Универсальное устройство с нагрузкой под давлением для изображения живых клеток при длительном физиологическом механическом напряжении

Summary

Описанное здесь устройство с нагрузкой под давлением позволяет временно оптическую визуализацию культивированных клеток и совместимо со стандартными контейнерами для культивирования клеток и инвертированными микроскопами. С помощью этого устройства подтверждено, что микроокружение с гидростатическим давлением опухоли усиливает трансдукцию кальциевого сигнала, предоставляя платформу для изучения механической трансдукции сигналов в микросреде опухоли.

Abstract

Этот протокол описывает гидростатическое устройство с нагрузкой под давлением, которое позволяет в реальном времени микроскопическое наблюдение приклеенных клеток во время длительной гидростатической стимуляции давления, и совместимо с коммерческими контейнерами для клеточной культуры диаметром 3,5 см. Аппарат состоит из герметической камеры культуры, изготовленной из алюминиевого основания, оптически прозрачной полиэтилен(метилметакрилатной) крышки, встроенных в крышку газовых входных/выходных портов и герметичного обзорного окна. Подключившись к регулируемому источнику газа, устройство поддерживает стабильное гидростатическое давление (0–200 кПа, регулируемое), при этом обеспечивая непрерывную фазово-контрастную или флуоресцентную визуализацию. С помощью этого устройства с давлением можно зафиксировать эффекты, вызванные давлением, зависящие от дозы на фенотип и поведение клеток, такие как морфология, пролиферация и миграция. Кроме того, флуоресцентные сигналы также могут записываться в реальном времени. Здесь была обнаружена и количественно измерена генеродность и динамика сигнальных сигналов Ca^2⁺ в клетках MDA-MB-231 и клетках рака шейки матки с помощью инвертированной флуоресцентной микроскопии с использованием таймлапс-визуализации. Эта платформа интегрирует механическую нагрузку с живыми клетками для преодоления ограничений традиционных систем конечных точек, предоставляя универсальный инструмент для механобиологических исследований.

Introduction

Многие клетки, ткани и органы испытывают устойчивые или периодические сжимающие силы в рамках своей^{физиологии 1}. Например, альвеолярные клетки подвергаются циклическому давлению во время^{дыхания 2}, тогда как эпителиальные клетки мочевого пузыря подвергаются механической нагрузке при задержании^{мочи 3}. В патологических ситуациях, таких как солидные опухоли, раковые клетки постоянно подвергаются воздействию сжимающих сил, возникающих из-за пространственного удержания и повышенного давления интерстициальной^{жидкости 4}. Аналогично, при других заболеваниях, таких как дегенерация мениска и лёгочный фиброз, клетки^{мениска 5} и альвеолярные^{эпителиальные клетки 6} также подвергаются устойчивым механическим нагрузкам из-за давления, вызванного жёсткостью матрицы.

Появляется всё больше данных, подтверждающих, что механическое давление действует мощным регулятором фенотипа и поведения^{клеток 7,8}. В незлокачественных клетках сжимающий стресс усиливает пролиферацию пародонтальных стволовых клеток и индуцирует слияние остеокластов через инвазивные^{выступы 9}. В то же время в раковых моделях компрессия проявляет эффект януса: она подавляет пролиферацию и миграцию клеток меланомы, одновременно активируя транскриптомическое перепрограммирование, способствующее хеморезистентности^10,11. Кроме того, объёмное сжатие, вызванное гиперосмотическим давлением, может вызывать внутриклеточную скученность и стимулировать перераспределение концентрации белка и ионной силы посредством разделения жидкой фазы (LLPS), что существенно меняет поведение и судьбу клеток. Это физическое возмущение усиливает расширение кишечных органоидов за счёт активированной Wnt/β-катениновой сигнализации и усиленного самообновления кишечных стволовых^{клеток 12}. Кроме того, в ядре клетки LLPS, вызванные изменениями объёма, участвуют в контроле транскрипции генов через координацию инициации, удлинения и завершения^{транскрипции 13,14}.

Для количественного изучения этих биологических эффектов, вызванных давлением, необходимы экспериментальные системы, способные применять чётко определённые и однородные сжимающие стимулы. Для клеток, культивируемых in vitro, окружённых водной средой, гидростатическое давление служит основным и физиологически значимым способом применения таких сжимающих сил, что широко применяется для изучения клеточной механотрансдукции¹⁵. Гидростатическое давление может увеличивать активность щелочной фосфатазы и ускорять остеогенез человеческих мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жира, без добавления остеоиндуктивных^{факторов 16}. При неалкогольной жировой болезни печени механические силы, такие как гидростатическое давление, могут способствовать развитию портальной гипертензии без значительного фиброза, что подчёркивает её роль в разнообразии^{тканей 17}. Хотя гидростатическое давление играет важную роль в патофизиологической регуляции, механистические исследования гидростатического давления сталкиваются с критическим ограничением: обычные камеры давления исключают реальное наблюдение живых клеток во время стимуляции. Большинство экспериментальных систем допускают только анализ конечных точек, маскируя пространственную и временную динамику событий механотрансдукции, таких как активация механо Piezo1, гетерогенность потока Ca²⁺ и реорганизация цитоскелета. Этот разрыв ограничивал понимание того, как гидростатическое давление влияет на разнообразие фенотипов в опухолях и других тканях.

Для устранения этого технологического разрыва была разработана новая экспериментальная платформа, позволяющая в реальном времени наблюдать клеточные реакции на точно контролируемое гидростатическое давление с помощью оптической визуализации. Эта система объединяет три ключевые функции: (1) подаче устойчивого гидростатического давления в диапазоне от 0 до 100 кПа с помощью регулируемого регулятора давления газа (манометр имеет диапазон от 0 до 200 кПа, а прикладываемые давления можно выбирать на основе физиологических параметров). Например, на основе зарегистрированных компрессионных стрессов различных типов клеток: 8–16 кПа для стромальных клеток костного мозга^{человека — 18}, 12–24 кПа — для гладкомышечных клеток^{сосудистых мышц — 19}, и 0–15 кПа — для эпителиальных клеток человеческой^{молочной железы — 20}.); (2) непрерывная съёмка живых элементов с высоким временным разрешением при гидростатическом давлении; и (3) поддержание физиологических культурных условий в ходе длительных экспериментов. Этот подход позволяет напрямую визуализировать динамические процессы, включая набор и активацию каналов Piezo1, кальциевые сигнальные волны и ремоделирование цитоскелета, происходящие в ответ на механическую стимуляцию. Кроме того, это устройство совместимо с большинством коммерчески доступных посевных чаш и инвертированных микроскопов, что делает его очень удобным для использования в лабораториях. Возможность отслеживать эти внутриклеточные биохимические события в реальном времени даёт беспрецедентные знания о том, как клетки воспринимают и адаптируются к гидростатическому давлению. Фиксируя временную последовательность механотрансдукционных событий, включая начальное восприятие силы, последующие сигналы и фенотипические изменения, эта платформа предоставляет мощный инструмент для изучения фундаментальных механизмов, посредством которых гидростатическое давление влияет на поведение клеток в физиологическом и патологическом контексте.

Protocol

1. Материалы

1. Технические характеристики устройства (см. рисунок 1)
   1. Подготовьте компоненты на основе приведённых ниже спецификаций:
      Основание: алюминий (Ø 56 мм, высота 15 мм), центральное окно Ø 40 мм.
      Крышка: PMMA (Ø 56 мм) с: 6 × M3 резьбовыми отверстиями, газовым портом Luer-lock, силиконовой прокладкой (внутренний диаметр 25 мм, внешний диаметр 32 мм, толщина 0,8 мм)
      Регулятор давления: (диапазон 0–200 кПа)
2. Клетки и реагенты
   1. Используйте клетки MDA-MB-231 и HeLa в этом исследовании. Используйте среду L-15, среду RPMI 1640, сыворотку новорождённого телята (NCS), антибиотико-антимикотический раствор с содержанием 1% и кальциевый зонд для культивирования клеток и маркировки^Ca2+.

2. Подготовка устройства

1. Производство
   1. Индивидуальный дизайн — центральный элемент этого исследования. Алюминиевое основание и крышка PMMA выполните точную обработку согласно спецификациям (см. рисунок 1 и дополнительный рисунок 1).
   2. Разрежьте силиконовую прокладку и обработайте её до нужного размера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическая пропускаемость материала PMMA достаточна для стандартной визуализации пропускаемого света. Все компоненты были стерилизуемы и биосовместимы для последующих экспериментов по культивированию клеток. К производственным допускам этой камеры не предъявляются специальные требования (в этом исследовании была установлена допуск ±0,1 мм).
2. Стерилизация
   1. Чтобы стерилизовать основание (алюминие), автоклавуйте её при 121 °C на 20 минут.
   2. Чтобы стерилизовать крышку (PMMA), протрите её 75% этанолом, затем УФ-стерилизуйте 30 минут.
   3. Стерилизуйте силиконовую прокладку, автоклавировав при 121 °C в течение 20 минут.

3. Обработка клеток

1. Культура клеток
   1. Семенные клетки в 35-мм чашках при совпадении 30–70%. Культивировать клетки в течение 24 часов в среде RPMI-1640 или L15 (с добавлением 10% NCS) в инкубаторе_CO2 при 37 °C с 5% CO₂.
   2. Для передачи клеток диссоциировать клетки с помощью 0,25% трипсина и прекратить пищеварение с полной средой. Используйте ячейки для повторного посева, когда они достигнут 70%–80% слияния.
2. Окрашивание Ca²⁺
   1. Снимите среду, затем дважды промойте клетки предварительно подогревшей сбалансированной солью Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) в шкафу для биобезопасности.
   2. Окрашивайте межклеточный Ca²⁺ кальциевым зондом диаметром 5 мкм в безсывороточной среде. Инкубировать клетки в течение 20 минут при 37 °C в защищённой световой среде.
   3. Удалите краситель, трижды промыйте клетки HBSS, а затем деэстерифицируйтесь на 30 минут в безсывороточной среде.

4. Сборка устройства (рисунок 2)

1. Перенесите посевную чашу в центральное окно камеры давления, затем уберите культурную среду.
2. Поместите стерилизованную прокладку в мешок для посевов.
3. Выровняйте крышку над стеком прокладок посуды.
4. Затягивайте винты по диагонали, сначала затягивая вручную до появления сопротивления, затем добавляйте ещё 1,5 оборота с помощью драйвера с управляемым крутящим моментом.
5. Подключите силиконовую газовую трубку к люэровскому порту и впрысните смешанный газ в устройство, чтобы проверить утечки.
6. Отсоедините силиконовую газовую трубку и введите свежую среду в контейнер с клеточной культурой через порт Luer-lock с помощью стерильного шприца объемом 5 мл.

5. Давление и визуализация

1. Подключите силиконовую газовую трубку (внутренний диаметр 4 мм) от люэр-локера на силиконовой прокладке к цифровому манометру и бензобаку.
2. Установите собранное устройство на стадии микроскопа.
3. Откалибруйте давление.
   1. Проверьте стабильность диапазона 0–200 кПа с помощью датчика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования клеток HeLa используется смешанный газ, содержащий 75% азота, 20% кислорода и 5% углекислого газа. Для культуры клеток MDA-MB-231 используется смешанный газ, содержащий 80% азота и 20% кислорода. Тип газа, используемый в эксперименте с нагрузкой под давлением, может быть заменён в зависимости от типа ячейки, среды или специфических экспериментальных требований. Ни один компонент не является специфичным для модели, и размеры модуля для определения давления и его впускной трубки могут быть выбраны по мере необходимости.
4. Установите целевое давление (например, 100 кПа) с помощью цифрового регулятора давления.
5. Инициируйте визуализацию после достижения целевого давления.
6. Визуализация
   1. Отрегулируйте ступень, подтвердите область изображения и убедитесь, что клетки находятся в фокусе.
   2. Получить флуоресцентные изображения окрашенных клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа с объективом 20× с такими параметрами: время экспозиции 400 мс, интервалы таймлапса 5 с и общая продолжительность изображения 10 мин (фильтр FTC: Ex/Em = 490/525 нм, срез = 515 нм).
   3. Сделайте изображение в условиях без давления в течение 10 минут для обеспечения правильной работы системы и получения базовых данных сигнала.
   4. После открытия газового клапана для нагрузочного давления перенастройте высоту ступени, чтобы ячейки были в фокусе, затем начните визуализацию динамических кальциевых сигналов.
   5. Выбирайте объективную линзу, исходя из нижней толщины посевной чаши и рабочего расстояния объектива. Выберите время экспозиции, используемое для мониторинга колебаний кальциевого сигнала, при этом избегая чрезмерного фотоотбеливания и фотоповреждения.
   6. Корректируйте параметры в зависимости от типа зонда и экспериментальных требований при наблюдении других динамических сигналов.

6. Устранение неполадок

1. Обратитесь к Таблице 1 для советов по устранению неполадок.

7. Статистический анализ

1. Представить все данные как среднее ± стандартное отклонение (SD). Программное обеспечение GraphPad Prism (США) использовалось для сравнения результатов между двумя группами с помощью t-теста непарного студента. Рассматривайте различия как статистически значимые, когда **p < 0,01, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001.

Results

Для подтверждения функции визуализации в реальном времени этого устройства с гидростатическим давлением наблюдалась динамика кальциевых сигналов в опухолевых клетках после применения гидростатического давления. Слияние клеток MDA-MB-231, HeLa и A549 были засеяны в 35-мм культурные чаши для последующего использования. После окрашивания кальциевым зондом культивированные клетки подвергались гидростатическому давлению 40 кПа. После 10 минут гидростатической нагрузки общий уровень кальция в ...

Discussion

Этот протокол демонстрировал универсально адаптируемое устройство с нагрузкой давления, позволяющее в реальном времени наблюдать динамику механотрансдукции при настраиваемом гидростатическом давлении. Интегрируя оптически прозрачную крышку PMMA с высокоточно обработанной алюминиевой основой, система преодолевает критические ограничения обычных камер, которые могут выполнять только анализ конечных точек. Это устройство с нагрузкой под давлением, работающее со стандартным инвертированным м...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Антибиотик-антимикотик (100 раз)	Thermo Fisher Scientific, США	15140122	Концентрация 1% в полной среде
Автоклав	Panasonic, Япония	MLS-3751-PC	Для стерилизации алюминиевого основания и силиконовой прокладки
Кабинет биобезопасности	Thermo Fisher Scientific, США	1300 серии A2 класса II, биологические шкафы типа A2	Обеспечивает стерильную среду для работы с клетками
Cal-520 AM, индикатор кальция, проявляющегося в клетках	AAT Bioquest, США	21131	Для динамического обнаружения концентрации ионов кальция в живых клетках
Клетка для культивирования (35 мм)	BIOFIL, Китай	TCD010035	Стандартная 35-мм антенна, используемая для посевных ячеек
Основание камеры (алюминиевый)	Цюаньи, Китай	/	Индивидуальный дизайн и Oslash; 56 мм, H 15 мм, центральное окно и Oslash; 40 мм
Крышка камеры (PMMA)	Цюаньи,   Китай	/	Индивидуальный дизайн и Oslash; 56 мм, с 6 и раз; Резьбовые отверстия M3, газовый порт Luer-lock
CO2 Инкубатор	Thermo Fisher Scientific, США	HERAcell 3111	Поддерживает культурные условия на уровне 37°; C с 5% CO2
HBSS (Сбалансированный сольный раствор Хэнкса)	Бейотим, Китай	C0219	Для промывания клеток до и после окрашивания
Клеточная линия HeLa	Центр клеточных ресурсов, Институт фундаментальных медицинских наук, CAMS/PUMC, Китай	CRM-CCL-2	Раковые клетки шейки матки у человека
Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Nikon, Япония	Eclipse Ti2	Для флуоресцентной визуализации
L-15 Medium Лейбовица	Thermo Fisher Scientific, США	41300039	Для клеточной культуры MDA-MB-231
Клеточная линия MDA-MB-231	Центр клеточных ресурсов, Институт фундаментальных медицинских наук, CAMS/PUMC, Китай	CRM-HTB-26	Клетки рака молочной железы у человека
Сыворотка для новорождённых телят (NCS)	Thermo Fisher Scientific, США	16010142	10% концентрация в полной среде
Регулятор давления	Хунжун, Китай	DP20	Дальность: 0-200 кПа
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific, США	31800022	Для клеточной культуры MDA-MB-231
Стерильный шприц (5 мл)	KDL, Китай	1101010198	Для впрыска среды или реагентов через люэровский шлюз
Трипсин (0,25%)	Thermo Fisher Scientific, США	2520056	Для диссоциации приклеенных клеток для передачи