Мышиная модель для селективного пересечения вегетативных нервов кишечника

Краткое содержание

Этот протокол направлен на обеспечение точного, избирательного пересечения кишечно-иннервирующих симпатических и парасимпатических нервов у мышей с использованием верхней брыжейной артерии в качестве постоянного анатомического ориентира, предоставляя сфокусированную и воспроизводимую модель для изучения автономной регуляции кишечной физиологии и заболеваний.

Аннотация

Вегетативные нервы включают симпатическую и парасимпатическую системы, которые действуют в значительной степени антагонистически для регулирования различных физиологических функций. С ростом интереса к роли вегетативной иннервации в физиологии и патологии кишечника растет потребность в экспериментальных моделях, позволяющих точно манипулировать симпатическими, и парасимпатическими входами, направленными кишечником. Здесь мы представляем хирургический протокол для селективного пересечения симпатических и парасимпатических нервов, иннервирующих кишечник. Используя верхнюю брыжейную артерию (SMA) как воспроизводимый анатомический ориентир, этот подход позволяет надёжно идентифицировать пучки вегетативных нервов кишечника и последующее целенаправленное пересечение. В отличие от более широких методов денервации, таких как ганглионэктомия или субдиафрагмальная ваготомия, этот подход направлен на более анатомически локализованное пересечение вегетативных пучков, ориентированных кишечником, что может помочь уменьшить внекишечные помехи. Травма контролируема и обычно сопровождается минимальным кровотечением, что поддерживает процедурную последовательность и послеоперационное восстановление. Хотя операция требует соответствующего микрохирургического обучения, протокол адаптивен, позволяя пользователям адаптировать ключевые параметры под конкретные экспериментальные цели. Важно, что эта модель предоставляет практическую платформу для изучения роли симпатических и парасимпатических нервов в регулировании функции кишечника как при физиологических, так и при заболеваниях. В этой статье цель — подробно описать процедуру, чтобы облегчить её внедрение новыми пользователями в их исследованиях.

Введение

Желудочно-кишечный тракт находится под непрерывным контролем вегетативной нервной системы (АНК), при этом симпатический и парасимпатический пути координируют фундаментальные аспекты физиологии кишечника, включая подвижность, секрецию, функцию эпителиального барьера и иммунный гомеостаз ^1,2. В толстой кишке внешние симпатические входы могут оказывать регионально-зависимые эффекты на несколько клеточных компартментов, что подчёркивает то, что широкие нарушения АНС могут скрывать специфические фенотипы^{кишечника 1}. В то же время парасимпатические цепи, классически опосредованные вагальным сигналом и холинергическими механизмами вниз по потоку, всё больше признаются неотъемлемой частью поддержания иммунного баланса кишечника и формирования слизистых ответов, что дополнительно мотивирует экспериментальные стратегии, позволяющие с анатомической точностью разделять симпатические и парасимпатические^{вклады.}

Помимо физиологической регуляции, вегетативная активность стала важным модификатором биологии кишечных заболеваний, включая колоректальный рак (КРК). Недавние исследования CRC демонстрируют двунаправленную симпатическую нервно-мезенхимальную программу, в которой β2-адренергическая сигнализация и фибробласты, экспрессирующие NGF, ассоциированные с раком, усиливают нейронно-стромальные взаимодействия и способствуют прогрессированию опухоли, предоставляя прямое доказательство того, что симпатические цепи могут быть функционально связаны с патогенезом^{CRC 3}. Параллельно холинергическая сигнализация связана с ростом CRC и иммунными особенностями, ассоциированными с опухоли, что подтверждается фармакологическим ингибированием мускаринового рецептора 3 в ортотопической модели мышей и связыванием холинергической сигнализации с экспрессией иммунных контрольных точек и другими злокачественными^{признаками 4,5}. Важно, что вегетативные влияния при заболеваниях кишечника могут также сближаться с другими модуляторами, такими как психологический стресс и микробиота кишечника. Кишечная нервная система может передавать сигналы стресса на воспаление^{кишечника 6}, а микробные сигналы могут активировать кишечно-мозговые цепи, которые настраивают симпатические нейроны кишечника, поддерживая многофакторную структуру, в которой нейронная регуляция пересекается с иммунной и микробной^{экологией 6,7}.

Эти сходящиеся линии доказательств подчёркивают необходимость экспериментальных подходов, способных с достаточной анатомической точностью изолировать вегетативные эффекты, направленные кишечником, для поддержки причинно-следственных выводов как в физиологических, так и в патологических условиях. Несмотря на быстрый прогресс в картировании схем и нейромодуляции, многие часто используемые вмешательства остаются ограниченными по специфичности органов. Системные фармакологические манипуляции, химическая симпатэктомия и субдиафрагмальная ваготомия могут влиять на широкие автономные выходы и тем самым изменять иммунные и метаболические точки установки за пределами кишечника, усложняя причинную атрибуцию специфическим нейронным входам толстой^{кишки 8}. Например, блуждающие цепи могут подавлять производство воспалительных^{цитокинов 9}, а вагусная стимуляция может модулировать эндокринную функцию поджелудочной железы и динамику клеток β, что показывает, что предшествующие или неселективные вмешательства могут вызвать внекишечные эффекты, затрудняющие интерпретацию кишечных^{фенотипов 10}. Эти ограничения особенно важны для исследований, направленных на выделение вегетативных механизмов, ограниченных толстой кишкой, в физиологии и патологии. Общая цель метода заключается в том, чтобы обеспечить анатомически направленную, селективную транссекцию симпатических и парасимпатических волокон у мышей, предоставляя практическую модель для изучения кишечной автономной регуляции с уменьшением внецелевого воздействия.

В итоге, этот протокол сообщает о более точном подходе к мышиной вегетативной денервации кишечника с минимальным нарушением автономной иннервации других органов брюшной полости, тем самым повышая интерпретируемость за счёт снижения возможного искажения внекишечных органов.

Протокол

Все процедуры на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Пекинской больницы дружбы, Столичный медицинский университет (NO 24-2026). В этом исследовании использовались взрослые самцы дикого типа C57BL/6J (8–10 недель, 20–30 г). Подробная информация о реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

Критерии включения: мыши одного штамма, пола и возрастного диапазона использовались в каждом эксперименте для минимизации биологической вариабельности. Включены только здоровые животные, демонстрирующие нормальную активность, поведение при груминге, потребление пищи и воды, а также выброс кала в период акклиматизации. Кроме того, мыши были акклиматизированы к животноводческому учреждению не менее 7 дней до операции.

Критерии исключения: мыши исключались в случаях неконтролируемого кровотечения или серьёзного сосудистого повреждения во время операции, перфорации кишечника или значительного повреждения тканей, несовместимых с выживаемостью. Также были исключены животные, не оправившиеся после анестезии и не становящиеся способными ходить в течение 2 часов после операции. Дополнительными критериями исключения были послеоперационные осложнения, такие как стойкое ослоение раны, тяжёлая инфекция или потеря веса свыше 15% в течение 48 часов или 20% за любой 72 часа. Мыши с хирургической ошибкой нервной ветви, подтверждённой пост-хок гистологической оценкой, также были исключены из исследования.

1. Предоперационная подготовка

1. Стерилизуйте все хирургические инструменты.
2. Назначайте профилактическую анальгезию всем мышам за 30 минут до операции, чтобы избежать чувствительности к боли. Вводят мелоксикам (5 мг/кг массы тела) с помощью подкожной инъекции.
3. Разогрейте грелку до 37 °C и положите под хирургическую платформу.
4. Распылите операционную зону (включая камеру для анестезиологии) 75% этанола и тщательно протрите бумажными полотенцами. Положите достаточно бумажных полотенец на дно камеры впуска.
5. Осмотрите камеру анестезиологии и трубку, чтобы убедиться, что нет утечек. Пополните и обеспечьте достаточное количество изофлурана. Индуцировать анестезию с помощью 3%–3,5% изофлурана, подаваемого в 1 л/мин кислорода. Постоянно следите за мышью; Хирургический план обычно достигается за 1–2 минуты.
6. Поместите мышь в положение лежа на спине, полностью вытянув все четыре конечности, и закрепите гипоаллергенной лентой. Подберите и закрепите носовой конус. Уменьшите изофлуран до 1,5%–2,5% для поддержания. Оцените глубину анестезии по отсутствию реакции на отмену педалей (отсутствие реакции на защемление пальца) и регулярного дыхания (55–65 вдохов/мин).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время длительных микрохирургических процедур глубина анестезии постоянно контролируется за пределами начальной хирургической плоскости. Помимо оценки рефлекса отмены педалей и частоты дыхания каждые 5–10 минут, мы отслеживаем дыхательные ритмы (например, регулярность и глубину) и частоту сердечных сокращений через визуальное наблюдение или контакт со стенкой грудной клетки. Цвет слизистой оболочки (измеряется по лапам или губам) также периодически проверяется для обеспечения достаточного насыщения кислородом. Если у мыши появляются признаки молниеносной анестезии, такие как повышенная частота дыхания (>80 вдохов/мин), спонтанные движения или возвращение педального рефлекса, концентрация изофлурана увеличивается с шагом на 0,25–0,5% до восстановления адекватной хирургической плоскости. Наоборот, если дыхание становится поверхностным или нерегулярным, либо если частота сердечных сокращений значительно снижается, изофлуран снижается на 0,25–0,5% до восстановления стабильной кардиореспираторной функции. Эта динамическая корректировка гарантирует, что мышь остаётся на нужной глубине анестезии на протяжении всей процедуры, минимизируя кардиореспираторную депрессию.
7. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы и травмы под анестезией.
8. Сбрийте брюшную шерсть от уровня лобкового симфиза до области ниже реберного края с помощью электрической бритвы. Затем переместите хирургическую платформу под стереомикроскоп.
9. Дезинфицируйте место операции с помощью повидонов-йодных мазков по внешнему, концентрическому узору (от центра к периферии), покрывая область от ниже ксифовидной кости до лобкового симфиза и латерально к обеим бокам. Повторите три раза. Затем протирайте 70% этанола таким же образом. Убедитесь, что на поле нет выпавших волос.
10. Наденьте хирургическую маску и одноразовую шапочку, стерильную хирургическую мантию и стерильные перчатки.
11. Накройте мышь стерильной занавеской. Отрегулируйте ширину груди примерно на 2 × 3 см и выровняйте её с серединой брюшной полости, чтобы полностью открыть операционное поле. Закрепите четыре угла занавески.

2. Лапаротомия и экспозиция

1. С помощью стерильных щипцев аккуратно приподнимите небольшую складку кожи чуть выше черепа к лобковому симфизу. Стерильными ножницами с острыми кончиками сделайте небольшой начальный разрез на вершине (~0,3 см), затем удлините разрез кожи черепно вдоль средней линии на 1,5–2,0 см.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После введения острых наконечников ножниц в начальное отверстие наклоните их вверх и выполните контролируемый «толчок-рез» по нижней поверхности кожи, чтобы избежать слишком глубокого разреза и повреждения мышц брюшной полости или внутренностей. С помощью щипцов и ножниц тупо рассечите рыхлую подкожную соединительную ткань от мышц подлежащей стенки брюшной стенки. Вскрытие немного шире, чем кожный разрез, чтобы облегчить последующее воздействие.
2. Примерно на 0,5 см хвостового отростка от ксифовидного отростка аккуратно вставьте кончики стерильных тонких щипцев в linea alba и поднимите небольшой тент ткани.
3. Используя стерильные ножницы с острыми наконечниками, создайте небольшое отверстие (2–3 мм) на поднятом месте. В этот момент гладкая брюшина и/или подлежащие органы (например, доля печени) должны быть видны.
4. Вставьте одно лезвие стерильных тупых ножниц в брюшинную полость, держа её плотно приближаясь к брюшной стенке. При прямой визуализации протяните разрез вдоль линии альба в направлении черепа, пока общая длина не совпадёт с разрезом кожи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите наконечник ножниц наклонённым вверх по всей стороне и двигайтесь только под прямым зрением, чтобы убедиться, что под ножницами нет петель или кровеносных сосудов.

3. Идентификация верхней брыжейной артерии и пересечения нерва

1. Аккуратно оттяните брюшную стенку в стороны, используя стерильные ленты, чтобы открыть брюшную полость.
2. Примените умеренное давление ватной палочкой на брюшную стенку, чтобы дать кишечнику возможность выйти. Аккуратно переместите тонкий кишечник, кишечник и слепую кишку на левую сторону мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Накройте открытое кишечник стерильным ватным диском или марлей, увлажнённой тёплым (≈37 °C) стерильным физиологическим раствором, чтобы предотвратить высыхание тканей и потерю тепла.
3. Правой рукой аккуратно перемещайте желудок, двеперстную кишку и толстой кишку en bloc к левому верхнему квадранту стерильной, увлажненной ватной палочкой (или микрощипцами с тупым наконечником). Брюшная аорта, расположенная перед позвоночником, должна быть хорошо видна на этой стадии, иногда частично покрытая небольшим количеством ретробрюшинального жира.
4. Определите левую почечную вену и ствол целиакии. Верхняя брыжневая артерия (СМА) возникает как одна артериальная ветвь от передней стенки брюшной аорты, обычно на расстоянии ~2–4 мм хвоста целиакии и на уровне левой почечной вены или немного выше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Левая почечная вена — это тёмная, толстая вена, проходящая горизонтально по передней части брюшной аорты, а затем стекает в нижнюю полую вену. Целиакический ствол обычно является первой крупной артериальной ветвью, возникающей из передней стенки брюшной аорты, расположенной чуть выше черепа (верхняя) от левой почечной вены, и обычно трехкурующая в печеночную, селезёночную и левую желудочную артерии. В отличие от этого, SMA представляет собой один ствол без печеночных или селезёночных ветвей. Он проникает в корень брыжейки и снабжает ежунум, подвздошную и проксимальную кишку; Отслеживание её пути в брыжейку может помочь подтвердить правильную идентификацию.
5. Определите молочно-белые, похожие на пуповидные пучки, идущие параллельно SMA, как целевые нервные волокна. Нервный пучок, расположенный выше СМА, соответствует парасимпатическим волокнам, тогда как пучок, расположенный ниже СМА, соответствует симпатическим волокнам (рисунок 1A).
6. С помощью микрощипцев и микроножниц очень аккуратно разделяйте жировую и лимфатическую ткань вокруг СМА, чтобы полностью обнажить нервные волокна. Аккуратно поднимите симпатический или парасимпатический нервный пучок микрощипцем, чтобы отделить его от СМА, затем быстро и аккуратно пересеките (см. рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время вскрытия держите кончики щипцов и ножниц ориентированными к боковой стенке артерии и избегайте направления инструментов вертикально в более глубокие плоскости. Если происходит сильное кровотечение (например, кровоизлияние из СМА или брюшной аорты, которое невозможно контролировать стерильным ватным тампоном в течение 30 секунд), процедура немедленно прекращается. Животное гуманно эвтаназируется, находясь ещё под наркозом, и оно исключается из всех последующих анализов. Эта конечная точка заранее определена в соответствии с одобренными IACUC гуманными конечными точками, чтобы предотвратить ненужные страдания. Дополнительные рекомендации по устранению распространённых внутриоперационных осложнений приведены в Дополнительном файле 1.

4. Закрытие брюшной полости

1. Удалите все внутрибрюшные марли/ватные прокладки. Тщательно осмотрите брюшную полость на наличие активных кровотечений, с особым вниманием к полю диссекции СМА, месту пересечения нерва и края брюшной стенки.
2. Аккуратно промыйте брюшинную полость небольшим объёмом тёплого стерильного физиологического раствора (0,5–1,0 мл), затем аккуратно отведите лишнюю жидкость стерильной сухой ватной палочкой.
3. Проведите инструментальный подсчёт марли/ваты, чтобы убедиться, что в брюшной полости не осталось посторонних веществ.
4. Используя впитываемый шов 6-0, закройте брюшинный и мышечный слой непрерывным швом, начиная с одного конца разреза. Каждый укус должен включать брюшину и мышцы брюшной стенки с обеих сторон.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поднимите края раны щипцами и положите каждую петлю под прямую визуализацию, чтобы избежать зацепления подлежащего кишечника или оментума. При необходимости аккуратно отместите кишечник от разреза с помощью увлажненной ватной палочки.
5. Закройте кожу прерванными швами с помощью шва из 5-0 шёлкового невпитывающегося шва. Накладывайте швы с интервалом ~2 мм и завязывайте узлы с умеренным натяжением, приближая (но не удушая) края кожи, чтобы избежать ишемии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плохое расположение раны может привести к разрезной грыже. Убедитесь, что мышечный слой плотно запечатан, а края кожи выровнены.
6. Аккуратно очистите закрытый кожный разрез ещё раз мазком с повидоном и йодом.
7. Отметьте мышь (ухо или хвост) датой операции.
8. Снимите носовой конус и перенесите мышь в чистую, мягкую клетку для восстановления, установленную на подогревающей подкладке при температуре 37 °C (один корпус). Поддерживайте животное в боковом положении, чтобы снизить риск аспирации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что подогревающая площадка остаётся стабильной при 37 °C, чтобы предотвратить гипотермию. При необходимости введите 1 мл тёплого стерильного физиологического раствора подкожно для поддержки объёма.
9. Постоянно наблюдайте за мышью, пока она полностью не придёт в сознание и не сможет самостоятельно оставаться на лёже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Послеоперационная анальгезия продолжалась мелоксикамом (5 мг/кг, подкожно, раз в 24 часа до 48 часов после операции), с дополнительным ветеринарным обследованием при обнаружении признаков постоянной боли или страдания.

5. Параметры послеоперационного мониторинга

ПРИМЕЧАНИЕ: Послеоперационный мониторинг проводился дважды в день в течение первых 72 часов, а затем ежедневно на протяжении всего исследования. Оцениваемые параметры включали:

1. Следите за внешним видом, включая уход, состояние шерсти, осанку и уровень активности.
2. Измеряйте вес тела ежедневно; Определите потерю более 15% предоперационной массы тела в течение 48 часов или 20% за любой 72-часовой период как гуманную конечную точку.
3. Осмотрите место операции на наличие признаков инфекции, расщепления или выделений.
4. Следите за поведением, включая спонтанные движения, реакцию на обращение и признаки стресса (например, вокализация и беспокойство).
5. Оценивайте любое животное, проявляющее стойкие признаки боли или страдания, несмотря на обезболивание ветеринарным персоналом, и, при необходимости, усыпьте животное.

Результаты

Используя SMA как последовательный анатомический ориентир, вегетативные нервные пучки кишечника можно идентифицировать как тонкие жемчужно-белые структуры, идущие параллельно сосуду. Исходя из их анатомического положения относительно SMA, верхний пучок был обозначен как предполагаемый парасимпатический расслоение, а нижний — как предполагаемый симпатический расслоение (рисунок 1A,D). Положительный интраоперационный результат достигается, ког...

Обсуждение

Мышиная СМА возникает из передней стенки брюшной аорты, ниже целиакии, и обеспечивает артериальный приток в основные брюшные внутренности, включая^{кишечник.} Перед СМА расположены толстая кишка и её брыжейка, тогда как сзади она тесно связана с левой почечной веной и брюшной аортой; Верхняя брыжейная вена обычно проходит вдоль её правой стороны. У мышей SMA чрезвычайно хрупка и окружена критически важными органами и крупными сосудами. Важно, что одинаково тонкие сим...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5-0 шёлковая оплетённая нерассосавивающаяся нить	Ethicon	W500
6-0 PGA Шов	Jinhuan	CR631
Камеры для индуцирования анестезии	RWD Life Science	V100
Анестезиологический аппарат для животных	RWD Life Science	R500IP
Анти-холинэстеразна антитело	Abcam	ab181023
Искусственные слёзы, смазка, офтальмологическая мазь	Akorn	59399-162-35
Мыши C57BL/6J	Shanghai Model Organisms CenterTechnology	SM-001
Токсин холеры, подединица B (CTB), конъюгат с Alexa FluorTM 555	Thermo Scientific	C34776
Сложный микроскоп	Yuyan Instruments	512
DAPI и Hoechst нуклеиновые кислоты красители	Invitrogen	D3571
Светло-зелёный	Thermo Scientific	F7252
Тонкие гемостазирующие щипцы	Jinzhong surgical instrument	JCG020
Гипоаллергенная хирургические лейкопластыри	3M Blenderm	70200419342
Изофлуран	RWD Life Science	R510-22-10
Микро щипцы (изогнутые)	Jinzhong surgical instrument	WCC200
Микро щипцы (прямые)	Jinzhong surgical instrument	WCC190
Микро зажимы для игл	Jinzhong surgical instrument	WBA050
Микро ножницы	Jinzhong surgical instrument	Y3F010
Микро шприц	Hamilton	7632-01
Офтальмологические ножницы (с заострённым концом)	Jinzhong surgical instrument	JC2303
Офтальмологические ножницы (с закруглённым концом)	Jinzhong surgical instrument	JC2303
Повидон-йодная ватная палочка	Winner Medical	206
Тканевое фиксирующее средство (4% параформальдегид, PFA)	MedChemExpress	HY-DY3003
Тканевая OCT-среда для заморозки	Sakura	C2077
Тирозиновый гидроксилаза (E2L6M) кроличье моноклональное антитело	Cell Signaling Technology	58844S