Недорогой рабочий процесс на основе DeepLabCut без маркеров для анализа спонтанной походки и передвижения у свободно движущихся мышей

Краткое содержание

Мы представляем недорогой, без маркеров рабочий процесс с использованием DeepLabCut для количественной оценки спонтанной походки и передвижения у свободно движущихся мышей. Этот протокол интегрирует видеозапись с одной камеры, безмаркерное отслеживание анатомических ориентиров и извлечение пространственно-временных локомоторных параметров, обеспечивая неинвазивную и доступную основу для анализа моторного поведения без специализированного оборудования.

Аннотация

Походка — широко используемый функциональный биомаркер для обнаружения моторных изменений при различных заболеваниях и состояниях, поскольку он отражает изменения в координации, силе, равновесии и сенсомоторной интеграции. Однако традиционные методы анализа походки на животных часто требуют дорогого оборудования, сложных установок или инвазивных процедур, способных изменить естественное поведение. Здесь мы представляем недорогой, без маркеров рабочий процесс, основанный на DeepLabCut — открытом программном обеспечении для оценки поз, предназначенный для количественного анализа походки и спонтанного передвижения у свободно движущихся мышей. Метод основан на видеосъёмке с помощью одной камеры, безмаркерном отслеживании анатомических ориентиров и извлечении пространственно-временных локомоторных параметров без необходимости использования физических маркеров или специализированного оборудования. Для демонстрации применимости протокола он был реализован в тройной трансгенной модели болезни Альцгеймера (3xTg-AD) как репрезентативный пример применения. Такой подход сохраняет свободное движение и минимизирует стресс, связанный с облегчением, позволяя неинвазивно оценивать моторное поведение. Протокол совместим со стандартными средами поведенческого тестирования. В целом этот метод предоставляет доступную и неинвазивную основу для количественного анализа походки и передвижения в доклинических исследованиях.

Введение

Походка — это сложный моторный процесс, возникающий в результате взаимодействия моторной, сенсорной и когнитивной систем в реальном времени, требующий координированной обработки сенсорной обратной связи, осанки, моторного планирования и активации мышц для создания стабильного, адаптивного движения¹. Из-за интегративного характера изменения походки всё чаще признаются как функциональные показатели неврологических нарушений как в клинической практике, так и в экспериментальных исследованиях. В моделях людей и животных анализ походки позволяет выявлять изменения в подвижности, риске падения, хрупкости и функциональной способности, и был предложен в качестве биомаркера прогрессирования заболевания и эффективности вмешательства при различных ^{состояниях 2,3,4}.

В фундаментальных исследованиях, особенно на мышиных моделях, оценка спонтанной походки и движущей активности представляет собой широко используемую стратегию для характеристики моторных фенотипов и оценки влияния физиологических возмущений и терапевтических вмешательств. Объективная количественная оценка параметров локомотива позволяет выявлять тонкие моторные изменения, которые не могут быть надёжно зафиксированы только визуальным осмотром, что особенно актуально в доклинических исследованиях, направленных на ранние или лёгкие^{фенотипы 5}. В этом контексте анализ походки стал ценным инструментом для изучения изменений в моторном поведении и выявления функциональных изменений, связанных с различными экспериментальными состояниями, такими как неврологические и нейродегенеративные^{заболевания 6}.

Анализ моторного поведения и походки в моделях мышей традиционно основывался на специализированных технологических платформах, предназначенных для количественной оценки пространственных и временных кинематических переменных. Широко используются такие системы, как освещённые дорожки, инструментальные платформы и коммерческое программное обеспечение для отслеживания движения; Однако их зависимость от дорогого оборудования и выделенной инфраструктуры существенно ограничивает доступность многих^{лабораторий 7, 8, 9 и 10}. Помимо экономических соображений, эти подходы вводят дополнительные экспериментальные ограничения. Некоторые системы требуют от животных передвижения по узким коридорам или ярко освещённым полосам, что создаёт принудительные моторные паттерны, снижающие спонтанное поведение, в то время как другие зависят от физических маркеров, пятен краски или клейких бирок, прикреплённых к конечностям. Такие вмешательства могут вызвать стресс, изменить механику походки и запутать физиологическую интерпретацию моторных^{исходов} 11,12,13,14. В совокупности эти ограничения подчёркивают необходимость методологий, способных фиксировать походку в естественных, свободно движущихся условиях без использования инвазивных процедур или дорогостоящей инфраструктуры.

Оценка походки во время неограниченного передвижения позволяет наблюдать более естественные моторные паттерны, избегая внешних ограничений, искусственно регулирующих скорость, траекторию или осанку. Этот подход облегчает характеристику локомоторного поведения при минимально ограниченных условиях. DeepLabCut — это открытый фреймворк для оценки поз на основе глубокого обучения, который использует сверточные нейронные сети для отслеживания пользовательских анатомических ориентиров без необходимости физических маркеров. Обеспечивая анатомическое точечное отслеживание по стандартным видеозаписям, DeepLabCut позволяет извлекать кинематические параметры, значительно снижая затраты и сложность^{экспериментов} 15,16,17,18. Важно, что отслеживание без маркеров минимизирует экспериментальные интерференции, что делает его подходящим для изучения спонтанного поведения. Этот метод без маркеров с одной камерой наиболее подходит для исследований, требующих доступной, неинвазивной количественной оценки спонтанной локомоторной активности и двумерных особенностей, связанных с походкой, в условиях свободного движения. Однако инструментальные платформы для походки или трёхмерные системы захвата движения требуются, когда необходимы прямые биомеханические переменные, такие как силы реакции на грунт, подошвенное давление, углы суставов или полноразмерная трёхмерная кинематика конечностей.

Цель этой статьи — представить недорогой, безмаркерный рабочий процесс на основе DeepLabCut для неинвазивной количественной оценки походки и спонтанного передвижения у свободно движущихся мышей, интегрируя видеозапись на одну камеру, анатомическое отслеживание ориентиров и извлечение пространственно-временных локомоторных параметров в доступном рабочем процессе, не требующем специализированного оборудования или инвазивных манипуляций. Этот протокол сосредоточен на методологической реализации и репрезентативных результатах рабочего процесса.

Протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Комитетом по биоэтике Института нейробиологии Национального автономного университета Мексики в соответствии с протоколом No 117.

1. Контекст изучения

1. Используйте мышей в экспериментальных условиях, необходимых для исследования. В этой статье по протоколу мы используем тройную трансгенную модель болезни Альцгеймера (3xTg-AD), содержащую трансгены APPSwe и tauP301L на PS1M146V фоне knock-in, а также нетрансгенных мышей в качестве контрольных элементов, в качестве репрезентативного примера реализации рабочих процессов.
2. Генотипируйте всех животных до начала исследования.
3. Содержать мышей с едой и водой ad libitum в контролируемых условиях, включающих 12:12 часа светло-тёмный цикл, температуру 22 °C ± 2 °C и относительной влажности 60% ± 5% под ветеринарным наблюдением.
4. Проводите записи в световой фазе после 60-минутного периода привыкания, используя одну сессию на открытом поле для каждого животного, чтобы сохранить спонтанное исследовательское поведение и избежать снижения активности, связанной с повторным воздействием на арене.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой статье о протоколе мы приводим репрезентативные записи исключительно для иллюстрации рабочего процесса и типа локомотивных и походочных выходов, генерируемых методом, а не для поддержки биологических сравнений между группами.

2. Материалы

1. Используем материалы и оборудование, указанные в Таблице материалов и оборудования, для записи и анализа спонтанного передвижения и походки. См. рисунок 1 для общей сборки экспериментальной установки.

3. Привычка и запись спонтанного передвижения

1. Подготовка и привычка к животным
   1. Аккуратно переместите мышь из её комнаты для хранения в комнату для поведенческого тестирования как минимум за 60 минут до эксперимента, чтобы обеспечить привыкание к окружающей среде.
   2. Поддерживать комнату поведенческого тестирования в контролируемых условиях окружающей среды, включая постоянную температуру 20–22 °C, стандартизированную интенсивность освещения (120–150 люкс, измеряемая на уровне арены) и непрерывный белый шум для минимизации внешних слуховых стимулов.
   3. В период привычки держите животное в домашней клетке, не вводя дополнительных стимулов или обогащения. Обращайтесь с животными в соответствии с институциональными рекомендациями по благополучию животных, чтобы минимизировать поведенческую изменчивость, вызванную стрессом.
   4. Обращайтесь с животным чистыми перчатками и медленными, осознанными движениями. Аккуратно поднимите животное за основание хвоста и поддержите тело другой рукой, прежде чем поставить его на открытое поле.
      Примечание: КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Непоследовательное обращение или недостаточное время привычки могут усилить поведение, связанное с тревогой, и привести к изменчивости параметров движения. Обеспечьте одинаковые процедуры привычки для всех животных и сессий.
2. Арена на открытом поле и подготовка камеры
   1. Перед каждой сессией записи тщательно очищайте акриловую открытую площадку этанолом 70% (v/v), чтобы удалить остаточные запахи и прежние запахи. Дайте поверхности полностью высохнуть перед использованием.
   2. Используйте 70% этанола в хорошо проветриваемом помещении, держите его вдали от тепла или источников возгорания и дайте арене полностью высохнуть перед использованием.
   3. Надёжно разместите открытую арену на деревянной платформе, убедившись, что конструкция устойчива и свободна от вибраций.
   4. Осмотрите прозрачные акриловые стены и матовую поверхность пола, чтобы убедиться, что на них нет пыли, влаги или отражающих остатков, которые могут мешать видеосъёмке.
   5. Разместите внешние боковые белые лампы с обеих сторон арены под приблизительным углом 30–45° относительно плоскости арены, чтобы обеспечить равномерное освещение по всей зоне записи и минимизировать тени, отражения или чрезмерную яркость. Регулируйте расположение лампы перед каждой сессией и проверяйте, что освещение на уровне арены остаётся в пределах целевого диапазона 120-150 люкс.
   6. Разместите камеру под ареной в режиме снизу на фиксированном расстоянии примерно 80 см от плоскости арены, обеспечивая полную видимость зоны записи. Обратите внимание, что оптимальное расстояние может потребоваться регулировки в зависимости от диафрагмы объектива и поля зрения (FOV) конкретной камеры, чтобы сохранить полное покрытие арены.
   7. Подключите камеру к компьютерной системе и запустите программное обеспечение для видеозаписи перед знакомством с животным.
   8. Отрегулируйте фокус камеры и поле зрения, чтобы вся поверхность арены была видна и чётко разрешёна.
   9. Получите эталонное изображение для пространственной калибровки, разместив шахматную сетку или калибровочный узор с известными размерами на плоскости арены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Точное выравнивание камеры, фиксированное расстояние камеры и стабильное освещение необходимы для надёжной оценки позы без маркеров. Отклонения в геометрии или условиях освещения могут снизить точность отслеживания и снизить сопоставимость данных между сессиями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для внешней опорной конструкции могут использоваться альтернативные материалы, включая нержавеющую сталь, при условии, что установка остаётся стабильной и сохраняется выравнивание записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также может использоваться непрозрачная арена или альтернативные материалы для стен, особенно если требуется дополнительный контроль внешнего визуального входа, при условии, что система записи остаётся стабильной и минимизируется внешние визуальные помехи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры арены, используемые в этом протоколе, соответствуют конфигурации для записи свободно движущихся мышей. Эти размеры могут корректироваться в зависимости от используемого грызуна и принятого протокола открытого поля, при условии полной видимости животных, пространственной калибровки и согласованных условий поимки.
3. Запись спонтанного локомоторного поведения
   1. Перед тем как поместить мышь в арену, кратко отобразите идентификатор животного в видеокадре, чтобы обеспечить прямую визуальную ассоциацию между записью и соответствующей экспериментальной сессией.
   2. Инициируйте видеозапись перед тем, как разместить мышь в центре открытой арены, чтобы обеспечить фиксацию первоначального исследовательского поведения с самого начала сессии.
   3. Аккуратно положите мышь в центр открытой арены.
   4. Записывайте спонтанное движение непрерывно в течение 3 минут без возникновения зрительных, слуховых или тактильных нарушений. В настоящем протоколе на мышь выполнялась только одна сессия записи.
   5. Следите за прямой видеотрансляцией на экране компьютера, чтобы подтвердить непрерывную запись и правильный фикс движений животного.
   6. Периодически проверяйте выравнивание камер и равномерность освещения между сессиями, чтобы обеспечить единообразные условия записи среди животных.
   7. В конце периода записи прекратите видеозапись и аккуратно уберите животное с арены, используя описанную выше процедуру обращения.
   8. Верните животное в домашнюю клетку и дайте ему отдохнуть перед дальнейшими процедурами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте перемещения положения животного во время записи, так как внешние помехи могут изменить спонтанные походки и повлиять на анализ по следующему потоку.
4. Очистка, хранение данных и завершение сессий
   1. После каждой сессии снова очищайте арену с 70% этанолом (v/v) и давайте ей полностью высохнуть перед появлением следующего животного.
   2. Убедитесь, что на поверхности арены не осталось остатков этанола или запаха перед введением следующего животного.
   3. Документируйте идентификатор животного, дату и время сессии, экспериментальное состояние и имя оператора сразу после каждой записи.
   4. Если тестируются дополнительные животные, повторяйте процедуру, начиная с шага 3.1.1, при идентичных условиях окружающей среды и эксперимента.
   5. Сохраняйте каждый видеофайл в отдельной папке, используя стандартизированную систему именования (например, AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4).
   6. В конце экспериментального дня отключите систему камер и осветительное оборудование, чтобы предотвратить дрейф в настройках освещения во время сессий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя в настоящем протоколе использовалось 70% этанола, так как он является широко используемым дезинфектором в подобных процедурах, могут также применяться дезинфицирующие средства, совместимые с акрилом, чтобы предотвратить прогрессирующее разрушение поверхности, при условии, что арена полностью сухая и без остаточного запаха до следующей записи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда это возможно, можно подготовить несколько арен для мгновенного переключения между сессиями и для обеспечения непрерывного прохождения эксперимента на животных.
      См. рисунок 1 для материалов и сборки экспериментальной установки, включая деревянную платформу (рисунок 1A), акриловую арену (рисунок 1B), систему бокового освещения (рисунок 1C), позиционирование камеры снизу (рисунок 1D) и полную экспериментальную систему (рисунок 1E).

Рисунок 1: Экспериментальная установка для видеозаписи передвижения на открытом поле. (A) опорная конструкция арены; (B) акриловая арена на открытом поле, установленная на платформе; (C) боковое освещение для обеспечения равномерного освещения; (D) позиционирование камеры для записи движения снизу; (E) полная подготовка. Белые стрелки указывают ориентацию источника света на рисунке 1C и камеры на рисунке 1D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Обработка видео и кинематический анализ

1. Подготовка видео и контроль качества
   1. Получите необработанные видео в . Форматировать MOV и конвертировать их в .avi формат для совместимости с DeepLabCut при сохранении постоянных параметров частоты кадров и разрешения.
   2. Bсразу после получения все сырые видеофайлы в отдельную папку на компьютере анализа и применяет стандартизированную систему именования (например, AnimalID_Session_Date).
   3. Просмотрите каждое видео целиком, чтобы убедиться, что запись завершена и не содержит прерываний, провалений кадров или повреждений. Видео с ошибками приобретения следует исключать из анализа.
   4. Конвертируйте видео в MP4 (H.264) или несжатый формат AVI, если исходный формат несовместим с DeepLabCut.
   5. По желанию выполните временную обрезку видеоматериала, чтобы устранить неэкспериментальные интервалы в начале и конце сессии (например, при введении или удалении животного с экспериментальной площадки).
   6. Убедитесь, что разрешение и частота кадров совпадают с параметрами записи, используемыми во время записи, и остаются неизменными во всех сессиях.
   7. Убедитесь, что вся поверхность арены видна в видеокадре и что ни одна часть тела не закрывается во время передвижения.
   8. Pобъединяет все проверенные и обработанные видео в специальный каталог проектов для анализа DeepLabCut.
      ПРИМЕЧАНИЕ: КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Нестабильная частота кадров, частичная видимость арены или размытие движения напрямую снижают точность отслеживания. Видео, не соответствующие критериям качества, не должны включаться в обучение или выводы моделей.
2. Создание и конфигурация проекта
   1. Назначьте видеобиблиотеку для проекта, используя либо те же видео, предназначенные для анализа, либо представительную подгруппу для обучения сети.
   2. Запустите среду Python и импортируйте пакет DeepLabCut.
   3. Создайте новый проект DeepLabCut с помощью команды:
   4. deeplabcut.create_new_project('ProjectName','Author','VideoPath').
   5. Определите анатомические ориентиры (части тела), представляющие интерес, в файле config.yaml, обеспечив чёткие и анатомически согласованные определения.
   6. Определения частей тела должны быть оптимизированы для экспериментального вопроса и оставаться одинаковыми для всех животных и сессий.
3. Извлечение кадров и маркировка частей корпуса
   1. Укажите start, stop, numframes2extract и cropping_parameters в файле config.yaml в зависимости от длины видео и пространственной структуры.
   2. Извлекать репрезентативные кадры с использующим: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'автоматический', 'kmeans'/'uniform').
   3. Проверьте извлеченные кадры, чтобы подтвердить наличие вариаций в позе тела, ориентации, положении конечностей и фазе походки на протяжении всей записи. Если определённые позы, конфигурации конечностей или локомоторные фазы недостаточно представлены, извлекайте дополнительные кадры для лучшего отображения этих условий.
   4. Когда требуются определённые фазы цикла походки, вручную извлекайте кадры с помощью deeplabcut.extract_frames(config_path, «ручной»).
   5. Запустите графический интерфейс маркировки с помощью deeplabcut.label_frames(config_path).
   6. Обозначьте все заранее определённые анатомические ориентиры, показанные на рисунке 2, включая репрезентативный видеокадр во время сбора (рисунок 2A), автоматическое обнаружение точек тела, наложенное на исходный кадр (рисунок 2B), и схемное представление определённых ориентиров тела и аренных ориентиров, используемых для анализа (рисунок 2C). Следуйте последовательным анатомическим критериям (например, нос: передний кончик морды; основание хвоста: соединение между позвоночником и хвостом)
   7. Последовательно помечайте все четыре конечности, размещая каждый ориентир в центре лапы поверх подошвовых подушечек при контакте с землёй.
   8. Сохраняйте и проверяйте метки с помощью deeplabcut.check_labels(config_path) и при необходимости исправляйте неточные аннотации.
   9. Когда возможно, попросите второго обученного оценщика отметить подмножество фреймов для оценки согласованности между оценителями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Несогласованная или анатомически неточная маркировка является основным источником ошибок в отслеживании. Обеспечивайте строгое соблюдение определений достопримечательностей во всех рамках.
4. Обучение нейронных сетей
   1. Обучить модель оценки позы для 200 эпох и получить итоговую среднюю ошибку обучения (RMSE) в 3,27 пикселя и среднюю ошибку теста 3,59 пикселя, что соответствует стабильной производительности отслеживания при описанных условиях получения.
   2. Создайте наборы данных для обучения и оценки с помощью deeplabcut.create_training_dataset(config_path).
   3. Скорректируйте параметр Training Fraction в config.yaml, чтобы определить долю изображений, используемых для обучения.
   4. Проверьте доступность видеокарты, запустив: nvidia-smi.
   5. Начинайте сетевое обучение с использующим: deeplabcut.train_network(config_path, save_epochs=5, эпохи=200).
   6. Следите за потерей в тренировках и прекращайте тренировку, когда значения потерь стабилизируются и дальнейших улучшений не наблюдается.
   7. Если обучение прервано, возобновите с последней сохранённой контрольной точки.
   8. Оцените обученную модель с помощью deeplabcut.evaluate_network(config_path) и запишите среднюю ошибку пикселя.
   9. Если ошибка превышает допустимый порог для экспериментальной установки, добавьте дополнительные маркированные кадры или уточните аннотации и повторите обучение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Допустимые пороги ошибки пикселей могут варьироваться в зависимости от разрешения камеры и размера арены, но должны оставаться одинаковыми в разных экспериментах.
5. Видеоанализ и количественная оценка походки
   1. Считайте точки с вероятностью ниже 0,3 отсутствующими.
   2. Линейно интерполируют пропущенные точки только тогда, когда пробелы составляют ≤3 последовательных кадра; Исключить более длительные пробелы из анализа.
   3. Определите двигательные приступы с использованием порога скорости центра тела в 10 см/с.
   4. Исключить движения ниже этого порога и временные события короче 3 кадров.
   5. Проведите вывод по экспериментальным видео, используя следующее: deeplabcut.analyze_videos(config_path, [video_path], save_as_csv=True).
   6. Генерируйте маркированные видео с помощью deeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path]) для визуального подтверждения качества отслеживания (рисунок 2).
   7. Установить параметр pcutoff в config.yaml на 0.6, чтобы применить порог доверия при визуализации и оценке отслеживания.
   8. Импортируйте выходные CSV-файлы в статистическую вычислительную среду, указанную в Таблице материалов, вместе с соответствующим аналитическим пакетом и пользовательскими скриптами, предоставленными в Дополнительном материале 1 для количественной оценки поведения.
   9. Преобразуйте индексы кадров во время с использованием исходной частоты дискретизации видео.
   10. Калибруйте пространственные измерения, преобразуя пиксельные координаты в физические единицы, используя известные измерения арены и отслеживаемые угловые ориентиры.
   11. Проведите контроль качества на отслеживаемых координатах перед метрической экстракцией.
   12. Считайте точки с вероятностью ниже 0,3 отсутствующими и заменяйте их линейной интерполяцией, когда это уместно.
   13. Выявляйте выбросы при визуальном осмотре и корректируйте или исключайте их при необходимости.
   14. Определите сегменты походки с использованием синхронизированных кинематических критериев на основе смещения центра тела и движения задних конечностей.
   15. Исключайте недвигательные поведения, такие как вставание на дыбы, повороты и уход.
   16. Вручную калибруйте и уточняйте пороги определения в соответствии с экспериментальными условиями и животной моделью, чтобы сохранить только устойчивые, непрерывные двигательные удары для анализа.
   17. Вычислите метрики походки, полученные из геометрических и временных соотношений между отслеживаемыми ориентирами с помощью фильтрованных непрерывных локомотивных сегментов (Таблица 1). К ним относились длина шага, длина шага, ширина шага, каденция, длительность шага, длительность шага, время стойки, время замаха, амплитуда ипсилатераль и меры смещения, специфичные для конечностей.
   18. Извлечь метрики открытого поля из полной записи, используя те же данные отслеживания (Таблица 1). К ним относились общее пройденное расстояние, средняя скорость, время, проведённое в движении, процент времени, проведённого в движении, количество и продолжительность ходьбы, а также совокупное расстояние в центре, периферии и углу.
   19. Скомпилировать все выходные данные в структурированный мастер-файл для дальнейшего статистического анализа.
   20. Генерируйте визуальные представления (например, траектории, тепловые карты, временные смещения, схемы походки и графики координации между конечностями) с использованием вычислительных сред, перечисленных в Таблице материалов , и описанных выше скриптов построения.
   21. Репрезентативные синхронизированные визуализации достоверности точек, обнаружения походки, классификации исследовательских зон и координации между конечностями представлены в Дополнительном видео 1 и Дополнительном видео 2 для облегчения интерпретации аналитического рабочего процесса.
6. Контроль качества и резервное копирование данных
   1. Визуально осмотрите случайную подгруппу отмеченных видео, чтобы подтвердить анатомическую согласованность между кадрами и сессиями.
   2. Сравните предсказанные позиции ориентиров с аннотированными метками для проверки стабильности и обобщения модели.
   3. Сохраните полную копию проекта, включая config.yaml, оригинальные метки, обученные сетевые веса и выходные файлы.
   4. Документируйте версии программного обеспечения, используемые в рабочем процессе, включая DeepLabCut, Python, PyTorch, CUDA и статистическую вычислительную среду, а также спецификации GPU и дату анализа.
   5. Сгенерируйте сводный отчет о средних ошибках и времени обработки по evaluation-results.csv.
   6. Сделайте резервную копию всего проекта в локальный архив и на институциональный сервер или защищённое облачное хранилище.
7. Вычислительная среда и ресурсы воспроизводимости
   1. Записывайте оригинальные видеозаписи в . MOV с разрешением 1080 × 1920 пикселей и примерно 60 кадрами в секунду.
   2. Предварительно обрабатывайте и перекодуйте видео в .avi формат.
   3. Во время этого этапа преобразования обрезайте интересующую область, измените её размер до квадратного разрешения 720 × 720 пикселей и стандартизируйте частоту кадров до постоянных 60 FPS для обеспечения точной временной количественной оценки при последующем кинематическом анализе.
   4. Реализовать рабочий процесс отслеживания без маркеров с использованием DeepLabCut версии 3.0.0rc13 в Python-среде, настроенной на Python 3.12.12, PyTorch 2.5.1 и CUDA 11.8.
   5. Обучайте модель оценки позы для 200 эпох и получите итоговую среднюю ошибку обучения (RMSE) в 3,27 пикселя и среднюю ошибку теста 3,59 пикселя.
   6. Проведите анализ после отслеживания с использованием статистической вычислительной среды и пользовательских скриптов, предоставленных в Дополнительном материале 1 , для количественной оценки походки и открытых полей.
   7. Используйте порог скорости центра тела в 10 см/с для определения ходьбы. Заполнить промежутки до 3 кадров между локомотивными эпохами и исключить переходные движения короче 3 кадров, чтобы сохранить непрерывные сегменты походки для анализа.
   8. Предоставьте соответствующие настройки config.yaml, репрезентативные скрипты анализа, примеры видео и трекинговых файлов, а также веса моделей в дополнительном материале 1.
   9. Предоставить дополнительные детали реализации, метрики оценки модели, аппаратные спецификации и параметры анализа для конкретного случая в Дополнительном материале 1, где это применимо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Корректируйте эти параметры в соответствии с условиями получения в каждом эксперименте.

Рисунок 2: Репрезентативный рабочий процесс для отслеживания точек тела без маркеров и анализа походки по видеозаписям. (A) Репрезентативный видеокадр мыши, свободно движущейся в открытом поле во время захвата. (B) Пример автоматического обнаружения точек тела, наложенного на оригинальный видеокадр после оценки позы, иллюстрирующий анатомические ориентиры, используемые для анализа. (C) Схематическое представление определённых ориентиров тела и опорных точек арены, используемых для реконструкции походки, пространственной калибровки и количественного анализа локомотивов. Ориентиры и опорные точки арены: морда, горло, центр тела, центр тела слева (bcl), центр тела справа (bcr), левый бедро (hipl), правый бедро (hipr), основание хвоста, центр хвоста, кончик хвоста, левая передняя лапа (lfp), левая задняя лапа (lhp), правая передняя лапа (rfp), правая задняя лапа (rhp), верхний левый (tl), верхний правый (tr), нижний левый (bl) и нижний правый (br). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Результаты

После применения процесса отслеживания и анализа автоматизированная обработка восстановила спонтанное движение на открытом поле с использованием ориентира центра тела и генерировала количественные результаты, подходящие для дальнейшего анализа. Репрезентативные графики траектории иллюстрируют то, как протокол фиксирует пространственное смещение по арене, временную заселение и динамику скорости во время свободного исследования. Переменные открытого поля, показанные в этом разделе, были рассчитаны на основе полной записи, ...

Обсуждение

В данном исследовании представлен недорогой, безмаркерный подход к анализу спонтанного передвижения и походки у свободно движущихся мышей с использованием стандартного видеозахвата и оценки позы на основе DeepLabCut в доступном рабочем процессе. Рабочий процесс позволяет извлекать переменные, связанные с походкой, из видеозаписей, сохраняя естественное поведение локомотивов и снижая экспериментальные помехи. В этом смысле протокол предлагает практическую и доступную альтернативу для докл...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
70% ethanol	Generic	N/A	Очистка арены между сеансами
Adjustable white-light lamps	Generic	N/A	Поддержание постоянного освещения (100–150 lx)
Black curtains/glare control	Generic	N/A	Снижение внешнего света/отражений
Checkerboard grid template	Generic	N/A	Ссылочное изображение для пространственной калибровки
DeepLabCut (v3.0.0rc13)	Open-source	N/A	ПО для определения позы
Digital video camera (HD, 16:9; ≥60 fps)	Generic	N/A	Фиксированные настройки для всех сеансов
Nvidia GPU workstation	Custom build	N/A	Оборудование для обучения/заключения модели
Lux meter	Generic	N/A	Проверка освещения на уровне арены
PyTorch	Pytorch Foundation	N/A	Фреймворк, необходимый для DeepLabCut
Transparent acrylic open-field arena (42 × 42 × 42 cm)	Custom-made / In-house	N/A	Арена для открытого пространства
Under-arena camera mount (90° view)	Custom-made / In-house	N/A	Стабильная подставка для нижней записи
CUDA	Nvidia corporation	N/A	Параллельная обработка с ускорением на GPU
R programming language	R Foundation	N/A	Язык программирования для анализа данных