170001N/A
Креатинфосфокиназа из кроликаMerck/Sigma-AldrichC-3755N/A
Креатинфосфорная кислота, динатриевая сольMerck1120A47950N/A
Сухие дрожжиFleischmann'sN/AКоммерчески активные сухие дрожжи; любой эквивалентный бренд приемлем.
ДиэтилпирокарбонатMerck/Sigma-AldrichD575897%(NNR)
DNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchD4004N/A
Дикий тип штамма Drosophila melanogaster Oregon-RBloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USAhttps://bdsc.indiana.edu/index.html ; мутантные штаммы Drosophila melanogaster, а также штаммы дикого типа других видов Drosophila, таких как virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei и т.д. также предоставляются этим центром хранения.
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Merck/Sigma-AldrichE9884ACS реагент, 99,4-100,6%, порошок; используется для приготовления буфера TBE.
HEPESSigmaSLBH4583V99,5%(титрирование)
Перекись водорода (H2O2)EquateN/AКоммерческая (~2,5-3,5% раствор перекиси водорода; любой эквивалентный бренд приемлем.
Набор для транскрипции in vitro mMessage mMachine T7, T3 или SP6Thermo Fisher ScientificAM1344 и AM1348N/A
KOAc, также называемый KCH3COOMerck/Sigma-AldrichНесколькоN/A
Питательная среда Lb (леннокс)Merck/Sigma-AldrichL30221кг
Система анализа люциферазыPromegaE1501N/A
Набор для транскрипции in vitro MAXIscript T7, T3 или SP6InvitrogenAM1316 и AM1312N/A
Mg(OAc)2, также называемый Mg(CH3COO)2Merck/Sigma-AldrichНесколькоN/A
NaCl (хлорид натрия)J.T BakerB17W53ACS реагент
ОлигонуклеотидыЛюбая компанияN/AСпецифичные по последовательности.
Буфер пассивной лизиса 5XPromegaE1941N/A
Наконечники для пипеточных пипетокAxygenT-200-YЖелтые наконечники на 200 микролитров.
Наконечники для пипеточных пипетокAxygenT-1000-BСиние наконечники на 1 мл.
Наконечники для пипеточных пипетокAxygenT-300Прозрачные наконечники на 0,5-10 микролитров.
Пропионовую кислотуMerck/Sigma-Aldrich79-09-04ACS реагент, ≥99,5%, жидкость.
Стакальный стеклянный пестик PYREX® для одноразового тиссу гриндера 5 млPYREX®7724-5N/A
Набор для мини-препарации плазмид QIAprep spinQiagen27106N/A
Набор для мини-препарации геля QIAquick gelQiagen28704N/A
Лизат ретикулоцитов кролика (RRL)PromegaL4960N/A
Система анализа люциферазы Renilla (RLuc)PromegaE2820N/A
Ингибитор рибонуклеазы RNasinPromegaN2111AN/A
Набор для очист

Ссылки

  1. Marygold SJ, Attrill H, Lasko P. The translation factors of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 2017;11(1):65-74.
  2. Hernández G, Vazquez-Pianzola P. eIF4E as a molecular wildcard in metazoans RNA metabolism. Biol Rev Camb Philos Soc. 2023;98(6):2284-306.
  3. Kong J, Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet. 2012;13(6):383-94.
  4. Bayer LV, Milano SN, Bratu DP. The mRNA dynamics underpinning translational control mechanisms of Drosophila melanogaster oogenesis. Biochem Soc Trans. 2024;52(5):2087-99.
  5. Filipowicz W, et al. A protein binding the methylated 5′-terminal sequence, m7GpppN, of eukaryotic messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(5):1559-63.
  6. Sondermeijer PJA, Lubsen NH. Heat-shock peptides in Drosophila hydei and their synthesis in vitro. Eur J Biochem. 1978;88(2):331-9.
  7. Hernández G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA. 2004;10(11):1783-97.
  8. Zapata JM, Martínez MA, Sierra JM. Purification and characterization of eukaryotic polypeptide chain initiation factor 4F from Drosophila melanogaster embryos. J Biol Chem. 1994;269(27):18047-52.
  9. Maroto FG, Sierra JM. Purification and characterization of mRNA cap-binding protein from Drosophila melanogaster embryos. Mol Cell Biol. 1989;9(5):2181-90.
  10. Andrews S, Snowflack DR, Clark IE, Gavis ER. Multiple mechanisms collaborate to repress nanos translation in the Drosophila ovary and embryo. RNA. 2011;17(5):967-77.
  11. Smibert CA, et al. Smaug, a novel and conserved protein, contributes to repression of nanos mRNA translation in vitro. RNA. 1999;5(12):1535-47.
  12. Gebauer F, et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5′ and 3′ UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail. EMBO J. 1999;18(21):6146-54.
  13. Pamudurti NR, et al. Translation of circRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.e7.
  14. Vázquez-Pianzola P, Hernández G, Suter B, Rivera-Pomar R. Different modes of translation for hid, grim and sickle mRNAs in Drosophila. Cell Death Differ. 2007;14(2):286-95.
  15. Hernández G, et al. Two functionally redundant isoforms of Drosophila eIF4B are involved in cap-dependent translation, cell survival and proliferation. Eur J Biochem. 2004;271(14):2923-36.
  16. Hernández G, et al. Functional analysis of the AUG initiator codon context reveals novel conserved sequences that disfavor mRNA translation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2024;52(3):1064-79.
  17. Tuschl T, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999;13(24):3191-7.
  18. Scott MP, Storti RV, Pardue ML, Rich A. Cell-free protein synthesis in lysates of Drosophila melanogaster cells. Biochemistry. 1979;18(8):1588-94.
  19. Clark IE, Wyckoff D, Gavis ER. Synthesis of the posterior determinant Nanos is spatially restricted by a novel cotranslational regulatory mechanism. Curr Biol. 2000;10(20):1311-4.
  20. Jeske M, et al. Rapid ATP-dependent deadenylation of nanos mRNA in a cell-free system from Drosophila embryos. J Biol Chem. 2006;281(35):25124-33.
  21. Jeske M, Moritz B, Anders A, Wahle E. Smaug assembles an ATP-dependent stable complex repressing nanos mRNA translation at multiple levels. EMBO J. 2011;30(1):90-103.
  22. Castagnetti S, Hentze MW, Ephrussi A, Gebauer F. Control of oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila ovaries. Development. 2000;127(5):1063-8.
  23. Gebauer F, Hentze MW. Studying translational control in Drosophila cell-free systems. Methods Enzymol. 2007;429:23-33.
  24. Hernández G, et al. Mextli is a novel eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein that promotes translation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2854-64.
  25. Lie YS, Macdonald PM. In vitro translation extracts prepared from Drosophila ovaries and embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2000;270(2):473-81.
  26. Peng Y, Gavis ER. The Drosophila hnRNP F/H homolog Glorund recruits dFMRP to inhibit nanos translation elongation. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):7067-83.
  27. Sanders MM, Triemer DF, Olsen AS. Regulation of protein synthesis in heat-shocked Drosophila cells: soluble factors control translation in vitro. J Biol Chem. 1986;261(5):2189-96.
  28. Storti RV, Scott MP, Rich A, Pardue ML. Translational control of protein synthesis in response to heat shock in Drosophila melanogaster cells. Cell. 1980;22(3):825-34.
  29. Krüger C, Benecke BJ. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981;23(2):595-603.
  30. Zhao F, Yu CH, Liu Y. Codon usage regulates protein structure and function by affecting translation elongation speed in Drosophila cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(14):8484-92.
  31. Roy G, et al. The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1143-54.
  32. Wakiyama M, Yokoyama S. Posttranscriptional control of protein synthesis in Drosophila S2 cell-free system. Methods Mol Biol. 2014;1118:257-66.
  33. Spirin AS, Swartz JR. Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods. In: Spirin AS, Swartz JR, editors. Cell-free protein synthesis. Weinheim: Wiley-VCH; 2008. p. 1-34.
  34. Gregorio NE, Levine MZ, Oza JP. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protoc. 2019;2(1):24.
  35. Hernández G, Altmann M, Lasko P. Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2010;35(2):63-73.
  36. Hernández G, Proud C, Preiss T, Parsyan A. On the diversification of the translational apparatus across eukaryotes. Comp Funct Genomics. 2012;2012:256848.
  37. Lakovaara S. Malt as a culture medium for Drosophila species. Drosoph Inf Serv. 1969;44:128.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Бесклеточная трансляциятрансляция in vitroсинтез белкатрансляционный аппаратсинтетические мРНК-матрицытрансляционный контрольэмбрионы Drosophilaпротокол трансляции
Безклеточная трансляция мРНК in vitro у Drosophila Lysates
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.